Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

Os autores reconhecem a assistência técnica do INM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milão, Itália), em particular C. Cordiglieri, para assistência durante imagens 3D multicolor DNA FISH Aquisição. Este trabalho tem sido apoiado pelas seguintes subvenções ao B.B.: Programa principal italiano epigen, Associação Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) e Giovani Ricercatori, Ministério da Saúde italiano (GR-2011-02349383). Este trabalho tem sido apoiado pela seguinte concessão ao F.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, bolsa nR 2018-0321).

1. Procedimentos de preparação e rotulagem de sondas de DNA com tradução de nick
<ol><li>Cromossomos artificiais bacterianos purificados e limpos (BACs), plasmídeos ou produtos PCR com kits específicos (Tabela de Materiais),resuspendem no ddH2O, verifiquem por eletroforese em gel de agarose e quantificar.</li>
	<li>Realize a tradução de nick em 1,5-2 μg de DNA a partir da etapa 1.1 em um volume final de 50 μL misturando todos os reagentes em um tubo de DNA de baixa ligação de 0,5...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

O método atual descreve um protocolo passo a passo para executar peixes de DNA multicoloridos 3D em uma ampla gama de células primárias humanas. Embora o DNA FISH seja uma tecnologia em grande uso, o Peixe de DNA multicolorido 3D em núcleos interfásicos 3D preservados ainda é difícil de executar em muitos laboratórios, principalmente devido às características das amostras utilizadas23,24.
A tradução de nick de sonda é um p...

Os eucalitos mais altos precisam condensar sistematicamente e compactar uma enorme quantidade de informações genéticas no espaço 3D do núcleo1,2,3,4. Hoje, sabemos que o genoma é espacialmente encomendado em compartimentos e domínios topologicamente associados5 e que os múltiplos níveis de dobramento de DNA geram contatos entre diferentes regiões genômicas que podem envolver a formação de loop de cromromatina6,7. O looping dinâmico 3D da cromromatina pode influenciar muitos processos biológicos diferentes, como transcrição8,9, diferenciação e desenvolvimento10,11, reparação de DNA12,13, enquanto suas perturbações estão envolvidas em várias doenças14,15,16 e defeitos de desenvolvimento15,17,18.
Muitas abordagens foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma 3D. Tecnologias baseadas em conformação cromossa (c-technologies, 3C, 4C, 5C, Hi-C e derivados) foram desenvolvidas para estudar a organização do genoma em células fixas3,4,19,20. Tais abordagens baseiam-se na capacidade de capturar as frequências de contato entre loci genômico na proximidade física. C-tecnologias, dependendo de sua complexidade, capturam a organização global do genoma 3D e a topologia nuclear de uma população celular3,4,19,20. No entanto, as interações 3D são dinâmicas no tempo e no espaço, altamente variáveis entre células individuais que consistem em interações multiplex, e são extensivamente heterogênitas21,22.
Fluorescência de DNA multicolor 3D na hibridização situ (FISH) é uma técnica que permite a visualização de loci genômico específico em um único nível celular, permitindo a investigação direta da arquitetura nuclear 3D de forma complementar às tecnologias C. Representa uma tecnologia atualmente usada para validar inequivocamente os resultados C. O DNA FISH 3D multicolor usa sondas com rótulo fluorescente complementares aos loci genômicos de interesses. O uso de diferentes fluoroforóres e equipamentos adequados de microscopia permitem a visualização contemporânea de múltiplos alvos dentro do espaço nuclear23,24. Nos últimos anos, o FISH tem sido combinado com os avanços tecnológicos na microscopia para obter a visualização de estruturas em escala fina em alta resolução25,26 ou com abordagens CRISPR-Cas para a visualização dos ácidos nucleicos em imagens vivas27,28. Apesar da ampla adoção, a abordagem 3D multicolor DNA FISH ainda é considerada difícil em muitos laboratórios porque o material biológico utilizado deve ser adaptado.
Aqui, fornecemos um protocolo abrangente para peixes de DNA multicoloridos 3D (da preparação celular/sonda à análise de dados) aplicável a uma ampla gama de células primárias humanas, permitindo a visualização de múltiplos loci genômicos e preservando a estrutura 3D de núcleos. Para estudar a arquitetura nuclear, a estrutura 3D dos núcleos deve ser preservada. Por essa razão, contrastando com outros protocolos existentes29,30,31, evitamos o uso de um gradiente de álcool e o armazenamento dos comprovantes de cobertura no álcool que podem afetar a estrutura de cromatina32. O método é adaptado a partir de protocolos de Peixe sna 3D preservados24,33 a serem aplicados a uma ampla gama de células primárias humanas, tanto ex vivo isoladas quanto cultizadas in vitro. Existem parâmetros de permeabilização e desproteína para diferentes características citológicas e citológicas nucleares (por exemplo, diferentes graus de compactação nuclear, abundância de citoesqueleto)34. Esses parâmetros são geralmente descritos em outros protocolos24,33, sem fornecer uma clara discriminação do procedimento dentro de diferentes tipos de células. Além disso, desenvolvemos uma ferramenta específica chamada NuCLεD (localizador de contatos nucleares em 3D)16, fornecendo princípios para análise de dados que melhorarão a proximidade 3D entre diferentes loci e sua distribuição topológica nuclear dentro do espaço nuclear de forma automatizada.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

Uma questão importante na biologia celular é a organização genômica dentro do espaço nuclear e como a arquitetura da cromatina pode influenciar processos como expressão genética, identidade celular e diferenciação. Muitas abordagens desenvolvidas para estudar a arquitetura 3D do genoma podem ser divididas em duas categorias complementares: tecnologias baseadas em captura de conformação cromossa (C-technologies) e imagem. Enquanto o primeiro é baseado na captura da conformação cromossomo e interações de DNA proximal em uma população de células fixas, este último, baseado na fluorescência de DNA na hibridização situ (FISH) em núcleos preservados em 3D, permite a visualização contemporânea de loci múltiplo em um único nível celular (multicolor), examinando suas interações e distribuição dentro do núcleo (3D multicolor DNA FISH). A técnica do DNA 3D multicolor FISH tem uma limitação de visualizar apenas alguns loci pré-determinados, não permitindo uma análise abrangente da arquitetura nuclear. No entanto, dada a robustez de seus resultados, o DNA FISH multicolorido 3D em combinação com microscopia 3D e reconstrução de imagens é um método possível para validar resultados baseados em tecnologia C e estudar inequivocamente a posição e organização de loci específico em um único nível celular. Aqui, propomos um método passo a passo de Peixe sna multicolorido 3D adequado para uma ampla gama de células primárias humanas e discutimos todas as ações práticas, passos cruciais, noções de imagem 3D e análise de dados necessárias para obter uma multicolor 3D bem sucedida e informativa Peixe de DNA em diferentes contextos biológicos.

O método de DNA 3D multicolorido FISH descrito neste artigo permite a visualização contemporânea de diferentes loci genômicos dentro de núcleos 3D preservados (Figura 1B). Este protocolo permite a medição de distâncias entre alelos, e diferentes loci genômicos para avaliar sua proximidade espacial, e avaliar sua localização dentro do espaço nuclear (por exemplo, a distância loci do centroide ou da periferia dos núcleos)16. No entanto, e...

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3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

O DNA 3D multicolor FISH representa uma ferramenta para visualizar loci múltiplogenômico dentro de núcleos preservados em 3D, definindo inequivocamente suas interações recíprocas e localização dentro do espaço nuclear em um único nível celular. Aqui, um protocolo passo a passo é descrito para um amplo espectro de células primárias humanas.

Ferramenta de peixe de DNA Multicolor 3D para estudar arquitetura nuclear em células primárias humanas

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

O PEM de DNA multicolorido 3D permite a visualização de múltiplos loci genômicos dentro de núcleos preservados para definir ambíguamente sua interação recíproca e localização a nível único celular. O PEIXE DE DNA multicolor 3D permite a investigação direta da arquitetura nuclear. Em geral, funciona em conjunto com tecnologias baseadas em captura de cromossomo, tornando a técnica uma ferramenta disponível para validação de dados C dentro de células únicas.O procedimento será Federica Marasca. Ela é pós-doutora no meu laboratório. Comece incubando a mistura de tradução nick em uma batedeira térmica a 16 graus Celsius de acordo com o comprimento do material de DNA inicial.No final da incubação, verifique o tamanho das sondas em um gel de 2,2%. Para cada experimento de PEIXE DE DNA, precipitar a quantidade apropriada de sonda de acordo com o material de DNA inicial do qual as sondas foram produzidas em 150 microliters de água dupla destilada, 20 microgramas de DNA de espermatozoide de salmão sem rótulo, 3,5 microgramas de espécies específicas de DNA Cot-1, três volumes de 100% etanol, e um volume de 1/10 de três acetato de sódio molar por uma hora a menos 80 graus Celsius. No final da incubação, centrifugar a amostra em velocidade máxima por uma hora a quatro graus Celsius.Depois de descartar o supernascer, lave a pelota duas vezes com 500 microliters de 70% de etanol. Após a segunda lavagem, resuspenque a pelota em dois microlitadores de 100% formamida e agite a sonda por 30 minutos a 40 graus Celsius antes de adicionar um volume igual de citrato de sódio salino de 4X em sulfato de 20% dextran. Para a fixação pré-tratamento e permeabilização de pequenas células com núcleos pequenos e uma baixa quantidade de citoplasma, primeiro adicione duas vezes 10 às sextas células em 200 microliters de PBS diretamente em tampas de vidro em poços individuais de uma placa de 24 poços e permita que as células se acomodem por 30 minutos à temperatura ambiente.Ao final da incubação, substitua rapidamente o PBS por 300 microliters de 4%de paraformaldeído recém-preparado complementado com 0,1%Tween 20. Após 10 minutos, lave as células fixas três vezes em 300 microliters de 0,05% TPBS por cinco minutos por lavagem em temperatura ambiente. Após a última lavagem, permeabilize as células T com 300 microliters de 0,5% TPBS por 10 minutos em temperatura ambiente antes de tratar as células com 250 microliters por poço de coquetel RNAse diluído 1:100 em PBS por uma hora a 37 graus Celsius.No final da incubação, enxágüe as células em 300 microliters de PBS e adicione 300 microlitrais de 20% de glicerol em PBS a cada poço com uma incubação noturna a quatro graus Celsius. Na manhã seguinte, coloque o vidro em gelo seco por 15 a 30 segundos para congelar as células antes de gradualmente descongelar as amostras à temperatura ambiente e encharcá-las em 300 microlitrais de 20% de glicerol na PBS por 30 segundos. Após congelar/descongelar as células mais três vezes como apenas demonstrado, lave as amostras em 300 microliters de 0,5% TPBS por cinco minutos à temperatura ambiente, seguido por duas lavagens em 300 microliters de 0,05% TPBS por cinco minutos por lavagem à temperatura ambiente.Após a última lavagem, trate as células com 300 microlitres de ácido clorídrico normal de 0,1 por 12 minutos em temperatura ambiente, seguido por duas enxágues em 300 microliters de citrato de sódio salino. Em seguida, fixar as amostras durante a noite em 300 microliters de 50% de formamida em 2X citrato de sódio salino a temperatura ambiente. Para a fixação, pré-tratamento e permeabilização de células grandes com alta quantidade de citoplasma, correção, pré-tratamento e permeabiliza as células de forma semelhante à demonstrada para células T primárias humanas e tratar as amostras com 300 microlitres de 0,0025% pepsina em 0,01 ácido clorídrico normal por alguns segundos até cinco minutos.Observe as células sob um microscópio óptico e pare a reação com duas lavagens de cinco minutos em 300 microlitros de 50 milônios cloreto de magnésio assim que os núcleos estiverem livres do citoplasma, mas os nucleoli ainda estão visíveis e intactos. Para o 3D multicolor DNA FISH, desnaturar as sondas de hibridização a 80 graus Celsius por cinco minutos e colocar imediatamente as sondas no gelo. Carregue as sondas em um slide de microscópio limpo e coloque uma mancha de células em cada gota da sonda.Sele as bordas da tampa com cimento de borracha. Quando o cimento secar completamente, desnatura as amostras em um bloco de aquecimento de 75 graus Celsius. Após quatro minutos, higmite as amostras a 37 graus Celsius durante a noite em uma caixa metálica flutuando em um banho de água.Na manhã seguinte, retire o cimento de borracha e com os slides imersos em citrate de sódio salino 2X cuidadosamente decole as tampas. Coloque cada deslizamento em poços individuais de uma placa de seis poços contendo dois mililitros de citrato de sódio salino fresco por poço para duas lavagens de cinco minutos a 37 graus Celsius com agitação a 90 revoluções por minuto. Ao final da incubação, enxágue as tampas brevemente em dois mililitros de 0,2% Tween 20 em citrato de sódio salino 4X.Para detecção de PEIXEs de DNA multicolores 3D, transfira as tampas para poços individuais de uma nova placa de 24 poços e bloqueie qualquer ligação inespecífica em 300 microliters de tampão de bloqueio por 20 minutos a 37 graus Celsius e 20 revoluções por minuto. Ao final da incubação, trate as amostras com a concentração adequada de anti-digoxigenina e/ou streptavidina diluída em tampão de bloqueio por 35 minutos em uma câmara escura e úmida a 37 graus Celsius. Ao final da incubação, transfira as amostras para poços individuais de uma placa de seis poços e lave as amostras três vezes em dois mililitros de 0,2%Tween 20 e 4X soro fisiológico citrato por cinco minutos por lavagem com agitação a 90 revoluções por minuto.Após a última lavagem, equilibre as amostras em dois mililitros de PBS antes de transferir os deslizamentos para uma nova placa de 24 poços para pós-fixação em 300 microliters de 2% de formaldeído em PBS por poço por dois minutos à temperatura ambiente. Lave as células fixas cinco vezes brevemente em 300 microliters de PBS, seguida de coloração com DAPI diluída a um nanograma por mililitro em 300 microlitres de PBS por cinco minutos à temperatura ambiente. Lave as tampas mais cinco vezes em PBS e monte as amostras com um meio de montagem apropriado.Em seguida, adquira imagens 3D com um sistema de microscópio. O PEM DE DNA multicolorido 3D permite a visualização contemporânea de diferentes loci genômicos dentro de núcleos 3D preservados. Para a preparação da sonda de DNA, um tamanho de sonda de menos de 200 pares de base garante um procedimento bem sucedido de PEIXE DE DNA multicolorido 3D.Sondas de PEM de DNA subótidas produzidas pela tradução de nick podem ser parcial ou super digeridas. As sondas sobre digeridas resultarão em um sinal inespecífico devido à perda de especificidade na hibridização e a um consequente aumento do fundo. Para linfócitos T primários humanos e pequenas células com núcleos pequenos e uma baixa quantidade de citoplasma, recomenda-se um tratamento normal de ácido clorídrico de 12 minutos 0,1 para promover a acessibilidade dos núcleos às sondas de DNA e preservar a integridade nuclear.A digestão citoplasmática da pepsina não é necessária para obter um bom sinal de DNA FISH em pequenas células. Para os míbios primários humanos e células que têm núcleos grandes e citoplasma abundante, no entanto, o passo da pepsinização é fundamental. Uma pepsinização de citoesqueleto curto e subótimo dificultará a entrada da sonda nos núcleos que terminam na ausência de um sinal de DNA FISH.No entanto, se as células forem supere pepsinizadas, os núcleos não permanecerão intactos perdendo sua estrutura 3D. Um BEM sucedido PEM DE DNA multicolorido 3D resultará na presença de sinal dentro dos núcleos. Sugiro trabalhar com material biológico fresco, testar sondas antes de realizar o PEIXE de DNA multicolor 3D, preparar novas soluções e ser preciso com os tempos de incubação e as temperaturas.Lembre-se que a formamida e o HCL são substâncias perigosas e devem ser sempre usados em uma capa de fumaça química com materiais descartáveis apropriados.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genética

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engenharia de fatores artificiais para manipular Especificamente splicing alternativo em células humanas

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation para estudar na Vivo respostas celulares ao dano de DNA simples e complexos

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Telas de um híbrido levedura melhorada para identificar o fator de transcrição, vinculando a sequências de DNA humano

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus variável-número tandem-repita a análise do peixe-patogénico bactéria Yersinia ruckeri pela PCR multiplex e pela electroforese capilar

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navegando no MARRVEL, uma ferramenta Web que integra informações da genômica humana e genética de organismos modelo

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Estudo funcional in vivo de variantes humanas raras associadas à doença usando Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Caracterização da diferenciação in vitro dos queratinócitos primários humanos pela análise do RNA-Seq

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...