Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

Авторы признают техническую помощь INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Ромео эд Энрика Инверници" (INGM), Милан, Италия), в частности C. Cordiglieri, за помощь в 3D многоцветных изображений ДНК FISH Приобретение. Эта работа была поддержана следующими грантами Для B.B.: EPIGEN Итальянский флагман программы, Ассоциация Франсез contre les Myopathies (AFM-Telethon, грант nr 18754) и Джовани Ricercatori, Министерство здравоохранения Италии (GR-2011-02349383). Эта работа была поддержана следующим грантом Ф.М.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, грант nr 2018-0321).

1. Подготовка зонда дна и процедуры маркировки с переводом nick
<ol><li>Очистите и очистите и очистите бактериальные искусственные хромосомы (BACs), плазмиды или продукты ПЦР с конкретными комплектами(Таблица материалов),resuspend в ddH2O, проверить электрофорусна на гель агарозы и ко...

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

Текущий метод описывает пошагу протокол для выполнения 3D многоцветной ДНК FISH на широком диапазоне первичных клеток человека. Хотя ДНК FISH является технологией широкого использования, 3D многоцветная ДНК FISH на сохранившихся 3D межфазных ядрах по-прежнему трудно выполнить во многих лабор?...

Высшие эукариоты должны систематически конденсировать и уплотнять огромное количество генетической информации в минуту 3D пространство ядра1,2,3,4. Сегодня мы знаем, что геном пространственно упорядочен в отсеках и топологически связанных областях5 и что несколько уровней сворачивания ДНК генерируют контакты между различными геномными регионами, которые могут включать образование хроматиновых циклов6,7. 3D динамическая петля хроматина может влиять на многие различные биологические процессы, такие как транскрипция8,9,дифференциация и развитие10,11,репарация ДНК12,13, в то время как его возмущения участвуют в различных заболеваниях14,15,16 и дефекты развития15,17,18.
Для изучения организации 3D генома было разработано множество подходов. Хромосомы конформации захвата на основе технологий (C-технологии, 3C, 4C, 5C, Hi-C и производных) были разработаны для изучения организации генома в фиксированных клетках3,4,19,20. Такие подходы основаны на способности захватывать контактные частоты между геномными локусами в физической близости. C-технологии, в зависимости от их сложности, ловят глобальную организацию 3D генома и ядерную топологию популяции клеток3,4,19,20. Тем не менее, 3D взаимодействия являются динамическими во времени и пространстве, весьма изменчивы между отдельными клетками, состоящими из мультиплексных взаимодействий, и широко неоднородны21,22.
3D многоцветная флуоресценция ДНК на месте гибридизации (FISH) является методом, который позволяет визуализации конкретных геномных локусов на уровне одной клетки, что позволяет прямое исследование 3D ядерной архитектуры в дополнение к C-технологий. Он представляет собой технологию, используемую в настоящее время для однозначной проверки C-результатов. 3D многоцветная ДНК FISH использует флуоресцентно маркированные зонды, дополняющие геномные локусовы интересов. Использование различных фторофоров и подходящего микроскопионного оборудования позволяет современную визуализацию нескольких целей в ядерном пространстве23,24. В последние годы FISH был объединен с технологическими достижениями в микроскопии, чтобы получить визуализацию мелкомасштабных структур с высоким разрешением25,26 или с CRISPR-Cas подходы для визуализации нуклеиновых кислот в живой визуализации27,28. Несмотря на широкое внедрение, 3D многоцветный подход DNA FISH по-прежнему считается сложным во многих лабораториях, поскольку используемый биологический материал должен быть адаптирован.
Здесь мы предоставляем всеобъемлющий протокол для 3D многоцветной ДНК FISH (от подготовки клеток/зонда до анализа данных), применимый к широкому кругу первичных клеток человека, что позволяет визуализировать несколько геномных локусов и сохранять 3D-структуру ядер. Для изучения ядерной архитектуры необходимо сохранить трехдернскую структуру ядер. По этой причине, в отличие от других существующих протоколов29,30,31, мы избегаем использования градиента алкоголя и хранения крышки в спирте, которые могут повлиять на структуру хроматина32. Метод адаптирован из сохранившихся 3D-протоколов ДНК FISH24,33, которые будут применяться к широкому кругу первичных клеток человека, как изолированных ex vivo, так и культивируемых in vitro. Существуют параметры пермяки и депротеинации для различных ядерных морфологии и цитологических характеристик (например, разной степени ядерного уплотнения, цитоскелет изобилие)34. Эти параметры часто обычно описаны в других протоколах24,33, без предоставления четкой дискриминации процедуры в различных типах клеток. Кроме того, мы разработали специальный инструмент под названием NuCL'D (ядерный локатор контактов в 3D)16, обеспечивая принципы анализа данных, которые улучшат 3D близость между различными локусами и их ядерное топологическое распределение в ядерном пространстве в автоматизированном режиме.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

Важным вопросом в клеточной биологии является геномная организация в ядерном пространстве и то, как архитектура хроматина может влиять на такие процессы, как экспрессия генов, клеточная идентичность и дифференциация. Многие подходы, разработанные для изучения 3D-архитектуры генома, можно разделить на две взаимодополняющие категории: технологии захвата хромосомы (C-технологии) и визуализации. В то время как первый основан на захвате хромосомы конформации и проксимальных взаимодействий ДНК в популяции фиксированных клеток, последний, основанный на флуоресценции ДНК на месте гибридизации (FISH) на 3D-сохраненных ядер, позволяет современную визуализацию несколько локусов на уровне одной клетки (многоцветный), изучая их взаимодействия и распределение внутри ядра (3D многоцветная ДНК FISH). Техника 3D многоцветной ДНК FISH имеет ограничение визуализации лишь нескольких предопределенных локусов, не позволяя всесторонний анализ ядерной архитектуры. Однако, учитывая надежность его результатов, 3D многоцветная ДНК FISH в сочетании с 3D-микроскопией и реконструкцией изображения является возможным методом проверки результатов на основе C-технологий и однозначного изучения положения и организации конкретных локусов на уровне одной ячейки. Здесь мы предлагаем шаг за шагом метод 3D многоцветной ДНК FISH подходит для широкого спектра основных клеток человека и обсуждаем все практические действия, важные шаги, понятия 3D-изображения и анализа данных, необходимых для получения успешного и информативного 3D многоцветного ДНК FISH в различных биологических контекстах.

Метод 3D многоцветной ДНК FISH, описанный в данной статье, позволяет современную визуализацию различных геномных локусов в сохранившихся 3D ядрах(рисунок 1B). Этот протокол позволяет измерять расстояния между аллелями, и различные геномные loci для того чтобы оценит?...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D многоцветная ДНК FISH представляет собой инструмент для визуализации нескольких геномных локусов в 3D сохранившихся ядрах, однозначно определяя их взаимные взаимодействия и локализацию в ядерном пространстве на уровне одной клетки. Здесь описывается протокол шаг за шагом для широкого спектра первичных клеток человека.

3D Многоцветный инструмент ДНК FISH для изучения ядерной архитектуры в первичных клетках человека

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D многоцветная ДНК FISH позволяет визуализировать множественные геномные локусы внутри сохранившихся ядер, чтобы неоднозначно определить их взаимное взаимодействие и локализацию на уровне одной клетки. 3D многоцветная ДНК FISH позволяет непосредственно изучат ядерную архитектуру. Как правило, он работает в сочетании с технологиями захвата хромосом, что делает метод доступным инструментом для проверки данных C в пределах отдельных клеток.Демонстрацией процедуры будет Федерика Мараска. Она постдок в моей лаборатории. Начните с инкубации смеси ник перевода в тепловой смеситель при 16 градусов по Цельсию в зависимости от длины исходного материала ДНК.В конце инкубации проверьте размер зондов на 2,2%агарозного геля. Для каждого эксперимента DNA FISH, осадок соответствующее количество зонда в соответствии со стартовым материалом ДНК, из которого зонды были произведены в 150 микролитров двойной дистиллированной воды, 20 микрограммов неолицеприятных ДНК спермы лосося, 3,5 микрограмма видов конкретных Cot-1 ДНК, три тома 100% этанола, и 1/10 объем трех молира ацета натрия в течение одного часа при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В конце инкубации центрифуга образца на максимальной скорости в течение одного часа при четырех градусах по Цельсию.После отказа от супернатанта, мыть гранулы два раза с 500 микролитров 70% этанола. После второй стирки, повторно гранулы в двух микролитров 100%formamide и встряхнуть зонд в течение 30 минут при 40 градусах по Цельсию, прежде чем добавить равный объем 4X солевого соляного цитрата в 20%dextran сульфат. Для фиксации предварительной обработки и пермеабилизации мелких клеток с небольшими ядрами и небольшим количеством цитоплазмы, сначала добавьте два раза 10 к шестым клеткам в 200 микролитров PBS непосредственно на стеклянные крышки в отдельных колодцах 24-хорошо пластины и позволяют клеткам осесть в течение 30 минут при комнатной температуре.В конце инкубации, быстро заменить PBS с 300 микролитров свежеприготовленных 4%paraformaldehyde дополнен 0,1%Tween 20. Через 10 минут мыть фиксированные клетки три раза в 300 микролитров 0,05%TPBS в течение пяти минут на стирку при комнатной температуре. После последней стирки, permeabilize Т-клеток с 300 микролитров 0,5%TPBS в течение 10 минут при комнатной температуре перед лечением клеток с 250 микролитров на колодец RNAse коктейль разбавленной 1:100 в PBS в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию.В конце инкубации, промыть клетки в 300 микролитров PBS и добавить 300 микролитров 20%глицерол в PBS к каждому хорошо с ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро поместите стекло на сухой лед на 15-30 секунд, чтобы заморозить клетки, прежде чем постепенно оттаивать образцы при комнатной температуре и замачивать их в 300 микролитров 20%глицерол в PBS в течение 30 секунд. После замораживания/ оттаивания клеток еще в три раза, как только что продемонстрировано, мыть образцы в 300 микролитров 0,5%TPBS в течение пяти минут при комнатной температуре, а затем две моет в 300 микролитров 0,05%TPBS в течение пяти минут на стирку при комнатной температуре.После последней стирки обработать клетки 300 микролитров 0,1 нормальной соляной кислоты в течение 12 минут при комнатной температуре, а затем два полоскания в 300 микролитров солевого цитрата натрия. Затем исправить образцы на ночь в 300 микролитров 50%формамида в 2X солевой цитрат натрия при комнатной температуре. Для фиксации, предварительного лечения и проницаемки больших клеток с большим количеством цитоплазмы, исправить, предварительно лечить и проницать клетки так же, как попродемонстрировано для человека первичных Т-клеток и лечения образцов с 300 микролитров 0,0025%пепсин в 0,01 нормальной соляной кислоты в течение нескольких секунд до пяти минут.Наблюдайте за клетками под оптическим микроскопом и остановите реакцию двумя пятиминутными мойки в 300 микролитров 50 миллимолярный хлорид магния, как только ядра свободны от цитоплазмы, но нуклеолы все еще видны и нетронутыми. Для 3D многоцветной ДНК FISH, денатурации гибридизации зондов при 80 градусов по Цельсию в течение пяти минут и сразу же разместить зонды на льду. Загрузите зонды на чистый слайд микроскопа и поместите одну крышку клеток на каждую каплю зонда.Печать края крышки с резиновым цементом. Когда цемент полностью высохнет, денатурировать образцы на 75 градусов по Цельсию нагревательного блока. Через четыре минуты, гидрогидридизировать образцы при 37 градусов по Цельсию ночь в металлической коробке плавающей в водяной бане.На следующее утро, снять резиновый цемент и со слайдами погружается в 2X солевой цитрат натрия тщательно снять крышки. Поместите каждый coverslip в отдельных скважин из шести скважин пластины, содержащей два миллилитров свежего солевого цитрата натрия на скважину в течение двух пяти минут моет при 37 градусов по Цельсию с встряхивания на 90 оборотов в минуту. В конце инкубации, промыть coverslips кратко в двух миллилитров 0,2%Tween 20 в 4X солевой цитрат натрия.Для обнаружения 3D-многоцветной ДНК FISH перенесите крышки в отдельные скважины новой пластины из 24 скважин и блокируйте любые неспецифические привязки в 300 микролитров блокирующего буфера в течение 20 минут при 37 градусах Цельсия и 20 революциях в минуту. В конце инкубации обработать образцы с соответствующей концентрацией анти-дигоксигенина и/или стрептавидина, разбавленного блокирующим буфером в течение 35 минут в темной и влажной камере при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации перенесите образцы в отдельные скважины из шести скважин пластины и мыть образцы три раза в двух миллилитров 0,2%Tween 20 и 4X солевой цитрат натрия в течение пяти минут за стирку с тряской на 90 оборотов в минуту.После последней стирки, equilibrate образцов в двух миллилитров PBS перед передачей coverslips на новый 24-хорошо пластины для пост-фиксации в 300 микролитров 2%формальдегида в PBS в хорошо в течение двух минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные клетки пять раз кратко в 300 микролитров PBS, а затем окрашивание с DAPI разбавленной на один нанограмм на миллилитр в 300 микролитров PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Вымойте крышки еще пять раз в PBS и смонтировать образцы с соответствующей крепления среды.Затем приобретайте 3D-изображения с помощью микроскопной системы. 3D многоцветная ДНК FISH позволяет современную визуализацию различных геномных локусов в сохранившихся 3D ядрах. Для подготовки ДНК-зонда размер зонда менее 200 базовых пар обеспечивает успешную 3D многоцветную процедуру FISH ДНК.Неоптимальные зонды ДНК FISH, производимые переводом ника, могут быть частично или переварены. Переваренные зонды приведут к неспецифическому сигналу из-за потери специфичности в гибридизации и последующего увеличения фона. Для человека первичных Т-лимфоцитов и небольших клеток с небольшими ядрами и небольшим количеством цитоплазмы, 12-минутный 0,1 нормального лечения соляной кислоты рекомендуется содействовать нуклей доступности ДНК зондов и сохранить ядерную целостность.Цитоплазмическое пищеварение пепсин не требуется для получения ДНК FISH хороший сигнал в небольших клетках. Для человека первичных миобластов и клеток, которые имеют большие ядра и обильные цитоплазмы, однако, шаг пепсинизации имеет основополагающее значение. Короткая и неоптимальная цитоскелетная пепсинизация будет препятствовать проникновению зонда в ядра, заканчивающийся при отсутствии сигнала ДНК FISH.Однако, если клетки чрезмерно пепсинизированы, ядра не останутся нетронутыми, теряя свою 3D структуру. Успешная 3D многоцветная ДНК FISH приведет к присутствию сигнала внутри ядер. Предлагаю работать со свежим биологическим материалом, тестировать зонды перед выполнением 3D многоцветной ДНК FISH, готовить свежие растворы и быть точным со временем инкубации и температурой.Помните, что формамид и HCL являются опасными веществами и всегда должны использоваться в химическом дымовом капоте с соответствующими одноразовыми материалами.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Инженерной искусственных факторов в частности Манипулирование альтернативного сплайсинга в клетках человека

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Лазерная Microirradiation учиться в Vivo клеточных реакций на повреждение ДНК простых и сложных

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Иммуноокрашивания для модификации ДНК: Вычислительный анализ конфокальный изображений

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay с низкой митохондриальной ДНК загрязнения от первичного человека CD4 + Т-лимфоцитов

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Мульти-локус переменный номер Тандем-повтор Анализ рыбы-патогенной бактерии Yersinia ruckeri по multiplex PCR и Капиллярэлектрорез

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Навигация MARRVEL, веб-инструмент, который интегрирует геномику человека и модель генетики организма информации

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

В Vivo Функциональное исследование связанных с болезнями редких человеческих вариантов с использованием дрозофилы

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Характеристика в пробирке Дифференциация первичных кератиноцитов человека с помощью анализа РНК-Сек

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...