Name: 3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells
Uploaded: 2020-01-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

Författarna erkänner det tekniska biståndet av INGM Imaging Facility (Istituto Nazionale di Genetica Molecolare "Romeo ed Enrica Invernizzi" (INGM), Milano, Italien), särskilt C. Cordiglieri, för hjälp under 3D multicolor DNA FISH bilder Förvärv. Detta arbete har stötts av följande bidrag till B.B.: EPIGEN italienska flaggskeppsprogram, Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon, grant nr 18754) och Giovani Ricercatori, italienska hälsoministeriet (GR-2011-02349383). Detta arbete har fått stöd av följande bidrag till M.M.: Fondazione Cariplo (Bando Giovani, grant nr 2018-0321).

1. Förfaranden och märkning av DNA-sond med nicköversättning
<ol><li>Rena och rena bakteriella konstgjorda kromosomer (BACs), plasmider eller PCR-produkter med specifika satser (Materialförteckning), omfördelning i ddH2O, kontrollera genom elektrofores på en agarosgel och kvantifiering.</li>
	<li>Utför nicköversättning på 1,5−2 μg DNA från steg 1.1 i en slutlig volym på 50 μL genom att blanda alla reagenser i ett 0,5 ml lågbindande DNA-rör enligt tabell 1....

<ol>
	<li>Cremer, T., Cremer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories,+nuclear+architecture+and+gene+regulation+in+mammalian+cells.">Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells.</a> Nature Reviews: Genetics. 2 (4), 292-301 (2001).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nature Reviews: Genetics. 17 (12), 772 (2016).</li><li>van Steensel, B., Furlong, E. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+transcription+in+shaping+the+spatial+organization+of+the+genome.">The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 20 (6), 327-337 (2019).</li><li>Rajarajan, P., Gil, S. E., Brennand, K. J., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+genome+organization+and+cognition.">Spatial genome organization and cognition.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 17 (11), 681-691 (2016).</li><li>Pombo, A., Dillon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+genome+architecture:+players+and+mechanisms.">Three-dimensional genome architecture: players and mechanisms.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 16 (4), 245-257 (2015).</li><li>Fanucchi, S., Shibayama, Y., Burd, S., Weinberg, M. S., Mhlanga, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+contact+permits+transcription+between+coregulated+genes.">Chromosomal contact permits transcription between coregulated genes.</a> Cell. 155 (3), 606-620 (2013).</li><li>Therizols, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+decondensation+is+sufficient+to+alter+nuclear+organization+in+embryonic+stem+cells.">Chromatin decondensation is sufficient to alter nuclear organization in embryonic stem cells.</a> Science. 346 (6214), 1238-1242 (2014).</li><li>Gonzalez-Sandoval, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinuclear+Anchoring+of+H3K9-Methylated+Chromatin+Stabilizes+Induced+Cell+Fate+in+C.+elegans+Embryos.">Perinuclear Anchoring of H3K9-Methylated Chromatin Stabilizes Induced Cell Fate in C. elegans Embryos.</a> Cell. 163 (6), 1333-1347 (2015).</li><li>Hubner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+nuclear+landscapes+during+human+myelopoietic+cell+differentiation+maintains+co-aligned+active+and+inactive+nuclear+compartments.">Remodeling of nuclear landscapes during human myelopoietic cell differentiation maintains co-aligned active and inactive nuclear compartments.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 47 (2015).</li><li>Aymard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+long-range+contacts+unveils+clustering+of+DNA+double-strand+breaks+at+damaged+active+genes.">Genome-wide mapping of long-range contacts unveils clustering of DNA double-strand breaks at damaged active genes.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 24 (4), 353-361 (2017).</li><li>Sellou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+poly(ADP-ribose)-dependent+chromatin+remodeler+Alc1+induces+local+chromatin+relaxation+upon+DNA+damage.">The poly(ADP-ribose)-dependent chromatin remodeler Alc1 induces local chromatin relaxation upon DNA damage.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (24), 3791-3799 (2016).</li><li>Krijger, P. H., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Lupianez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+TADs:+How+Alterations+of+Chromatin+Domains+Result+in+Disease.">Breaking TADs: How Alterations of Chromatin Domains Result in Disease.</a> Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).</li><li>Cortesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4q-D4Z4+chromatin+architecture+regulates+the+transcription+of+muscle+atrophic+genes+in+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy.">4q-D4Z4 chromatin architecture regulates the transcription of muscle atrophic genes in facioscapulohumeral muscular dystrophy.</a> Genome Research. 29 (6), 883-895 (2019).</li><li>Woltering, J. M., Noordermeer, D., Leleu, M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+and+divergence+of+regulatory+strategies+at+Hox+Loci+and+the+origin+of+tetrapod+digits.">Conservation and divergence of regulatory strategies at Hox Loci and the origin of tetrapod digits.</a> PLoS Biology. 12 (1), 1001773 (2014).</li><li>Woltering, J. M., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrapod+axial+evolution+and+developmental+constraints;+Empirical+underpinning+by+a+mouse+model.">Tetrapod axial evolution and developmental constraints; Empirical underpinning by a mouse model.</a> Mechanisms of Development. 138, 64-72 (2015).</li><li>de Laat, W., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3C-based+technologies+to+study+the+shape+of+the+genome.">3C-based technologies to study the shape of the genome.</a> Methods. 58 (3), 189-191 (2012).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Finn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+Heterogeneity+and+Intrinsic+Variation+in+Spatial+Genome+Organization.">Extensive Heterogeneity and Intrinsic Variation in Spatial Genome Organization.</a> Cell. 176 (6), 1502-1515 (2019).</li><li>Zheng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+chromatin+interactions+with+single-molecule+precision.">Multiplex chromatin interactions with single-molecule precision.</a> Nature. 566 (7745), 558-562 (2019).</li><li>Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+on+tissue+cryosections.">Fluorescence in situ hybridization (FISH) on tissue cryosections.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 71-82 (2010).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 205-239 (2008).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+three-dimensional+localization+microscopy+across+large+volumes.">High-density three-dimensional localization microscopy across large volumes.</a> Nature Methods. 13 (4), 359-365 (2016).</li><li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT.">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+genomic+loci+in+living+human+cells+by+an+optimized+CRISPR/Cas+system.">Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system.</a> Cell. 155 (7), 1479-1491 (2013).</li><li>Nelles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmable+RNA+Tracking+in+Live+Cells+with+CRISPR/Cas9.">Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9.</a> Cell. 165 (2), 488-496 (2016).</li><li>Byron, M., Hall, L. L., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+FISH+approach+to+study+endogenous+RNAs+and+DNAs+in+native+nuclear+and+cell+structures.">A multifaceted FISH approach to study endogenous RNAs and DNAs in native nuclear and cell structures.</a> Current Protocol of Human Genetics. , 15 (2013).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods in Molecular Biology. 463, 297-308 (2008).</li><li>Takizawa, T., Gudla, P. R., Guo, L., Lockett, S., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+nuclear+positioning+of+the+monoallelically+expressed+astrocyte+marker+GFAP.">Allele-specific nuclear positioning of the monoallelically expressed astrocyte marker GFAP.</a> Genes &amp; Development. 22 (4), 489-498 (2008).</li><li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures.">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 12 (5), 1011-1028 (2017).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods in Molecular Biology. 659, 117-126 (2010).</li><li>Skinner, B. M., Johnson, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+morphologies:+their+diversity+and+functional+relevance.">Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance.</a> Chromosoma. 126 (2), 195-212 (2017).</li><li>Schoenfelder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pluripotent+regulatory+circuitry+connecting+promoters+to+their+long-range+interacting+elements.">The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements.</a> Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).</li><li>Lubeck, E., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+systems+biology+by+super-resolution+imaging+and+combinatorial+labeling.">Single-cell systems biology by super-resolution imaging and combinatorial labeling.</a> Nature Methods. 9 (7), 743-748 (2012).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+super-resolution+imaging+of+chromosomes+and+in+situ+haplotype+visualization+using+Oligopaint+FISH+probes.">Single-molecule super-resolution imaging of chromosomes and in situ haplotype visualization using Oligopaint FISH probes.</a> Nature Communication. 6, 7147 (2015).</li><li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (52), 21301-21306 (2012).</li><li>Samacoits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computational+framework+to+study+sub-cellular+RNA+localization.">A computational framework to study sub-cellular RNA localization.</a> Nature Communication. 9 (1), 4584 (2018).</li><li>Cardozo Gizzi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy-Based+Chromosome+Conformation+Capture+Enables+Simultaneous+Visualization+of+Genome+Organization+and+Transcription+in+Intact+Organisms.">Microscopy-Based Chromosome Conformation Capture Enables Simultaneous Visualization of Genome Organization and Transcription in Intact Organisms.</a> Molecular Cell. 74 (1), 212-222 (2019).</li><li>Mateo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+DNA+folding+and+RNA+in+embryos+at+single-cell+resolution.">Visualizing DNA folding and RNA in embryos at single-cell resolution.</a> Nature. 568 (7750), 49-54 (2019).</li><li>Nir, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Walking+along+chromosomes+with+super-resolution+imaging,+contact+maps,+and+integrative+modeling.">Walking along chromosomes with super-resolution imaging, contact maps, and integrative modeling.</a> PLoS Genetics. 14 (12), 1007872 (2018).</li><li>Bintu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+chromatin+tracing+reveals+domains+and+cooperative+interactions+in+single+cells.">Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells.</a> Science. 362 (6413), (2018).</li></ol>

Den nuvarande metoden beskriver ett steg för steg protokoll för att utföra 3D multicolor DNA FISH på ett brett spektrum av mänskliga primära celler. Även om DNA FISH är en teknik i stor användning, 3D multicolor DNA FISH på konserverad 3D interfas kärnor är fortfarande svårt att utföra i många laboratorier, främst på grund av egenskaperna hos de prover som används23,24.
Sond nick översättning är ett grundläggande ...

Högre eukaryoter måste systematiskt kondensera och komprimera en enorm mängd genetisk information i minuten 3D-rymden av kärnan1,2,3,4. Idag vet vi att genomet är rumsligt beställt i fack och topologiskt associerade domäner5 och att de många nivåerna av DNA-vikning generera kontakter mellan olika genomiska regioner som kan innebära kromatin loop formation6,7. Den dynamiska 3D-loopning av kromatin kan påverka många olika biologiska processer såsom transkription8,9, differentiering och utveckling10,11 , DNA reparation12,13, medan dess störning är inblandade i olika sjukdomar14,15,16 och utvecklingsdefekter15,17,18.
Många metoder har utvecklats för att studera 3D-genomorganisationen. Kromosomkonformation capture-baserad teknik (C-teknik, 3C, 4C, 5C, Hi-C och derivat) har utvecklats för att studera genomorganisation i fasta celler3,4,19,20. Sådana metoder bygger på förmågan att fånga kontaktfrekvenserna mellan genomisk loci i fysisk närhet. C-teknik, beroende på deras komplexitet, fånga den globala 3D-genomorganisationen och kärntopologi av en cellpopulation3,4,19,20. Ändå är 3D-interaktioner dynamiska i tid och rum, mycket varierande mellan enskilda celler som består av multiplexinteraktioner och är i stor utsträckning heterogena21,22.
3D multicolor DNA fluorescens in situ hybridisering (FISH) är en teknik som möjliggör visualisering av specifika genomiska lokus på en enda cell nivå, vilket möjliggör direkt undersökning av 3D nukleär arkitektur på ett kompletterande sätt till C-teknik. Det representerar en teknik som för närvarande används för att entydigt validera C-resultat. 3D multicolor DNA FISH använder fluorescerande märkta sonder som kompletterar den genomiska loci av intressen. Användningen av olika fluoroforer och lämplig mikroskopiutrustning möjliggör modern visualisering av flera mål inom kärnområdet23,24. Under de senaste åren har FISH kombinerats med tekniska framsteg inom mikroskopi för att få visualisering av finskaliga strukturer med hög upplösning25,26 eller med CRISPR-Cas metoder för visualisering av nukleinsyror i levande bildbehandling27,28. Trots bred användning anses 3D multicolor DNA FISH-metoden fortfarande vara svår i många laboratorier eftersom det biologiska material som används måste anpassas.
Här tillhandahåller vi ett omfattande protokoll för 3D multicolor DNA FISH (från cell / sond förberedelse till dataanalys) gäller för ett brett spektrum av mänskliga primära celler, vilket möjliggör visualisering av flera genomiska loci och bevara 3D-strukturen av kärnor. För att studera kärnarkitektur måste kärnkärnans 3D-struktur bevaras. Av denna anledning, kontrasterande från andra befintliga protokoll29,30,31,undviker vi användning av en alkoholgradient och lagring av täckslips i alkohol som kan påverka kromatin struktur32. Metoden är anpassad från konserverade 3D DNA FISH protokoll24,33 som skall tillämpas på ett brett spektrum av mänskliga primära celler, både isolerade ex vivo eller odlade in vitro. Det finns permeabiliserings- och deproteiniseringsparametrar för olika nukleärmorfologi och cytologiska egenskaper (t.ex. olika grader av kärnpackning, cytoskelettförekomst)34. Dessa parametrar beskrivs ofta allmänt i andra protokoll24,33, utan att ge en tydlig diskriminering av förfarandet inom olika celltyper. Dessutom utvecklade vi ett specifikt verktyg som heter NuCLεD (nukleära kontakter locator i 3D)16, som ger principer för dataanalys som kommer att förbättra 3D-närheten mellan olika lokoch deras nukleära topologiska distribution inom kärnområdet på ett automatiserat sätt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>142475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>140675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin 488</td>
			<td>DBA</td>
			<td>DI7488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin 11 d-UTP</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA (bovine serum albumine)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverlsips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>117500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CY3 d-UTP</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>PA53022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>D21490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonucleic acids single strand from salmon testes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D7656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran sulfate (powder)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-203917A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin 11 d-UTP</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11093088910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21969-035 500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA polymerase I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18010-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>AMPD1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (C-G-A-T)</td>
			<td>Euroclone</td>
			<td>BL0423A/C/G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E9644.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>02860-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS Hyclone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-25mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutammine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-024 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Cot-1 DNA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15279-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin Human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278-5 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, 3 M)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (phosphate-buffered saline)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pennycillin/Streptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15070-063 100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhasePrep BAC DNA Kit</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NA0100-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Gel Extraction &#38; PCR Purification Combo Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K220001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K210010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubbercement</td>
			<td>Bostik</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidina Alexa fluor 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tri-Sodium Citrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1110379026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d multicolor dna fish tool to study nuclear architecture in human primary cells

En viktig fråga inom cellbiologi är genomisk organisation inom kärnområdet och hur kromatinarkitekturen kan påverka processer som genuttryck, cellidentitet och differentiering. Många metoder som utvecklats för att studera 3D-arkitekturen i genomet kan delas in i två kompletterande kategorier: kromosomkonformation fånga baserad teknik (C-teknik) och avbildning. Medan den förstnämnda bygger på att fånga kromosomkonformisering och proximala DNA-interaktioner i en population av fasta celler, möjliggör den senare, baserad på DNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) på 3D-konserverad kärnor, samtida visualisering av flera lokpå en enda cellnivå (multicolor), undersöka deras interaktioner och distribution inom kärnan (3D multicolor DNA FISH). Tekniken för 3D multicolor DNA FISH har en begränsning av att visualisera endast ett fåtal förutbestämda lok, inte tillåter en omfattande analys av kärnarkitekturen. Med tanke på robustheten i dess resultat är 3D multicolor DNA FISH i kombination med 3D-mikroskopi och bildrekonstruktion en möjlig metod för att validera C-teknikbaserade resultat och att entydigt studera position och organisation av specifika loki på en enda cellnivå. Här föreslår vi en steg för steg metod för 3D multicolor DNA FISH lämplig för ett brett spektrum av mänskliga primära celler och diskutera alla praktiska åtgärder, avgörande steg, föreställningar om 3D-bildframställning och dataanalys som behövs för att få en framgångsrik och informativ 3D multicolor DNA FISH i olika biologiska sammanhang.

Metoden för 3D multicolor DNA FISH beskrivs i denna artikel tillåter samtida visualisering av olika genomiska loci inom konserverad 3D-kärnor(figur 1B). Detta protokoll tillåter mätning av avstånd mellan alllerar och olika genomisk lokus för att utvärdera deras rumsliga närhet och att bedöma deras läge inom kärnområdet (t.ex. lokavstånd från centroid eller periferin av kärnorna)16. Det finns dock många viktiga steg som måste ställas...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells at JoVE.com

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D multicolor DNA FISH representerar ett verktyg för att visualisera flera genomiska loci inom 3D bevarade kärnor, entydigt definiera deras ömsesidiga interaktioner och lokalisering inom kärnområdet på en enda cell nivå. Här beskrivs ett steg för steg protokoll för ett brett spektrum av mänskliga primära celler.

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells 3D

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

3D multicolor DNA FISH möjliggör visualisering av flera genomiska lokus inom bevarade kärnor att tvetydigt definiera deras ömsesidiga interaktion och lokalisering på encellsnivå. 3D multicolor DNA FISK tillåter direkt undersökning av den nukleära arkitekturen. I allmänhet fungerar det tillsammans med kromosom capture-baserade tekniker vilket gör tekniken ett tillgängligt verktyg för C-datavalidering inom enstaka celler.Att demonstrera proceduren blir Federica Marasca. Hon är postdoc i mitt laboratorium. Börja med att inkubera nick översättningsmixen i en termisk mixer vid 16 grader Celsius enligt längden på utgångs-DNA-materialet.Kontrollera vid slutet av inkubationen storleken på sonderna på en 2,2%agarosgel. För varje DNA FISH-experiment, fäll ut lämplig mängd sond enligt det utgångs-DNA-material från vilket sonderna producerades i 150 mikroliter av dubbelt destillerat vatten, 20 mikrogram omärkt laxsperma-DNA, 3,5 mikrogram av artspecifikt Cot-1-DNA, tre volymer av 100%etanol och en 1/10:e volym av tre molartriumacetat i en timme vid minus 80 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen centrifugerar provet vid högsta hastighet under en timme vid fyra grader Celsius.Efter att du har kasserat supernatanten ska pelleten tvättas två gånger med 500 mikroliter 70%etanol. Efter den andra tvätten, resuspend pelleten i två mikroliter av 100%formamid och skaka sonden i 30 minuter vid 40 grader Celsius innan du lägger till en lika stor volym av 4X saltlösning natriumcitrat i 20%dextran sulfat. För fixering förbehandling och permeabilisering av små celler med små kärnor och en låg mängd cytoplasma, först lägga till två gånger 10 till de sjätte cellerna i 200 mikroliter av PBS direkt på glasslips i enskilda brunnar av en 24-brunnsplatta och låta cellerna att bosätta sig i 30 minuter vid rumstemperatur.I slutet av inkubationen, byt snabbt ut PBS med 300 mikroliter av nyberedda 4%paraformaldehyd kompletterad med 0,1%Tween 20. Efter 10 minuter, tvätta de fasta cellerna tre gånger i 300 mikroliter på 0,05%TPBS i fem minuter per tvätt vid rumstemperatur. Efter den sista tvätten, permeabilize T-cellerna med 300 mikroliter av 0,5%TPBS i 10 minuter vid rumstemperatur innan du behandlar cellerna med 250 mikroliter per brunn av RNAse cocktail utspädd 1:100 i PBS i en timme vid 37 grader Celsius.Vid slutet av inkubationen skölj cellerna i 300 mikroliter pbs och tillsätt 300 mikroliter av 20%glycerol i PBS till varje brunn med en övernattning inkubation vid fyra grader Celsius. Nästa morgon, placera glaset på torris i 15 till 30 sekunder för att frysa cellerna innan gradvis tina proverna vid rumstemperatur och blötläggning dem i 300 mikroliter av 20%glycerol i PBS i 30 sekunder. Efter frysning/upptining av cellerna ytterligare tre gånger som just visats, tvätta proverna i 300 mikroliter på 0,5%TPBS i fem minuter vid rumstemperatur, följt av två tvättar i 300 mikroliter på 0,05%TPBS i fem minuter per tvätt i rumstemperatur.Efter den sista tvätten, behandla cellerna med 300 mikroliter av 0,1 normal saltsyra i 12 minuter vid rumstemperatur, följt av två sköljningar i 300 mikroliter saltlösning natriumcitrat. Fixera sedan proverna över natten i 300 mikroliter av 50%formamid i 2X saltlösning natriumcitrat vid rumstemperatur. För fixering, förbehandling och permeabilisering av stora celler med en hög mängd cytoplasman, fixera, förbehandla och permeabilisera cellerna på samma sätt som visats för humana primära T-celler och behandla proverna med 300 mikroliter på 0,0025%pepsin i 0,01 normal saltsyra i några sekunder upp till fem minuter.Observera cellerna under ett optiskt mikroskop och stoppa reaktionen med två femminuterstvättar i 300 mikroliter på 50 millimolar magnesiumklorid så snart kärnorna är fria från cytoplasman men nukleolerna är fortfarande synliga och intakta. För 3D multicolor DNA FISH, denaturera hybridiseringssonderna vid 80 grader Celsius i fem minuter och omedelbart placera sonderna på is. Ladda sonderna på en ren mikroskop glida och placera en coverslip av celler på varje droppe av sonden.Täta täckkanterna med gummicement. När cementen har torkat helt, denaturera proverna på en 75 grader Celsius värmeblock. Efter fyra minuter, hydridize proverna på 37 grader Celsius över natten i en metallisk låda flyter i ett vattenbad.Nästa morgon, skala av gummicement och med diabilder nedsänkt i 2X saltlösning natriumcitrat försiktigt lyfta bort täcken. Placera varje täckkol i enskilda brunnar av en sex-brunnsplatta som innehåller två milliliter färsk saltlösning natriumcitrat per brunn för två fem minuters tvättar vid 37 grader Celsius med skakningar på 90 varv per minut. I slutet av inkubationen sköljer du täcklinerna kort i två milliliter på 0,2%Tween 20 i 4X saltlösningsnatriumcitrat.För 3D multicolor DNA FISH upptäckt, överföra täcken till enskilda brunnar av en ny 24-brunnsplatta och blockera alla ospecifika bindning i 300 mikroliter av blockerande buffert i 20 minuter vid 37 grader Celsius och 20 varv per minut. Vid slutet av inkubationen behandlar du proverna med lämplig koncentration av anti-digoxigenin och/eller streptavidin utspädd i blockerande buffert i 35 minuter i en mörk och våt kammare vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen överför du proverna till enskilda brunnar av en sex-brunnsplatta och tvätta proverna tre gånger i två milliliter på 0,2%Tween 20 och 4X saltlösningsnatriumcitrat i fem minuter per tvätt med skakningar vid 90 varv per minut.Efter den sista tvätten, jämvikt proverna i två milliliter PBS innan de överför täckskop till en ny 24-brunnsplatta för efterfastställelse i 300 mikroliter av 2%formaldehyd i PBS per brunn under två minuter vid rumstemperatur. Tvätta de fasta cellerna fem gånger kort i 300 mikroliter PBS, följt av färgning med DAPI utspädd vid ett nanogram per milliliter i 300 mikroliter PBS i fem minuter vid rumstemperatur. Tvätta täcken ytterligare fem gånger i PBS och montera proverna med ett lämpligt monteringsmedium.Sedan förvärva 3D-bilder med ett mikroskop system. 3D multicolor DNA FISH tillåter samtida visualisering av olika genomisk lokus inom bevarade 3D-kärnor. För DNA-sondberedning säkerställer en sondstorlek på mindre än 200 baspar ett framgångsrikt 3D multicolor DNA FISH-förfarande.Suboptimala DNA FISH-sonder som produceras av nick översättning kan vara delvis eller över rötas. Över smälta sonder kommer att resultera i en ospecifik signal på grund av en förlust av specificitet i hybridisering och en därav följande ökning av bakgrunden. För humana primära T-lymfocyter och små celler med små kärnor och en låg mängd cytoplasman rekommenderas en 12-minuters 0,1 normal saltsyrabehandling för att främja atomkärnorstillgänglighet till DNA-sonderna och för att bevara kärnintegriteten.Cytoplasmatisk pepsin matsmältningen behövs inte för att få en DNA FISH bra signal i små celler. För mänskliga primära myoblaster och celler som har stora kärnor och riklig cytoplasma, dock pepsinisering steget är grundläggande. En kort och suboptimal cytoskelett pepsinization kommer att hämma inträdet av sonden i kärnorna slutar i avsaknad av en DNA FISH signal.Men om cellerna är över pepsinized, kommer atomkärnorna inte förbli intakt förlora sin 3D-struktur. En framgångsrik 3D multicolor DNA FISH kommer att resultera i närvaro av signal inom atomkärnor. Jag föreslår att arbeta med färskt biologiskt material, testa sonder innan du utför 3D multicolor DNA FISH, förbereda färska lösningar och vara exakt med inkubationstider och temperaturer.Kom ihåg att formamid och HCL är farliga ämnen och alltid ska användas i en kemisk rökhuv med lämpliga engångsmaterial.

Research

JoVE Journal

Genetics

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Engineering Artificiella Faktorer att specifikt Manipulera alternativ splitsning i humana celler

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

Laser Microirradiation att studera In Vivo cellulära svar till enkla och komplexa DNA-skador

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq Assay med låg Mitokondrie-DNA kontaminering från primära humana CD4 + T-lymfocyter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Förbättrad jäst en-hybrid skärmar att identifiera transkriptionsfaktor som binder till humant DNA sekvenser

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-Locus variabel-antal tandem-upprepa analys av den fisk-patogena bakterien yersinia ruckeri av MULTIPLEX PCR och kapillärelektrofores

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Navigera i MARRVEL, ett webbaserat verktyg som integrerar Human Genomics och Modellorganismens gen etik information

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In vivo funktionell studie av sjukdomsassocierade sällsynta humana varianter med hjälp av Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

Karakterisering av In Vitro Differentiering av mänskliga primära keratinocyter genom RNA-Seq Analys

Human primary keratinocytes are often used as in vitro models for studies on epidermal differentiation and related diseases. Methods have been reported ...