Name: measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00
Duration: 6 min 55 s
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我们感谢国家卫生研究院的赠款：R01CA195077-01A1 （NW）、R01CA200919-01 （NW） 和 1R01 CA218008-01A1 （NW）。我们还确认国防部为 NW 提供资金 W81XWH1910480 和 W81XWH-18-1-0069。

1. NK细胞和肝肿瘤细胞培养基的制备
<ol><li>使用人类自然杀伤细胞（如NK92MI）和人类肝癌细胞系（如SK-HEP-1）。</li>
	<li>通过在500 mL的最小必需基质Eagle alpha中加入以下成分，将以下成分添加到无核苷和脱氧核苷的NK细胞培养基，以制备NK92MI人类NK细胞培养基，最终浓度为：0.02 mM叶酸（100 μL的100m叶酸），0.2m M肌苷醇（500μL，200 m M肌酸） 索西醇，0.1 mM β-梅卡托乙醇（3.5 μL 的 14.3 M β-梅卡托乙醇），2 mM L-谷氨酰胺（5 mL 的 200 mM L-谷氨酰胺），1% 青霉素/链霉素 （5 mL 100x 青霉素/链霉素）， 12.5% 胎儿牛血清（FBS）和12.5%的马血清。使用 0.22 μm 无菌过滤装置混合和过滤消毒，并储存在 4°C。</li>
	<li>通过在含2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbeco的改性鹰培养基（DMEM）中加入10%的FBS和1%的青霉素/链霉素，制备肝肿瘤细胞系SK-HEP-1培养基。</li>
</ol>2. 基于NK细胞介导的角质LDH测量分析
<ol><li>在CO2培养箱中，在37°C的5%CO2中，在100毫米细胞培养培养培养皿中，将SK-HEP-1细胞生长至70-80%的汇合。在CO2培养箱中，在37°C下，在37°C下，先用5mL的1倍磷酸缓冲盐水（PBS）进行孵化，然后孵育1mL的0.25%胰蛋白酶-EDTA，在CO2培养箱中产生5%的胰蛋白酶-EDTA，直到产生单个细胞悬浮液。 注：由于癌细胞中NK细胞激活配体表达的变化，NK细胞活性可由强调的癌细胞诱导。因此，健康和亚结对癌细胞应该用于准确的结果。同样重要的是要注意，NK细胞受体和配体对胰蛋白酶化26，27敏感。因此，应仔细优化胰蛋白酶化方案，避免过度的胰蛋白酶化。</li>
	<li>试化后，在15mL无菌锥形离心管中加入10 mL的SK-HEP-1培养基和160 x g的离心机3分钟。用 5 mL 的 1x PBS 清洗细胞颗粒，并在 5 mL 培养基中重新悬浮。</li>
	<li>同时，在15 mL无菌离心管中，以160 x g将NK92MI细胞离心3分钟。用 5 mL 的 1x PBS 清洗细胞颗粒，并在 5 mL 的 NK92MI 细胞培养培养基中重新悬浮。 注：NK92MI细胞在NK细胞培养基培养中生长，获得与步骤2.1中所述的情况相似。</li>
	<li>使用血细胞计或任何可用的自动细胞计数器对 SK-HEP-1 和 NK92MI 细胞进行计数。</li>
	<li>在 96 孔板的三联孔中，将 SK-HEP-1 细胞（靶细胞）（1 x 104/100 μL/孔）和 NK92MI 细胞（效应细胞）（1 x 105/100 μL/孔）的比例添加 1：10 靶向：效应器和种子。</li>
	<li>在95%空气和5%CO2的大气中在37°C下孵育96孔板3小时。孵育后，在室温下以450 x g为5分钟。</li>
	<li>在不干扰细胞颗粒的情况下，从每个孔中收集100 μL的上清液，并转移到新的96孔板中。</li>
	<li>加入50μL的LDH基板，混合均匀，在黑暗中室温下孵育板20分钟。</li>
	<li>在pH4.7下加入50μL的停止溶液（50%二甲基甲酰胺和20%硫酸钠），停止反应。立即使用板读取器测量 490 nm 和 680 nm 的板的吸光度。</li>
	<li>从 490 nm 处的吸光度中减去 680 nm 处的吸光度。计算百分比 （%）使用以下公式的 NK 细胞毒性。 <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> 其中LDH实验（效应器+靶细胞）是NK92MI细胞和SK-HEP-1细胞的吸收，LDH效应细胞是NK92MI细胞的吸收，LDH自发性是SK-HEP-1细胞的吸收，LDH最大是SK-HEP-1的吸收具有莱沙缓冲液的细胞。 注：为减少血清干扰，请始终使用以下控制：单独使用靶细胞（SK-HEP-1）、仅发生力细胞（NK92MI）、具有莱沙缓冲液作为完整莱沙控制的目标细胞、靶细胞培养基、NK92MI培养基以及靶细胞培养基和NK92MI 介质，比例为 1：1。</li>
</ol>3. 钙素AM染色基显微方法，用于测量NK细胞介导细胞毒性
<ol><li>培养SK-HEP-1细胞至70~80%的汇合。通过第一个洗涤细胞，5mL为1xPBS，然后孵育1mL，0.25%胰蛋白酶-EDTA，生成单细胞悬浮液。</li>
	<li>在160 x g的1mL无菌离心管中将SK-HEP-1细胞离心SK-HEP-1细胞在160 x g下，3分钟，将颗粒重新悬浮在3 mL的无血清DMEM中。</li>
	<li>在SK-HEP-1细胞中加入1.5μL的钙素AM溶液（10 mM），并在室温下孵育30分钟。在15 mL无菌离心管中，在160 x g下，用160 x g标记的离心钙素AM标记的细胞3分钟。</li>
	<li>用 5 mL 的 1x PBS 洗涤细胞两次，以去除多余的钙素 AM 染料。</li>
	<li>同时，在15 mL无菌离心管中，以160 x g的离心机NK92MI细胞3分钟。用 5 mL 的 1x PBS 清洗一次细胞颗粒，并在 5 mL 的 NK92MI 细胞培养基中重新悬浮。</li>
	<li>使用血细胞计或自动细胞计数器计数卡塞因 AM 标记的 SK-HEP-1 细胞和 NK92MI 细胞。</li>
	<li>在1 x105细胞/mL和NK92MI细胞在NK细胞培养基中重新悬浮1 x 106细胞/mL的培养基中的SK-HEP-1细胞。</li>
	<li>板卡辛 AM 标记 SK-HEP-1 细胞 （目标细胞） （1 x 104/100 μL/孔） 与 NK92MI 细胞 （效应细胞） （1 x 105/10 0 μL/孔） （1：10 靶靶：效应器比） 在 96 孔板的三井井中每井 1：10 目标：效应器比）。</li>
	<li>在95%空气和5%CO2的大气中在37°C下孵育96孔板4小时。孵育后，使用荧光显微镜以10倍放大率拍摄钙素AM标记细胞的荧光图像。为每个治疗条件捕获每个复制的至少 10 个不同的字段。</li>
	<li>随机为每个复制选择10个图像，并计算使用NK92MI细胞或不孵化的钙精AM阳性标记靶细胞。使用以下公式计算细胞毒性百分比。 <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> 注： 作为对照，使用没有 NK92MI 细胞的目标细胞和完全分片的目标细胞作为完全的分管控制。对于完全解毒，在 0.5% Triton X-100 中孵育细胞 1 小时（20 μL 的 5% Triton X-100 在 200 μL 培养培养素中）。</li>
</ol>4. NK细胞迁移测定
<ol><li>在15 mL无菌离心管中，以160 x g在160 x g下生长NK92MI细胞和离心机细胞3分钟。</li>
	<li>用5 mL的1x PBS洗涤细胞颗粒两次，并在3 mL的无血清NK92MI细胞培养基中重新悬浮细胞。使用血细胞计或自动细胞计数器计数 NK92MI 细胞。</li>
	<li>在透孔室的上腔室（直径为 6.5 mm 的插入和 5 μm 孔径）中板的 NK92MI 电池（2.5 x 105个单元/100 μL/孔）。</li>
	<li>在底部腔室中加入0.6 mL的无血清介质，含有NK细胞化学吸引剂特性（例如，条件介质、化学素、细胞因子）的材料。 注：在制备条件培养基时，使用不添加血清的减血清培养基，以消除迁移测定中血清蛋白的干扰。</li>
	<li>在37°C下孵育24个可透水井室4小时。4小时后，从底部腔室收集非粘附和迁移的NK92MI细胞，并将其转移到荧光活性细胞分拣（FACS）管中，以便进一步分析。 注：培养时间可能因目标细胞的类型以及目标细胞产生的化学基因的量和动力学而异。因此，这一次应该根据经验确定每个细胞类型，化学素和实验。</li>
	<li>在体积为 50 μL 的体积内，向包含迁移的 NK 细胞的每个管中添加预先确定的流量细胞测定计数珠数。使用任何能够自动计算FACS的流式细胞仪，评估300μL/孔细胞悬浮液的体积。 注：每次使用前，将流量细胞学的计数珠混合或涡旋混合，以确保使用恒定的珠数来最小化实验变异性。建议使用计数珠子进行反向移液，以保持精度。作为 FACS 分析控件，仅使用 NK 细胞和计数珠进行流式细胞测定。作者建议阅读至少10，000个珠子——NK细胞，这个量效果很好。但是，此数字可能因实验条件而异。因此，应根据每种实验类型的经验确定珠子和 NK 细胞的组合数量。此外，使用生物三元数进行实验以达到统计显著性结果并解释不同细胞计数之间的变异性也很重要。</li>
	<li>使用此公式计算迁移的 NK92MI 单元格的绝对数量： <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> 其中 A = 细胞数，B = 珠数，C = 分配的磁数批次计数（流动细胞测定计数珠数/50 μL;在本例中为 49，500），D = 样本体积 （μL）。 注：如果使用300 μL的样本体积（迁移细胞）进行FACS分析，用50μL计数珠进行流式细胞测定，则迁移细胞的绝对数量 = 1，700个细胞/3，300个珠子事件x49，500珠/300μL = 84.975细胞/μL。如果样品被稀释或使用不同的FACS计数珠，则应更正计算。</li>
</ol>

<ol>
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作者没有什么可透露的。

此处描述的细胞毒性和迁移方法可用于评估NK细胞对癌细胞的细胞毒性和恶性肿瘤中NK细胞介导的免疫逃逸机制，以及确定增强NK细胞活性/功能的治疗剂。该协议是简单，敏感，可重复的，和更好的替代品，以传统的放射性为基础的51铬释放测定。这些协议经过专门设计，易于适应大多数实验室，具有易于解释的直观的色度、显微或基于 FACS 的读出，使研究人员能够得出可靠的结论。所有这些都可针对基于高吞吐量筛选的方法进行扩展。虽然这些协议是在单个肝肿瘤细胞系的背景下提出的，但它们可以很容易地适应其他癌细胞类型和/或其他非癌症靶细胞。
虽然所有提出的方法都是健壮和可重复的，但不同批次的癌细胞和NK细胞可能会出现实验间变异。为了确保实验结果准确支持实验结论，建议使用生物三元数至少重复两次实验。
此方法的一个局限性是NK92MI细胞的生长速度可能很慢。因此，对于 50 个或更多样本的实验，应事先增加足够数量的 NK92MI，以防止延迟。此外，必须实现协议中描述的所有控件，以避免出现虚假和不可重复的结果。NK细胞毒性测定的另一个限制是，NK与癌细胞的比例以及孵育时间必须针对每个靶细胞进行优化。例如，我们测试了肝癌细胞系与NK细胞（1：5、1：10、1：20、1：40和1：80）的各种癌细胞比例，以及多个孵育时间（2、3、4、5和6小时）。根据我们的研究结果，我们观察到最一致的结果，癌细胞与NK细胞的1：10和1：20比率，孵育3小时。
此外，从实体肿瘤衍生的癌细胞将在培养板表面附着和生长，而NK细胞在悬浮物中生长。如果孵育时间超过3小时，建议使用超低附着96孔板，这将提高实验和生物复制之间的一致性和可重复性。还必须注意，NK细胞诱导细胞毒性测定也可以使用从外周血单核细胞（PBMC）分离的初级NK细胞进行。但是，此类实验存在几个限制。首先，这些实验不能像NK92MI细胞那样容易地进行缩放。其次，从PMBC分离的NK细胞细胞毒性活性的分批变异在结果的可重复性和解释方面可能存在问题。同样，文献中描述了其他人类NK细胞系，并可用于这些类型的实验，包括NKL细胞29;然而，与NK-92MI细胞不同，NKL细胞是IL-2依赖细胞，不能用于商业。
在考虑所描述的钙素AM实验时，重要的是要注意，在细胞死亡30后，钙素AM仍留在凋亡体中。因此，应仔细进行钙质 AM 染色的定量，因为它可能导致对 NK 细胞毒性的低估。
与NK细胞介导细胞毒性类似，细胞因子和其他化学吸引剂对NK细胞迁移的调节在NK细胞功能的调节中起着重要作用。此处描述的 NK 细胞迁移测定提供了一个简单的平台，用于在刺激（如化学素或化学吸引剂）的背景下评估 NK 细胞迁移。此测定可用于评估可促进或干扰 NK 细胞迁移的试剂 - 从而识别 NK 细胞迁移的增强剂和抑制剂。这种方法也可用于研究由于遗传/表观遗传改变（上升或降调控）或药物治疗引起的NK细胞迁移调节能力。
为了准确测量 NK 细胞迁移，应遵循几个关键步骤。对于使用条件介质的所有实验，从控制和处理条件中使用等效条件介质以获得准确的测量非常重要。孵化时间会因纯化化学吸引剂和条件培养物而不同。最后，跨孔迁移测定已经建立，被认为是评估NK细胞迁移的极好方法;然而，在测定中使用的同质单一培养缺乏组织甚至3D培养的复杂生理学，可能更准确地模仿肿瘤微环境。
因此，尽管本文提出的NK细胞毒性测定和NK迁移测定存在一些局限性，但这些测定适用于广泛的免疫学研究，从而为评估NK细胞提供了重要而可靠的方法。功能和NK细胞调节免疫治疗。

人体识别非自身和消除异物的能力是人类战胜病原体和恶性肿瘤的关键。人体免疫反应在这一过程中起着最重要的作用2，3，4。根据关键特性和功能，人体免疫系统大致可分为两大功能组：适应性免疫系统和先天免疫系统。适应性免疫系统通常特定于给定的病原体，具有免疫记忆，因此，对同一病原体5、6、7、8、9的未来重新感染具有持久和反应能力。相反，先天免疫在目标根除方面更为广泛，而且相对不特定。因此，通常，先天免疫反应作为免疫防御的第一线10。自然杀手（NK）细胞属于先天免疫系统，占循环淋巴细胞总数的10-15%。NK细胞通过两个主要机制消灭靶细胞。首先，当结合到靶细胞表达活化配体后，NK细胞通过外细胞凋亡释放膜破坏蛋白穿孔蛋白和血清蛋白粒体，共同诱导靶细胞12、13、14、15细胞凋亡。此外，NK细胞表达FasL和肿瘤坏死因相关凋亡诱导配体（TRAIL）与靶细胞表达死亡受体（Fas/CD95）相互作用，导致卡巴西依赖性凋亡16。最重要的是，NK细胞不需要预刺激，如抗原表达，以消除病原体感染或恶性细胞;因此，他们通常处于随时可杀的状态17，18。为了抑制肿瘤的发展和进展，消灭癌细胞，NK细胞必须迁移到肿瘤部位，一旦在肿瘤微环境中，识别和攻击目标细胞。
过去，NK细胞效应器功能主要通过脱粒和细胞毒性测定19、20、21进行监测。NK细胞细胞毒性也可以测量51铬释放测定22，23，24，25。然而，这种测定有一些具体要求，包括需要伽玛计数器，并且是基于放射性的，这需要处理和处置放射性物质的培训，对使用者构成一定程度的风险。因此，开发并使用了几种新的非放射性测定基，用于研究NK细胞活性。
在这里，我们描述了两种这样的协议，彩色乳酸脱氢酶（LDH）测量基NK细胞介导细胞毒性测定和钙素乙酰甲基（AM）染色为基础的显微方法，以测量NK细胞介导癌细胞的消灭。这些测定不需要使用放射性同位素，是直接的，敏感的，可重复地识别调节NK细胞功能的因素。此外，由于如果不监测NK细胞迁移的变化，就无法充分评估NK细胞功能，我们还提出了一种基于流细胞学的定量方法来监测NK细胞迁移。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra Centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH cytotoxic assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92MI cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKHEP-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable chambers</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells

自然杀手 （NK） 细胞是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞群的子集，通过清除病原体感染、恶性和有压力的细胞作为第一道防线参与。NK细胞消灭癌细胞的能力使其成为对抗癌症的重要工具。几种新的基于免疫的疗法正在接受癌症治疗研究，这些疗法要么依赖于增强NK细胞活性，要么增加癌细胞对NK细胞介导的根除的敏感性。然而，为了有效地开发这些治疗方法，还需要具有成本效益的体外检测来监测NK细胞介导的细胞毒性和迁移。在这里，我们提出了两个体外协议，可以可靠和重复地监测NK细胞毒性对癌细胞（或其他目标细胞）的影响。这些协议基于非放射性，易于设置，可以放大以进行高通量筛查。我们还提出了一种基于流细胞学的协议，用于定量监控NK细胞迁移，也可以放大以进行高通量筛选。总之，这三个协议可用于监测NK细胞活动的关键方面，这些方面是细胞消除功能失调靶细胞所必需的。

以SK-HEP-1肝肿瘤细胞系为模型系统，对NK细胞毒性测定和NK细胞迁移测定进行了检测。为了使用LDH测定法测量NK细胞细胞毒性，SK-HEP-1细胞在96孔板中用NK92MI细胞孵育3小时（图1A）。ATF4先前已被证明通过调节活化配体ULBP128来调节NK细胞毒性。与NK细胞介导靶细胞杀灭相关的LDH活性被按色测量，并使用协议1中描述的公式计算细胞毒性百分比。ATF4击倒显著降低了NK细胞介导细胞毒性相比，NK细胞表达NS shRNA（图1B-D）。我们还使用基于钙素 AM 染色的测定测量了 NK 细胞细胞毒性。为此，SK-HEP-1细胞表达NS shRNA或ATF4靶向shRNA，贴上钙素AM标签，并在96孔板中孵育NK92MI细胞4小时，如图2A所示。孵育后，使用FITC/GFP过滤器通过荧光显微镜捕获钙素AM阳性细胞的图像。这种方法不会检测到被NK细胞杀死的细胞，因为它们不再保留钙化AM染料。如图2 B，C所示，与NK92MI细胞共培养后，与没有NK92MI细胞生长的SK-HEP-1细胞相比，钙素AM阳性SK-HEP-1细胞的数量减少。然而，正如所料，ATF4通过shRNA敲除减少NK细胞介导的SK-HEP-1细胞的杀灭，通过更多的钙素AM阳性细胞观察到（图2B，C）。因此，基于LDH和钙素AM的检测均显示一致的结果，并证实ATF4击倒降低了NK介导的癌细胞细胞毒性。这些检测中的任何一种都足以评估NK细胞介导的细胞毒性;但是，我们建议使用这两种方法来增加结果的严格性和可信度。
我们还介绍了24孔NK细胞迁移测定的结果。在上腔室的无血清NK92MI培养基中重新悬浮NK92MI细胞，并将化学素、CC图案、配体2（CCL2）添加到下渗透室。NK细胞迁移被测定，如第3节（图3A）所述。通过添加流量细胞测定计数珠子，然后进行FACS分析，对迁移的NK92MI细胞数进行量化。如图3B-C所示，与对照培养基相比，迁移到含CCL2介质的NK92MI细胞数量显著增加。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> 图1：基于多色LDH活性的NK细胞介导细胞毒性测定。（A） 描述基于色度LDH活性的NK细胞毒性测定的关键步骤的架构。（B，C）ATF4表达在SK-HEP-1细胞中通过定量RT-PCR和西方印迹表达非特异性（NS）shRNA或以ATF4为目标的shRNA。（B） 在SK-HEP-1细胞中，在表达NS shRNA或ATF4 shRNA的细胞中，相对ATF4 mRNA水平在正常化后显示为ACTINB水平。（C） 表达NS shRNA或ATF4 shRNA的SK-HEP-1细胞中的ATF4和ACTINB蛋白水平。（D） 用LDH方法在SK-HEP-1细胞中分析NK细胞介导细胞毒性，以表达NS shRNA或ATF4 shRNA。百分比 （%）显示NK细胞介导细胞毒性。数据以均值 = SEM 表示;ns，不显著;\p < 0.01， #p < 0.001.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> 图2：基于钙素AM染色的显微方法，用于测量NK细胞介导细胞毒性。（A） 描述基于钙素 AM 染色的显微方法测量 NK 细胞介导细胞毒性的关键步骤的架构。（B） NK细胞介导细胞毒性在SK-HEP-1细胞中，使用钙素AM方法表达NS shRNA或ATF4 shRNA。将显示具有代表性的图像。刻度条 = 200 μm。（C） 在小组 B 中提出的实验的钙素 AM 阳性细胞的百分比。\p < 0.01。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> 图3：基于FACS的定量NK细胞迁移测定。（A） 描述基于 FACS 的 NK 细胞迁移测定的关键步骤的架构。（B，C）在24孔板底室中加入50 ng CCL2后，进行了NK细胞迁移测定。（B） 代表NK细胞迁移点图用于控制或CCL2处理培养基图所示。（C） NK 细胞迁移数据 （均值 = SEM） 为面板 B 所示的实验提供。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的较大版本。</a>

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Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

癌细胞对自然杀手（NK）细胞介导的根除的逃避对癌症的启动和进展非常重要。在这里，我们提出了两个非放射性为基础的协议，以评估NK细胞介导的细胞毒性对肝肿瘤细胞。此外，还提出了第三个协议来分析NK细胞迁移。

肝肿瘤细胞背景下自然杀伤细胞介导细胞毒性和迁移的测量

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

我们今天将演示两个协议，演示如何研究NK细胞功能。NK细胞功能有两个关键方面，就是能够根除肿瘤细胞，能够迁移到肿瘤微环境。这两个协议，我们将演示NK细胞的能力，以消除肿瘤细胞，也能够迁移到肿瘤微环境。因此，我们今天要演示的两个协议是直接的，不需要使用无线电活动，可以在大多数实验室中建立，这些实验室有能力做分子生物学和细胞培养工作。苏雷什·布吉德和苏雷什·查瓦是我实验室的两位博士后同事，他们今天将演示这两个协议。两个评估NK细胞中化细胞毒性使用LDH，首先增长人类肝癌细胞系到70-80%的汇合在100毫米细胞培养皿在37摄氏度和5%二氧化碳。在实验当天，用五毫升PBS洗涤培养，然后用0.25%的尝试性EDTA的一毫升处理细胞，直到细胞从板底分离。获得单细胞悬浮液后，向细胞中加入10毫升细胞培养，并将细胞转移到15毫升锥形管中进行离心。用五毫升PBS洗涤细胞颗粒，然后以每毫升新鲜培养培养力浓度的1倍至第5个细胞重新悬浮细胞。接下来，在96井板中每孔三升中目标人类肝癌细胞的100微升，并在100微升的培养中向每个靶细胞中加入10倍的10倍。然后将盘子放在细胞培养箱中三个小时。在孵化结束时，通过离心将细胞进行颗粒化，然后将100微升的上经剂从每口井转移到新96井板的单个孔中。将 50 微升 LDH 基板添加到每井中，彻底混合，并在室温下孵育板 20 分钟，防止光线。在孵育结束时，用50微升停止溶液停止反应，并立即测量490和680纳米板读卡器的吸光度。然后使用公式计算 NK 细胞毒性百分比。在将人类肝癌细胞系细胞培养至70-80%汇合后，使用钙蛋白计算细胞毒性，在室温下用1.5微升10毫升钙蛋白MM溶液对细胞进行再悬浮，并在室温下为细胞贴上1.5微升10毫升钙化蛋白溶液30分钟的标签。在孵育结束时，通过离心收集细胞，每次洗涤用五毫升PBS洗两次细胞。每毫升培养中等浓度的1倍至第5个细胞重新悬浮细胞，并在每个治疗条件下的96井板的每个井中加入100微升细胞。接下来，在10至5个人类NK细胞中，在100微升培养基中，将细胞培养培养箱放在细胞培养箱中4小时。孵育结束后，在荧光显微镜上以10倍的放大倍率捕获钙素 AM 阳性细胞的至少 10 个不同图像，用于每个治疗条件的复制。然后使用公式计算细胞毒性百分比。测量NK细胞迁移以响应化疗刺激从70-80%的汇合培养物中收集人类NK细胞，并在每毫升无血清NK细胞培养基浓度的2.5倍至第6细胞中重新悬浮细胞。接下来，加入600微升不含NK细胞化疗的无血清介质，每井都加入一个直径为6.5毫米的培养物，每孔有5微米孔。然后将100微升NK细胞添加到每个插入物的上部隔间，并将板放在细胞培养箱中4小时。在孵化结束时，将整个非粘附细胞从每井底部转移到单独的五毫升的ACCS管中，并将50微升的预定数量的流式细胞仪计数珠添加到每个管中。然后使用流细胞计根据标准流量细胞计量分析方案评估每个细胞样本，并使用公式计算迁移的NK细胞的绝对数量。与表达非特异性短发夹RNA的NK细胞相比，ATF4击倒显著降低了NK细胞中占细胞毒性。与没有NK细胞培养的人类肝癌细胞相比，与无NK细胞培养的人类肝癌细胞相比，用钙化物 AM 染色后，可行的人类肝癌细胞数量减少。正如预期的那样，ATF4通过短发夹RNA的敲击减少了NK细胞中占的人类肝癌细胞的杀戮，这些培养物中钙素 AM 阳性细胞的数量就更多就证明了这一点。此外，与暴露于无化疗素控制介质的NK细胞相比，对含化疗素的介质的NK细胞迁移量显著增加。对于NK细胞毒性评估，重要的是要标准化我们的努力和目标比率和孵育时间的每一个癌细胞系。一旦标准被确定和验证，体外评估辅以体内小鼠实验，以进一步评估其在肿瘤细胞根除中的作用。

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