Name: measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells at JoVE.com

Nous remercions les subventions des National Institutes of Health : R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) et 1R01 CA218008-01A1 (NW). Nous reconnaissons également le ministère de la Défense de financement W81XWH1910480 et W81XWH-18-1-0069 à NW.

1. Préparation du milieu de culture pour les cellules NK et les cellules tumorales hépatiques
<ol><li>Utilisez des cellules tueuses naturelles humaines (p. ex. NK92MI) et la lignée cellulaire du cancer du foie humain (p. ex., SK-HEP-1).</li>
	<li>Préparer le milieu de culture cellulaire NK pour les cellules NK92MI humaines en ajoutant les composants suivants à 500 ml d’acide folique moyen minimum essentiel Eagle alpha sans ribonucleosides et deoxyribonucleosides aux concentrations finales indiquées : 0,02 mM d’acide folique (100 oL de 100 mM d’acide folique), 0,2 mM de myoinositol (500 oL de 200 mm myo inositol), 0,1 mM de mercaptoéthanol (3,5 l de 14,3 M à mercaptoéthanol), 2 mM L-glutamine (5 mL de 200 mM L-glutamine), 1 % pénicilline/streptomycine (5 mL de pénicilline/streptomycin) 12,5 % sérum (FBS), et 12,5% de sérum de cheval. Mélanger et filtrer la stérilisation à l’aide d’une unité de filtration stérile de 0,22 m et entreposer à 4 oC.</li>
	<li>Préparer le milieu de culture pour la ligne hépatique de cellules de tumeur SK-HEP-1 en ajoutant 10% FBS et 1% pénicilline/streptomycine au milieu modifié d’aigle de Dulbecco de haut-glucose (DMEM) contenant 2 mM L-glutamine.</li>
</ol>2. Colorimetric LDH Mesure-basé NK Cell-mediated Cytotoxicity Assay
<ol><li>Cultivez des cellules SK-HEP-1 à 70 à 80 % de confluence dans un plat Petri de culture cellulaire de 100 mm dans un CO2 de 5 % à 37 oC dans un incubateur de CO2. Générer une suspension à une cellule en lavant d’abord les cellules avec 5 ml de saline tamponnée par phosphate 1x (PBS) suivie d’une incubation avec 1 ml de 0,25% de trypsine-EDTA dans 5% de CO2 à 37 oC dans un incubateur co2 jusqu’à ce qu’une suspension cellulaire unique soit générée. REMARQUE : L’activité de cellules de NK peut être induite par les cellules cancéreuses stressées dues aux changements dans l’expression du ligand de cellules DE NK-activant dans les cellules cancéreuses. Par conséquent, les cellules cancéreuses saines et sous-confluentes devraient être employées pour des résultats précis. Il est également important de noter que les récepteurs cellulaires ET les ligands de CELLULES NK peuvent être sensibles à la trypsinisation26,27. Par conséquent, le protocole de trypsinisation devrait être soigneusement optimisé et la trypsinisation excessive devrait être évitée.</li>
	<li>Après la trypsinisation, ajouter 10 ml de milieu de culture SK-HEP-1 et centrifugeuse à 160 x g pendant 3 min dans un tube conique de centrifugeuse stérile de 15 ml. Laver la pastille cellulaire avec 5 ml de 1x PBS et resuspendre dans 5 ml de milieu de culture.</li>
	<li>En parallèle, centrifuger les cellules NK92MI à 160 x g pendant 3 min dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Laver la pastille cellulaire avec 5 ml de 1x PBS et resuspendre en 5 ml de milieu de culture cellulaire NK92MI. REMARQUE : Les cellules DE NK92MI sont cultivées dans le milieu de culture de cellules de NK et obtenues de même comme décrit dans l’étape 2.1.</li>
	<li>Comptez les cellules SK-HEP-1 et NK92MI à l’aide d’un hémocytomètre ou de tout compteur cellulaire automatisé disponible.</li>
	<li>Ajouter les cellules SK-HEP-1 (cellules cibles) (1 x 104/100 l/puits) et les cellules NK92MI (cellules effectrices) (1 x 105/100 l/puits) dans le rapport de 1:10 target:effector et seed in triplicate wells in a 96 well plate.</li>
	<li>Incuber la plaque de puits 96 à 37 oC dans une atmosphère de 95 % d’air et 5 % de CO2 pour 3 h. Après l’incubation, plaque centrifugeuse à 450 x g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Sans déranger la pastille cellulaire, recueillir 100 l de supernatant de chaque puits et transférer dans un puits dans une nouvelle plaque de puits 96.</li>
	<li>Ajouter 50 l de substrat LDH, bien mélanger et incuber la plaque pendant 20 min à température ambiante dans l’obscurité.</li>
	<li>Arrêtez la réaction en ajoutant 50 l de solution d’arrêt (50 % de diméthylformamide et 20 % de sulfate de dodécyl de sodium au pH 4,7). Mesurer immédiatement l’absorption de la plaque à 490 nm et 680 nm à l’aide d’un lecteur de plaque.</li>
	<li>Soustrayez l’absorption à 680 nm de l’absorption à 490 nm. Calculer le pourcentage (%) Cytotoxicité de cellules de NK utilisant la formule ci-dessous. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> où l’expérimental LDH (effeteur et cellules cibles) est l’absorption des cellules NK92MI et des cellules SK-HEP-1, les cellules effectrices LDH est l’absorption des cellules NK92MI seule, LDH spontanée est l’absorption des cellules SK-HEP-1 seule, et LDH maximum est l’absorption de SK-HEP-1 cellules avec tampon de lyse. REMARQUE : Pour réduire l’interférence du sérum, utilisez toujours les contrôles suivants : cellules cibles seules (SK-HEP-1), cellules effectrices seules (NK92MI), cellules cibles munie d’un tampon de lyse comme contrôle complet de la lyse, milieu cellulaire cible, milieu NK92MI, ainsi que milieu cellulaire cible et NK92MI moyen dans un rapport de 1:1.</li>
</ol>3. Calcein AM Staining-based Microscopic Method for Measuring NK Cell-mediated Cytotoxicity
<ol><li>Culture SK-HEP-1 cellules à 70-80% de confluence. Générer une suspension à une cellule en les commençant d’abord par des cellules de lavage avec 5 ml de 1x PBS suivie d’incubation avec 1 ml de 0,25% trypsin-EDTA.</li>
	<li>Centrifugeuses cellules SK-HEP-1 dans un tube de centrifugeuse stérile de 1 ml à 160 x g pendant 3 min. Resuspendre la pastille dans 3 ml de DMEM sans sérum.</li>
	<li>Ajouter 1,5 l de solution AM de calcéine (10 mm) aux cellules SK-HEP-1 et incuber pendant 30 min à température ambiante. Centrifuge calcein AM-étiqueté SK-HEP-1 cellules à 160 x g pendant 3 min dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml.</li>
	<li>Laver les cellules deux fois avec 5 ml de 1x PBS pour enlever l’excès de colorant AM de calcéin.</li>
	<li>En parallèle, centrifuger les cellules NK92MI à 160 x g pendant 3 min dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml. Laver la pastille cellulaire une fois avec 5 ml de 1x PBS et resuspendre dans 5 ml de milieu cellulaire NK92MI.</li>
	<li>Comptez les cellules SK-HEP-1 étiquetées par calcéinam et les cellules NK92MI à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.</li>
	<li>Resuspendre les cellules SK-HEP-1 dans le milieu de culture à 1 x 10 cellules de5 cellules/mL et les cellules NK92MI à 1 x 106 cellules/mL dans le milieu cellulaire NK.</li>
	<li>Cellules SK-HEP-1 étiquetées par la calcéine(1 x 104/100 l/puits) avec des cellules NK92MI (cellules effectrices) (1 x 105/10 l/puits) (1:10 rapport cible:effecteur) par puits dans des puits tripler dans une plaque de puits de 96.</li>
	<li>Incuber la plaque de puits 96 à 37 oC dans une atmosphère de 95 % d’air et 5 % de CO2 pour 4 h. Après l’incubation, capturez des images de fluorescence des cellules labellisées AM à l’aide d’un microscope à fluorescence à 10 x grossissement. Capturez au moins 10 champs différents de chaque réplique pour chaque condition de traitement.</li>
	<li>Sélectionnez au hasard 10 images pour chaque réplique et compte des cellules cibles étiquetées AM-positives de calcéine incubées avec ou sans cellules NK92MI. Calculer % de cytotoxicité à l’aide de la formule ci-dessous. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> REMARQUE : Comme contrôles, utilisez des cellules cibles sans cellules NK92MI et des cellules cibles complètement lysées comme contrôle complet de la lyse. Pour une lyse complète, incuber les cellules dans 0,5% Triton X-100 pour 1 h (20 oL de 5% Triton X-100 dans 200 'L de médias de culture).</li>
</ol>4. Nk Cell Migration Assay
<ol><li>Cultivez les cellules NK92MI et les cellules centrifugeuses à 160 x g pendant 3 min dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 ml.</li>
	<li>Laver la pastille cellulaire deux fois avec 5 ml de 1x PBS et resuspendre les cellules dans 3 ml de milieu cellulaire NK92MI sans sérum. Comptez les cellules NK92MI à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.</li>
	<li>Cellules NK92MI de plaque (2,5 x 105 cellules/100 l/puits) dans le compartiment supérieur de la chambre perméable transwell (insertion de 6,5 mm de diamètre et taille de 5 pores).</li>
	<li>Dans la chambre inférieure, ajouter 0,6 ml de matériau contenant du matériel contenant sans sérum à tester pour les propriétés chimioattractantes des cellules NK (p. ex., milieu conditionné, chimiokines, cytokines). REMARQUE : Lors de la préparation du milieu conditionné, utilisez le milieu à sérum réduit sans sérum ajouté pour éliminer l’interférence des protéines sériques dans l’action de migration.</li>
	<li>Incuber les 24 chambres bien perméables à 37 oC pendant 4 h. Après 4 h, collectez les cellules NK92MI non adhérentes et migrées de la chambre inférieure et transférez-les dans des tubes de tri cellulaireactivés par fluorescence (FACS) pour une analyse plus approfondie. REMARQUE : Le temps de culture peut varier selon le type de cellules cibles, ainsi que la quantité et la cinétique des chimiokines produites par les cellules cibles. Par conséquent, ce temps devrait être déterminé empiriquement pour chaque type de cellule, chimiokine, et expérience.</li>
	<li>Ajoutez un nombre prédéterminé de perles de comptage pour la cytométrie du débit dans un volume de 50 L à chaque tube contenant des cellules NK migrées. Évaluer le volume de la suspension cellulaire de 300 l/puits à l’aide de n’importe quel cytomètre d’écoulement capable de compter automatisé les cellules à base de FACS. REMARQUE : Mélanger ou mélanger les perles de comptage pour la cytométrie du débit à chaque fois avant utilisation pour s’assurer qu’un nombre constant de perles est utilisée pour minimiser la variabilité expérimentale. Le tuyauterie inversée est recommandé avec des perles de comptage pour maintenir la précision. Utilisez uniquement les cellules NK et compter les perles pour la cytométrie du débit comme contrôles d’analyse FACS. Les auteurs recommandent de lire au moins 10.000 perles - cellules NK combinés, une quantité qui a bien fonctionné. Cependant, ce nombre peut varier en fonction des conditions expérimentales. Par conséquent, le nombre combiné de perles et de cellules NK doit être déterminé empiriquement pour chaque type d’expérience. En outre, il est important d’effectuer des expériences à l’aide de triplicats biologiques pour obtenir des résultats statistiquement significatifs et pour tenir compte de la variabilité entre les différents comptes cellulaires.</li>
	<li>Calculez le nombre absolu de cellules NK92MI migrées à l’aide de cette formule : <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> où un nombre de cellules, B et un nombre de perles, C - compte de perles attribués du lot (nombre de perles de comptage pour la cytométrie du débit/50 l; dans cet exemple 49 500), et D - volume d’échantillon (L). REMARQUE : Si 300 L de volume d’échantillon (cellules migrées) sont utilisés pour l’analyse FACS avec 50 l de perles de comptage pour la cytométrie du débit, le nombre absolu de cellules migrées 1 700 cellules /3 300 épreuves de perles x 49 500 perles/300 ll et 84,975 cellules/L. Le calcul doit être corrigé si l’échantillon est dilué ou si un volume différent de perles de comptage FACS est utilisé.</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à révéler.

Les méthodes de cytotoxicité et de migration décrites ici peuvent être utilisées pour évaluer la cytotoxicité des cellules NK aux cellules cancéreuses et aux mécanismes d’évasion immunitaire médiés par les cellules NK dans les tumeurs malignes, ainsi que pour identifier les agents thérapeutiques qui amélioreront l’activité/fonction des cellules NK. Les protocoles sont des alternatives simples, sensibles, reproductibles et préférables à l’analyse classique de libération de chrome 51basée sur la radioactivité. Les protocoles ont été spécialement conçus pour être facilement adaptables pour une utilisation dans la plupart des laboratoires, avec des réadmissions colorimétriques, microscopiques ou FACS simples qui sont faciles à interpréter, permettant aux chercheurs de parvenir à des conclusions fiables. Tous sont évolutifs pour les approches de dépistage à haut débit. Bien que les protocoles soient présentés dans le contexte d’une seule lignée cellulaire hépatique, ils peuvent être facilement adaptés à d’autres types de cellules cancéreuses et/ou à d’autres cellules cibles non cancéreuses.
Alors que toutes les méthodes présentées sont robustes et reproductibles, la variation inter-expérimentale pourrait se produire avec différents lots de cellules cancéreuses et de cellules NK. Pour s’assurer que les résultats étayent avec précision les conclusions des expériences, il est conseillé de répéter l’expérience au moins deux fois à l’aide de triplicats biologiques.
Une limitation de cette méthode est que le taux de croissance des cellules NK92MI peut être lent. Par conséquent, pour les expériences avec 50 échantillons ou plus, un nombre suffisant de NK92MI devrait être cultivé à l’avance pour prévenir les retards. En outre, tous les contrôles décrits dans les protocoles doivent être mis en œuvre pour éviter des résultats fallacieux et non reproductibles. Une autre limitation de l’exemple de cytotoxicité NK est que le ratio NK/cellule cancéreuse, ainsi que le temps d’incubation, doivent être optimisés pour chaque cellule cible. Par exemple, nous avons testé divers ratios de cellules cancéreuses aux cellules NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 et 1:80) pour les lignées cellulaires cancéreuses hépatiques, ainsi que des temps d’incubation multiples (2, 3, 4, 5 et 6 h). Sur la base de nos résultats, nous avons observé les résultats les plus cohérents avec des ratios de 1:10 et 1:20 des cellules cancéreuses aux cellules NK et l’incubation pendant 3 h.
En outre, les cellules cancéreuses dérivées de tumeurs solides se fixent et se développent à la surface de la plaque de culture, tandis que les cellules NK se développent en suspension. Si le temps d’incubation est supérieur à 3 h, il est conseillé d’utiliser des plaques de puits d’attachement ultra-faible 96, ce qui améliorera la consistance et la reproductibilité entre les expériences et les répliques biologiques. Il est également important de noter que les tests de cytotoxicité induits par les cellules NK peuvent également être effectués à l’aide de cellules NK primaires isolées des cellules mononucléaires sanguines périphériques (PBMC). Cependant, il y a plusieurs limitations avec de telles expériences. Tout d’abord, ces expériences ne peuvent pas être aussi facilement mis à l’échelle qu’avec les cellules NK92MI. Deuxièmement, la variation par lots de l’activité cytotoxique des cellules NK isolées des PMBC peut être problématique en termes de reproductibilité et d’interprétation des résultats. De même, d’autres lignées cellulaires NK humaines sont décrites dans la littérature et pourraient être utilisées dans ces types d’expériences, y compris les cellules NKL29; cependant, à la différence des cellules de NK-92MI, les cellules de NKL sont DÉPENDANTEs d’IL-2 et ne sont pas disponibles commercialement.
En considérant les expériences de calcéin AM décrites, il est important de noter que la calcéine AM reste dans les corps apoptotic après la mort cellulaire30. Par conséquent, la quantitation de la coloration de calcéin AM devrait être soigneusement exécutée, car elle peut mener à une sous-estimation de cytotoxicité de NK.
Semblable à la cytotoxicité de cellules de NK-négociée, la modulation de la migration de cellules de NK par des cytokines et d’autres chemoattractants joue un rôle important dans la régulation de la fonction de cellules de NK. L’analyse de migration des cellules NK décrite ici fournit une plate-forme simple pour évaluer la migration des cellules NK dans le contexte d’un stimulus tel qu’une chimiokine ou une chimioattractante. Cet analyse peut être utilisé pour évaluer les agents qui peuvent soit promouvoir ou interférer avec la migration des cellules NK - ainsi, l’identification des exhausteurs et des répresseurs de la migration des cellules NK. Cette méthode peut également être utile pour étudier la capacité de régulation de la migration des cellules NK à la suite d’une altération génétique/épigénétique (upregulation ou downregulation) ou résultant d’un traitement médicamenteux.
Pour mesurer avec précision la migration des cellules NK, il y a peu d’étapes critiques à suivre. Pour toutes les expériences utilisant le milieu conditionné, il est important que le milieu conditionné équivalent soit employé des conditions de contrôle et de traitement pour obtenir des mesures précises. Le temps d’incubation sera varié avec des chimioattractants purifiés et un milieu conditionné. Enfin, les essais de migration des puits sont bien établis et considérés comme une excellente méthode pour évaluer la migration des cellules NK; cependant, les monocultures homogènes employées dans les essais manquent de la physiologie complexe des tissus ou même des cultures 3D qui pourraient imiter plus exactement le microenvironnement de tumeur.
Ainsi, bien qu’il y ait quelques limitations aux essais de cytotoxicité de cellules de NK et à l’analyse de migration de NK présentées dans cet article, ces essais sont applicables à un large éventail d’études immunologiques et fournissent ainsi des méthodes importantes et fiables pour évaluer la cellule de NK thérapeutique satismique modulatoire des cellules NK.

La capacité du corps humain à identifier les non-soi et à éradiquer les objets étrangers est essentielle à la survie humaine contre les agents pathogènes et les tumeurs malignes1. La réponse immunitaire humaine joue le rôle le plus important dans ce processus2,3,4. Basé sur les caractéristiques et les fonctions clés, le système immunitaire humain peut être largement classé en deux grands groupes fonctionnels: le système immunitaire adaptatif et le système immunitaire inné. Le système immunitaire adaptatif est généralement spécifique à un agent pathogène donné et a une mémoire immunologique et, par conséquent, est durable et sensible à la réinfection future par le même agent pathogène5,6,7,8,9. En revanche, l’immunité innée est beaucoup plus large dans son éradication cible et relativement non spécifique. Par conséquent, typiquement, la réponse immunitaire innée sert de première ligne de défense immunologique10. Les cellules tueuses naturelles (NK) appartiennent au système immunitaire inné et représentent 10 à 15 % du total des lymphocytes circulants11. Les cellules NK éliminent les cellules cibles par deux mécanismes majeurs. Tout d’abord, lors de la liaison aux cellules cibles exprimant l’activation des ligands, les cellules NK libèrent la perforine de protéine perturbatrice de membrane et les granzymes de protéase de sérine par exocytose, qui induisent conjointement l’apoptose dans les cellules cibles12,13,14,15. En outre, les cellules NK exprimant FasL et la nécrose tumorale facteur-induisant l’apoptosis ligand (TRAIL) interagissent avec les cellules cibles exprimant des récepteurs de la mort (Fas/CD95), conduisant à l’apoptose caspase-dépendante16. Plus important encore, les cellules NK n’ont pas besoin de préstimulation, comme la présentation d’antigènes, pour éradiquer les cellules infectées par des agents pathogènes ou malignes; ainsi, ils sont habituellement dans un état prêt-à-tuer17,18. Afin d’inhiber le développement et la progression de tumeur et d’éradiquer des cellules cancéreuses, les cellules de NK doivent migrer au site de tumeur et, une fois dans le microenvironnement de tumeur, identifier et attaquer les cellules cibles.
Dans le passé, les fonctions d’effecteur de NK-cellule ont été principalement surveillées par la dégranulation et les essais de cytotoxicité19,20,21. La cytotoxicité des cellules NK peut également être mesurée par 51analyses de libération de chrome22,23,24,25. Cependant, cet analyse a certaines exigences spécifiques, y compris la nécessité d’un compteur gamma, et est basé sur la radioactivité, qui nécessite une formation dans la manipulation et l’élimination des matières radioactives et pose un niveau de risque pour l’utilisateur. Par conséquent, plusieurs nouveaux essais non radioactifs ont été développés et utilisés pour étudier l’activité des cellules NK.
Ici, nous décrivons deux tels protocoles, la déshydrogénase lactique coloriamétrique (LDH) test de cytotoxicité à médiation cellulaire NK basé sur la mesure et la calcéine acéxine (AM) méthode microscopique à base de coloration pour mesurer l’éradication des cellules cancéreuses NK à médiation cellulaire. Ces essais ne nécessitent pas l’utilisation de radio-isotopes, sont simples, sensibles, et identifient de façon reproductible les facteurs qui modulent la fonction des cellules NK. En outre, parce que la fonction de cellule DE NK ne peut pas être entièrement évaluée sans les changements de surveillance dans la migration de cellules de NK, nous présentons également une méthode quantitative basée sur la cytométrie de flux pour surveiller la migration de cellules de NK.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra Centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH cytotoxic assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92MI cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKHEP-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable chambers</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells

Les cellules tueuses naturelles (NK) sont un sous-ensemble de la population cytotoxique de lymphocyte du système immunitaire inné et participent comme première ligne de défense en effaçant les cellules pathogènes infectées, malignes et stressées. La capacité des cellules NK à éradiquer les cellules cancéreuses en fait un outil important dans la lutte contre le cancer. Plusieurs nouvelles thérapies immunitaires sont à l’étude pour le traitement du cancer qui reposent soit sur l’amélioration de l’activité des cellules NK ou l’augmentation de la sensibilité des cellules cancéreuses à l’éradication à médiation cellulaire NK. Cependant, pour développer efficacement ces approches thérapeutiques, des essais in vitro rentables pour surveiller la cytotoxicité et la migration à médiation cellulaire NK sont également nécessaires. Ici, nous présentons deux protocoles in vitro qui peuvent surveiller de façon fiable et reproductible l’effet de la cytotoxicité de NK-cellule sur des cellules cancéreuses (ou d’autres cellules cibles). Ces protocoles sont non basés sur la radioactivité, simples à mettre en place, et peuvent être mis à l’échelle pour le dépistage à haut débit. Nous présentons également un protocole basé sur la cytométrie du flux pour surveiller quantitativement la migration des cellules NK, qui peut également être mis à l’échelle pour le dépistage à haut débit. Collectivement, ces trois protocoles peuvent être utilisés pour surveiller les aspects clés de l’activité des cellules NK qui sont nécessaires pour la capacité des cellules à éradiquer les cellules cibles dysfonctionnelles.

Les essais de cytotoxicité de cellules de NK et l’analyse de migration de cellules de NK ont été exécutés utilisant la ligne hépatique de cellules de tumeur de SK-HEP-1 comme système modèle. Pour mesurer la cytotoxicité des cellules NK à l’aide de l’analyse LDH, les cellules SK-HEP-1 exprimant soit un shRNA non spécifique (NS) ou shRNA ciblant le facteur de transcription activant 4 (ATF4) ont été incubés avec des cellules NK92MI dans une plaque de puits 96 pendant 3 h (Figure 1A). ATF4 a été précédemment montré pour réguler la cytotoxicité de cellules de NK en régulant le ligand activant ULBP128. L’activité de LDH liée à la mise à mort de cellules de cellules NK-négociée s’est mesurée colorimetrically, et la cytotoxicité de pour cent calculée utilisant la formule décrite dans le protocole 1. ATF4 knockdown significativement réduit la cytotoxicité des cellules NK par rapport aux cellules NK exprimant NS shRNA (Figure 1B-D). Nous avons également mesuré la cytotoxicité de cellules de NK utilisant un assay de coloration de coloration am de calcéin. À cette fin, les cellules SK-HEP-1 exprimant nS shRNA ou ATF4-ciblage shARN ont été étiquetés avec la calcéine AM et incubé avec des cellules NK92MI dans 96 plaques de puits pour 4 h comme illustré dans la figure 2A. Après l’incubation, des images de cellules am-positives de calcéine ont été capturées par microscopie de fluorescence utilisant un filtre FITC/GFP. Les cellules tuées par les cellules NK ne sont pas détectées par cette approche parce qu’elles ne conservent plus le colorant AM de calcéine. Comme le montre la figure 2B,C, le nombre de cellules SK-HEP-1 am-positives de calcéine est diminué après co-culture avec des cellules DE NK92MI comparées aux cellules de SK-HEP-1 cultivées sans cellules de NK92MI. Cependant, comme prévu, atF4 knockdown via shRNA réduit NK cellules-négociées tuer des cellules SK-HEP-1, observé par un plus grand nombre de cellules calcéines AM-positives (Figure 2B,C). Par conséquent, les essais am basés lDH et calcéinont ont montré des résultats cohérents et ont confirmé que le knockdown d’ATF4 réduit la cytotoxicité nk-négociée de cellules cancéreuses. L’un ou l’autre de ces essais est suffisant pour évaluer la cytotoxicité cellule-négociée de NK ; cependant, nous recommandons d’utiliser les deux méthodes pour augmenter à la fois la rigueur et la confiance dans les résultats.
Nous présentons également les résultats d’un analyse de migration de cellules NK de 24 puits. Les cellules de NK92MI ont été resuspendues dans le milieu sans sérum de NK92MI dans la chambre supérieure, et la chimiokine, le motif de CC, le ligand 2 (CCL2) a été ajouté à la chambre perméable inférieure. La migration des cellules NK a été précisée à la section 3 (figure 3A). Le nombre de cellules NK92MI migrées a été quantifié en ajoutant des perles de comptage pour la cytométrie du débit et suivie d’une analyse FACS. Comme le montre la figure 3B-C, il y a eu une augmentation significative du nombre de cellules NK92MI qui avaient migré vers le milieu contenant du CCL2 par rapport au milieu témoin.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> Figure 1 : LDH colorimétrique basée sur l’activité NK cellule-négociée cytotoxicité d’assay. (A) Schéma tique représentant les étapes clés de l’activité colorimétrique LDH basé sur l’activité NK cellule cytotoxicité d’essayer. (B,C) L’expression d’ATF4 a été analysée dans les cellules de SK-HEP-1 exprimant l’ARNls non spécifique (NS) ou les shRNAs ciblant ATF4 par RT-PCR quantitatif et le ballonnement occidental. (B) Le niveau relatif d’ARNm ATF4 est montré après normalisation au niveau ACTINB dans les cellules SK-HEP-1 exprimant nS shRNA ou ATF4 shRNAs. (C) ATF4 et ACTINB niveaux de protéines dans les cellules SK-HEP-1 exprimant NS shRNA ou ATF4 shRNAs. (D) LA cytotoxicité de NK cellule-négociée a été analysée dans les cellules de SK-HEP-1 exprimant le shRNA de NS ou les shRNAs d’ATF4 par la méthode de LDH. Pourcentage (%) La cytotoxicité à médiation cellulaire de NK est montrée. Les données sont présentées comme moyennes et SEM; ns, pas significatif; p 'lt; 0.01, 'p 'lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> Figure 2 : Méthode microscopique à base de coloration de Calcein AM pour mesurer la cytotoxicité à médiation cellulaire NK. (A) Schématique représentant les étapes clés de la méthode microscopique à base de coloration de calcéine AM pour mesurer la cytotoxicité à médiation cellulaire NK. (B) LA cytotoxicité à médiation cellulaire NK a été analysée dans les cellules SK-HEP-1 exprimant soit NS shRNA ou ATF4 shRNAs en utilisant la méthode calcéine AM. Des images représentatives sont affichées. Barre d’échelle de 200 m. (C) Pourcentage de cellules am-positives de calcéine pour l’expérience présentée dans le panneau B. 'p 'lt; 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> Figure 3 : Essai quantitatif de migration des cellules NK basé sur le FACS. (A) Schéma graphique illustrant les étapes clés de l’assay de migration des cellules NK à base de FACS. (B,C) L’examen de migration des cellules NK a été effectué après l’ajout de 50 ng de CCL2 à la chambre inférieure de la plaque de puits 24. (B) Des parcelles représentatives de points de migration des cellules NK pour le contrôle ou le milieu de culture traité par LE CCL2 sont montrées. (C) Les données de migration des cellules NK (moyenne et SEM) sont présentées pour l’expérience présentée dans le panneau B. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

L’évasion de l’éradication des cellules par le tueur naturel (NK) par les cellules cancéreuses est importante pour l’initiation et la progression du cancer. Ici, nous présentons deux protocoles non radioactivité-basés pour évaluer la cytotoxicité cellule-négociée de NK vers les cellules hépatiques de tumeur. En outre, un troisième protocole est présenté pour analyser la migration des cellules NK.

Mesure de la cytotoxicité et de la migration à médiation cellulaire naturelle dans le contexte des cellules tumorales hépatiques

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Nous allons démontrer deux protocoles aujourd’hui qui démontrent comment étudier la fonction cellulaire NK. Il ya deux aspects clés de la fonction cellulaire NK qui est qu’il est capable d’éradiquer les cellules tumorales et il est capable de migrer vers l’environnement micro tumeur. Ces deux protocoles, nous allons démontrer la capacité des cellules NK à éradiquer les cellules tumorales et aussi il est capable de migrer vers l’environnement micro tumeur.Ainsi, les deux protocoles que nous allons démontrer aujourd’hui sont simples, ne nécessitent pas l’utilisation de l’activité radio et peuvent être établis dans la plupart des laboratoires qui a la capacité de faire de la biologie moléculaire et des travaux de culture cellulaire. Suresh Bugide et Suresh Chava, qui sont deux associés postdoctorat dans mon laboratoire, démontreront ces deux protocoles aujourd’hui. Deux évaluent la cytotoxicité 2 médiatisée de cellules de NK utilisant LDH, développent d’abord une ligne humaine de cellules cancéreuses de foie à 70-80%confluency dans une boîte de Pétri de culture cellulaire de 100 millimètres à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone.Le jour de l’expérience, laver la culture avec cinq millilitres de PBS avant de traiter les cellules avec un millilitre de 0,25% trypsine EDTA jusqu’à ce que les cellules se soient détachées du fond de la plaque. Lorsqu’une seule suspension cellulaire a été obtenue, ajouter 10 millilitres de milieu de culture cellulaire aux cellules et transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation. Lavez la pastille cellulaire avec cinq millilitres de PBS avant de re-suspendre les cellules à une fois 10 à la 5ème cellule par millilitre de concentration moyenne de culture fraîche.Ensuite, les graines 100 microlitres des cellules cancéreuses du foie humain cible par puits en triplicate par condition de traitement dans une plaque de puits 96 et ajouter une fois 10 à la 5e cellule humaine NK dans 100 microlitres de milieu à chaque cellule cible bien. Ensuite, placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois heures. À la fin de l’incubation, pelleter les cellules par centrifugation et transférer 100 microlitres de supernatant de chaque puits dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de puits de 96.Ajouter 50 microlitres de substrat LDH à chaque puits avec un mélange complet et incuber la plaque pendant 20 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. À la fin de l’incubation, arrêtez la réaction avec 50 microlitres de solution d’arrêt et mesurez immédiatement l’absorption sur un lecteur de plaque à 490 et 680 nanomètres. Ensuite, utilisez la formule pour calculer le pourcentage de cytotoxicité des cellules NK.Évaluer la cytotoxicité négociée par cellules NK à l’aide de calcéine AM après la croissance des cellules de cellules cancéreuses du foie humain à une confluence de 70-80%, comme démontré re-suspendre les cellules en trois millilitres de DMEM sans sérum et étiqueter les cellules avec 1,5 microlitres de 10 millimolaire calcéine AM solution pendant 30 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, recueillir les cellules par centrifugation et laver les cellules deux fois avec cinq millilitres de PBS par lavage. Suspendre à nouveau les cellules à une fois 10 à la 5ème cellule par millilitre de concentration moyenne de culture et ajouter 100 microlitres de cellules à chaque puits d’une plaque de puits de 96 en triplicate par condition de traitement.Ensuite, à une fois 10 à la 5e cellule NK humaine dans 100 microlitres de culture moyenne à chaque puits de cellules cibles et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures. Après la fin de l’incubation, capturer au moins 10 champs différents d’images des cellules positives de calcéine AM pour chaque répétition de chaque condition de traitement au microscope à fluorescence à un grossissement 10 fois. Calculez ensuite le pourcentage de cytotoxicité à l’aide de la formule.Pour mesurer la migration des cellules NK en réponse aux stimuli chemotactic recueillir les cellules NK humaines à partir d’une culture confluente de 70-80% et de suspendre à nouveau les cellules à un 2,5 fois 10 à la 6e cellules par millilitre de concentration moyenne de culture cellulaire NK sans sérum. Ensuite, ajoutez 600 microlitres de milieu sans sérum contenant l’attracteur de chimio cellulaire NK d’intérêt par puits et placez un insert de culture de 6,5 millimètres de diamètre avec cinq pores micromètres dans chaque puits de milieu. Ajouter ensuite 100 microlitres de cellules NK au compartiment supérieur de chaque insert et placer la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre heures.À la fin du transfert d’incubation, tout le volume de cellules migrées non adhérentes du fond de chaque puits vers des tubes FACS individuels de cinq millilitres et ajouter 50 microlitres d’un nombre prédéterminé de perles de comptage de cytométrie d’écoulement à chaque tube. Ensuite, à l’aide d’un cytomètre d’écoulement évaluer chaque échantillon de cellule selon les protocoles standard d’analyse cytométrique flux et de calculer le nombre absolu de cellules NK migrées en utilisant la formule. Le renversement d’ATF4 réduit de manière significative la cytotoxicité cellule-201ée de NK comparée aux cellules de NK exprimant l’ARN court non spécifique d’épingle à cheveux.Après coloration avec la calcéine AM le nombre de cellules cancéreuses humaines viables de foie diminue après co-culture avec les cellules humaines de NK comparées aux cellules cancéreuses humaines de foie cultivés sans cellules de NK. Comme prévu, atf4 knockdown via l’ARN à épingle à cheveux courte réduit nk cellule- médiatisée tuer des cellules cancéreuses du foie humain comme en témoigne un plus grand nombre de cellules calcéine AM-positive dans ces cultures. En outre, une quantité significativement plus élevée de migration de cellules NK est observée en réponse au milieu contenant de la chimiokine par rapport aux cellules NK exposées au milieu de contrôle sans chimiokine.Pour l’évaluation de la cytotoxicité des cellules NK, il est important de normaliser nos ratios d’effort et de cible et le temps d’incubation pour chaque lignée de cellules cancéreuses. Une fois que les normes sont identifiées et validées, les évaluations in vitro sont complétées par des expériences sur des souris in vivo afin d’évaluer davantage leur rôle dans l’éradication des cellules tumorales.

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