Name: measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00
Duration: 6 min 55 s
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Wir danken uns für Zuschüsse der National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) und 1R01 CA218008-01A1 (NW). Wir erkennen auch die Finanzierung von W81XWH1910480 und W81XWH-18-1-0069 an NW an.

1. Vorbereitung von Kulturmedium für NK-Zellen und Lebertumorzellen
<ol><li>Verwenden Sie menschliche natürliche Killerzellen (z. B. NK92MI) und menschliche Leberkrebszelllinie (z. B. SK-HEP-1).</li>
	<li>Prepare NK cell culture medium for NK92MI human NK cells by adding the following components to 500 mL of minimum essential medium Eagle alpha without ribonucleosides and deoxyribonucleosides to the indicated final concentrations: 0.02 mM folic acid (100 μL of 100 mM folic acid), 0.2 mM myoinositol (500 μL of 200 mM myoinositol), 0.1 mM β-mercaptoethanol (3.5 μL of 14.3 M β-mercaptoethanol), 2 mM L-glutamine (5 mL of 200 mM L-glutamine), 1% penicillin/streptomycin (5 mL of 100x penicillin/streptomycin), 12.5% fetal bovine Serum (FBS) und 12,5% Pferdeserum. Mit einer sterilen Filtrationseinheit mit 0,22 m mischen und filtern und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie Kulturmedium für lebertumorzelllinie SK-HEP-1 vor, indem Sie 10% FBS und 1% Penicillin/Streptomycin zu dem modifizierten Eagle Medium (DMEM) von Dulbecco mit hohem Glukose-Patienten (DMEM) mit 2 mM L-Glutamin hinzufügen.</li>
</ol>2. Farbmetrischer LDH-Messbasierter NK-Zell-vermittelter Zytotoxizitätstest
<ol><li>SK-HEP-1-Zellen in einer 100-mm-Zellkultur-Petrischale in 5%CO2 bei 37 °C in einemCO2-Inkubator auf 70 bis 80 % Konfluenz anbauen. Erzeugen Sie eine einzellige Suspension durch erste Waschzellen mit 5 ml 1x Phosphat-gepufferter Kochsaline (PBS) gefolgt von inkubation mit 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA in 5%CO2 bei 37 °C in einem CO2-Inkubator, bis eine Einzelzellsuspension erzeugt wird. HINWEIS: Die Aktivität von NK-Zellen kann durch gestresste Krebszellen durch Veränderungen in der Expression von NK-Zell-aktivierendem Liganden in Krebszellen induziert werden. Daher sollten gesunde und subkonfluente Krebszellen für genaue Ergebnisse verwendet werden. Es ist auch wichtig zu beachten, dass NK-Zellrezeptoren und Liganden empfindlich auf Trypsinisierung26,27sein können. Daher sollte das Trypsinisierungsprotokoll sorgfältig optimiert und übermäßige Trypsinisierung vermieden werden.</li>
	<li>Nach der Trypsinisierung 10 ml SK-HEP-1-Kulturmedium und Zentrifuge bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen konischen Zentrifugenrohr hinzufügen. Waschen Sie das Zellpellet mit 5 ml 1x PBS und resuspendieren In 5 ml Kulturmedium.</li>
	<li>Parallel dazu zentrieren Sie die NK92MI-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr. Waschen Sie das Zellpellet mit 5 ml 1x PBS und resuspendieren Sie in 5 ml NK92MI Zellkulturmedium. HINWEIS: NK92MI-Zellen werden im NK-Zellkulturmedium angebaut und ähnlich wie in Schritt 2.1 beschrieben erhalten.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellen SK-HEP-1 und NK92MI mit einem Hämozytometer oder einem verfügbaren automatisierten Zellzähler.</li>
	<li>Fügen Sie SK-HEP-1-Zellen (Zielzellen) (1 x 104/100 L/Well) und NK92MI-Zellen (Effektorzellen) (1 x 105/100 l/well) im Verhältnis von 1:10 Ziel:Effektor und Saatgut in dreifachen Bohrungen in einer 96-Well-Platte hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 96-Wellplatte bei 37 °C in einer Atmosphäre von 95% Luft und 5%CO2 für 3 h. Nach der Inkubation Zentrifugeplatte bei 450 x g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Ohne das Zellpellet zu stören, sammeln Sie 100 L Überstand aus jedem Brunnen und übertragen Sie in einen Brunnen in einer neuen 96-Well-Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 50 l LDH-Substrat hinzu, mischen Sie sie gut, und brüten Sie die Platte 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln.</li>
	<li>Beenden Sie die Reaktion, indem Sie 50 l Stop-Lösung (50% Dimethylformamid und 20% Natriumdodecylsulfat bei pH 4.7) hinzufügen. Messen Sie sofort die Absorption der Platte bei 490 nm und 680 nm mit einem Plattenleser.</li>
	<li>Subtrahieren Sie die Absorption bei 680 nm von der Absorption bei 490 nm. Berechnen Sie den Prozentsatz (%) NK-Zellzytotoxizität mit der folgenden Formel. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> wobei LDH-Experimente (Effektor + Zielzellen) die Absorption von NK92MI-Zellen und SK-HEP-1-Zellen ist, LDH-Effektorzellen allein die Absorption von NK92MI-Zellen, LDH spontan die Absorption von SK-HEP-1-Zellen allein und LDH maximal die Absorption von SK-HEP-1 Zellen mit Lysepuffer. ANMERKUNG: Um Serumstörungen zu reduzieren, verwenden Sie immer die folgenden Steuerelemente: Zielzellen allein (SK-HEP-1), Effektorzellen allein (NK92MI), Zielzellen mit Lysepuffer als vollständige Lysesteuerung, Zielzellmedium, NK92MI-Medium sowie Zielzellmedium und NK92MI Medium im Verhältnis 1:1.</li>
</ol>3. Calcein AM Staining-basierte mikroskopische Methode zur Messung der NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität
<ol><li>Kultur SK-HEP-1-Zellen bis zu 70 bis 80% Koninfluenza. Generieren Sie eine einzellige Suspension durch erste Waschzellen mit 5 ml 1x PBS gefolgt von inkubation mit 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA.</li>
	<li>Zentrifuge SK-HEP-1-Zellen in einem 1 ml sterilen Zentrifugenrohr bei 160 x g für 3 min. Das Pellet in 3 ml serumfreiem DMEM aussetzen.</li>
	<li>Fügen Sie den SK-HEP-1-Zellen 1,5 l Calcein-AM-Lösung (10 mM) hinzu und brüten Sie 30 min bei Raumtemperatur. Zentrifugenkalkein AM-markierte SK-HEP-1-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen zweimal mit 5 ml 1x PBS, um überschüssigen Calcein AM Farbstoff zu entfernen.</li>
	<li>Parallel dazu Zentrifugieren NK92MI-Zellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr. Waschen Sie das Zellpellet einmal mit 5 ml 1x PBS und resuspendieren Sie in 5 ml NK92MI Zellmedium.</li>
	<li>Zählen Sie Calcein AM-markierte SK-HEP-1-Zellen und NK92MI-Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.</li>
	<li>SK-HEP-1-Zellen im Kulturmedium bei 1 x 105 Zellen/ml und NK92MI-Zellen bei 1 x 106 Zellen/ml im NK-Zellmedium aussetzen.</li>
	<li>Plattenkalkam-beschrifteten SK-HEP-1-Zellen (Zielzellen) (1 x 104/100 l/well) mit NK92MI-Zellen (Effektorzellen) (1 x 105/100 l/well) (1:10 Ziel:Effektor-Verhältnis) pro Brunnen in dreifachen Brunnen in einer 96-Well-Platte.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 96-Wellplatte bei 37 °C in einer Atmosphäre von 95% Luft und 5%CO2 für 4 h. Erfassen Sie nach der Inkubation Fluoreszenzbilder der calcein AM-markierten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Erfassen Sie mindestens 10 verschiedene Felder jeder Replikation für jede Behandlungsbedingung.</li>
	<li>Wählen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 Bilder für jede Replikation und Zählung von calcein AM-positiven markierten Zielzellen aus, die mit oder ohne NK92MI-Zellen inkubiert werden. Berechnen Sie % Zytotoxizität mit der folgenden Formel. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> HINWEIS: Verwenden Sie als Steuerelemente Zielzellen ohne NK92MI-Zellen und vollständig lysierte Zielzellen als vollständige Lysesteuerung. Für eine vollständige Lyse inkubieren Sie die Zellen in 0,5% Triton X-100 für 1 h (20 l von 5% Triton X-100 in 200 l Kulturmedien).</li>
</ol>4. NK Zellmigration Assay
<ol><li>Nk92MI-Zellen und Zentrifugenzellen bei 160 x g für 3 min in einem 15 ml sterilen Zentrifugenrohr wachsen.</li>
	<li>Waschen Sie das Zellpellet zweimal mit 5 ml 1x PBS und setzen Sie die Zellen in 3 ml serumfreiem NK92MI-Zellmedium wieder auf. Zählen Sie NK92MI-Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler.</li>
	<li>Platte NK92MI-Zellen (2,5 x 105 Zellen/100 l/Well) im oberen Fach der transwell durchlässigen Kammer (6,5 mm Durchmesser Einsatz und 5 m Porengröße).</li>
	<li>In der unteren Kammer 0,6 ml serumfreies Medium hinzufügen, das Material enthält, das auf NK-Zell-Chemoattractant-Eigenschaften (z.B. konditioniertes Medium, Chemokine, Zytokine) getestet werden soll. HINWEIS: Verwenden Sie bei der Herstellung von konditioniertem Medium ein reduziertes Serummedium ohne zusatzserum, um Interferenzen von Serumproteinen im Migrationstest zu beseitigen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 24 gut durchlässigen Kammern bei 37 °C für 4 h. Nach 4 h die nicht haftenden und migrierten NK92MI-Zellen aus der unteren Kammer sammeln und zur weiteren Analyse in fluoreszenzaktivierte Zellsortierröhrchen (FACS) übertragen. HINWEIS: Die Kulturzeit kann je nach Art der Zielzellen sowie der Menge und Kinetik der von den Zielzellen erzeugten Chemokine variieren. Daher sollte diese Zeit empirisch für jeden Zelltyp, Chemokin und Experiment bestimmt werden.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Rohr, das migrierte NK-Zellen enthält, eine vorgegebene Anzahl von Zählperlen für die Durchflusszytometrie in einem Volumen von 50 l hinzu. Bewerten Sie das Volumen von 300 L/Well-Zellsuspensionen mit jedem Durchflusszytometer, das in der Lage ist, eine automatisierte FACS-basierte Zellzählung zu verwenden. HINWEIS: Mischen oder Wirbel mischen Sie die Zählperlen für die Durchflusszytometrie jedes Mal vor dem Gebrauch gründlich, um sicherzustellen, dass eine konstante Anzahl von Perlen verwendet wird, um die experimentelle Variabilität zu minimieren. Reverse Pipetting wird mit Zählperlen empfohlen, um die Genauigkeit zu erhalten. Verwenden Sie nur NK-Zellen und Zählperlen für die Durchflusszytometrie als FACS-Analysesteuerelemente. Die Autoren empfehlen, mindestens 10.000 Perlen + NK-Zellen zusammen zu lesen, eine Menge, die gut funktioniert hat. Diese Zahl kann jedoch je nach Denkbedingungen variieren. Daher sollte die kombinierte Anzahl von Perlen + NK-Zellen für jede Art von Experiment empirisch bestimmt werden. Darüber hinaus ist es wichtig, Experimente mit biologischen Triplicaten durchzuführen, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen und die Variabilität zwischen den verschiedenen Zellanzahlen zu berücksichtigen.</li>
	<li>Berechnen Sie die absolute Anzahl der migrierten NK92MI-Zellen mit dieser Formel: <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> wobei A = Anzahl der Zellen, B = Anzahl der Perlen, C = zugewiesene Perlenzahl des Loses (Anzahl der Zählperlen für die Durchflusszytometrie/50 l; in diesem Beispiel 49.500) und D = Volumen der Probe (L). ANMERKUNG: Wenn für die FACS-Analyse 300 l Probenvolumen (migrierte Zellen) mit 50 l Zählperlen für die Durchflusszytometrie verwendet wird, ist die absolute Anzahl der migrierten Zellen = 1.700 Zellen /3.300 Perlenereignisse x 49.500 Perlen/300 l = 84,975 Zellen/L. Die Berechnung sollte korrigiert werden, wenn die Probe verdünnt wird oder wenn ein anderes Volumen an FACS-Zählperlen verwendet wird.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Die hier beschriebenen Zytotoxizitäts- und Migrationsmethoden können verwendet werden, um die NK-Zellzytotoxizität gegenüber Krebszellen und NK-zellvermittelten Immun-Evasion-Mechanismen bei bösartigen Tumoren zu bewerten sowie therapeutische Wirkstoffe zu identifizieren, die die Aktivität/Funktion von NK-Zellen verbessern. Die Protokolle sind einfache, empfindliche, reproduzierbare und bevorzugte Alternativen zum klassischen Radioaktivitätsbasierten 51-Chrom-Freisetzungstest. Die Protokolle wurden speziell für den Einsatz in den meisten Laboratorien entwickelt, mit einfachen farbmetrischen, mikroskopischen oder FACS-basierten Auslesungen, die leicht zu interpretieren sind, sodass die Forscher zuverlässige Schlussfolgerungen ziehen können. Alle sind skalierbar für Screening-basierte Ansätze mit hohem Durchsatz. Obwohl die Protokolle im Kontext einer einzigen leberförmigen Tumorzelllinie vorgestellt werden, können sie leicht an andere Krebszelltypen und/oder andere nicht-krebskranke Zielzellen angepasst werden.
Während alle vorgestellten Methoden robust und reproduzierbar sind, können interexperimentelle Variationen mit verschiedenen Chargen von Krebszellen und NK-Zellen auftreten. Um sicherzustellen, dass die Ergebnisse die Schlussfolgerungen der Experimente genau unterstützen, ist es ratsam, das Experiment mindestens zweimal mit biologischen Triplicaten zu wiederholen.
Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die Wachstumsrate von NK92MI-Zellen langsam sein kann. Daher sollte für Experimente mit 50 oder mehr Proben im Voraus genügend NK92MI angebaut werden, um Verzögerungen zu vermeiden. Außerdem müssen alle in den Protokollen beschriebenen Kontrollen implementiert werden, um falsche und nicht reproduzierbare Ergebnisse zu vermeiden. Eine weitere Einschränkung des NK-Zytotoxizitäts-Assays ist, dass das Verhältnis von NK zu Krebszellen sowie die Inkubationszeit für jede Zielzelle optimiert werden muss. Zum Beispiel haben wir verschiedene Verhältnisse von Krebszellen zu NK-Zellen (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 und 1:80) für die Leberkrebszelllinien sowie mehrere Inkubationszeiten (2, 3, 4, 5 und 6 h) getestet. Basierend auf unseren Ergebnissen beobachteten wir die konsistentesten Ergebnisse mit 1:10 und 1:20 Verhältnissen von Krebszellen zu NK-Zellen und Inkubation für 3 h.
Darüber hinaus werden Krebszellen, die aus soliden Tumoren gewonnen werden, auf der Oberfläche der Kulturplatte anhaften und wachsen, während NK-Zellen in Suspension wachsen. Wenn die Inkubationszeit länger als 3 h ist, ist es ratsam, ultraniedrige Befestigung 96 Wellplatten zu verwenden, die Konsistenz und Reproduzierbarkeit zwischen Experimenten und biologischen Replikationen verbessern. Es ist auch wichtig zu beachten, dass NK-Zell-induzierte Zytotoxizitäts-Assays auch mit primären NK-Zellen durchgeführt werden können, die aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) isoliert sind. Allerdings gibt es bei solchen Experimenten einige Einschränkungen. Erstens können diese Experimente nicht so einfach skaliert werden wie bei NK92MI-Zellen. Zweitens kann eine Batch-zu-Charge-Variation der zytotoxischen Aktivität von NK-Zellen, die aus PMBCs isoliert sind, hinsichtlich der Reproduzierbarkeit und Interpretation der Ergebnisse problematisch sein. In ähnlicher Weise werden andere menschliche NK-Zelllinien in der Literatur beschrieben und könnten in diesen Arten von Experimenten verwendet werden, einschließlich NKL-Zellen29; Im Gegensatz zu NK-92MI-Zellen sind NKL-Zellen jedoch IL-2-abhängig und nicht kommerziell verfügbar.
Bei der Betrachtung der beschriebenen Calcein-AM-Experimente ist es wichtig zu beachten, dass Calcein AM nach dem Zelltod30in apoptotischen Körpern verbleibt. Daher sollte die Quantifizierung der Calcein-AM-Färbung sorgfältig durchgeführt werden, da sie zu einer Unterschätzung der NK-Zytotoxizität führen kann.
Ähnlich wie bei NK zellvermittelte Zytotoxizität spielt die Modulation der NK-Zellmigration durch Zytokine und andere Chemopviele eine wichtige Rolle bei der Regulierung der NK-Zellfunktion. Der hier beschriebene NK-Zellmigrationstest bietet eine einfache Plattform, um die NK-Zellmigration im Kontext eines Stimulus wie Chemokin oder Chemoattractant zu bewerten. Dieser Test kann verwendet werden, um Agenten zu bewerten, die die NK-Zellmigration entweder fördern oder stören können - also Dieenhancer und Repressoren der NK-Zellmigration identifizieren. Diese Methode kann auch nützlich sein, um die regulatorische NK-Zellmigration als Folge einer genetischen/epigenetischen Veränderungen (Upregulation oder Downregulation) oder durch medikamentöse Behandlung zu untersuchen.
Um die NK-Zellmigration genau zu messen, sollten nur wenige wichtige Schritte ausgeführt werden. Für alle Experimente mit konditioniertem Medium ist es wichtig, dass gleichwertige konditionierte Mittel sowohl unter Kontroll- als auch unter Behandlungsbedingungen verwendet werden, um genaue Messungen zu erhalten. Die Zeit der Inkubation wird mit gereinigten Chemoattractants und konditioniertem Medium variiert. Schließlich sind Transwell-Migrationstests gut etabliert und gelten als ausgezeichnete Methode zur Bewertung der NK-Zellmigration; Jedoch fehlt den homogenen Monokulturen, die in den Assays verwendet werden, die komplexe Physiologie von Geweben oder sogar 3D-Kulturen, die die Tumormikroumgebung genauer imitieren könnten.
Obwohl es einige Einschränkungen für die in diesem Artikel vorgestellten NK-Zellzytotoxizitätstests und NK-Migrationstests gibt, sind diese Assays auf eine breite Palette von immunologischen Studien anwendbar und bieten somit wichtige und zuverlässige Methoden zur Bewertung von NK-Zellen. und NK-Zellmodulatorische Immuntherapeutika.

Die Fähigkeit des menschlichen Körpers, nicht selbst zu identifizieren und Fremdkörper auszurotten, ist der Schlüssel zum menschlichen Überleben gegen Krankheitserreger und Bösartigen1. Die menschliche Immunantwort spielt die wichtigste Rolle in diesem Prozess2,3,4. Basierend auf den wichtigsten Eigenschaften und Funktionen kann das menschliche Immunsystem grob in zwei Hauptfunktionsgruppen eingeteilt werden: das adaptive Immunsystem und das angeborene Immunsystem. Das adaptive Immunsystem ist typischerweise spezifisch für einen bestimmten Erreger und hat ein immunologisches Gedächtnis und ist daher langanhaltend und ansprechbar für zukünftige Reinfektionen durch den gleichen Erreger5,6,7,8,9. Im Gegensatz dazu ist die angeborene Immunität in ihrer Zielausrottung viel umfassender und relativ unspezifisch. Daher dient die angeborene Immunantwort in der Regel als erste Linie der immunologischen Verteidigung10. Natürliche Killerzellen (NK) gehören zum angeborenen Immunsystem und machen 10 bis 15 % der gesamten zirkulierenden Lymphozyten11aus. NK-Zellen tilgen Zielzellen über zwei Hauptmechanismen. Erstens setzen NK-Zellen nach Bindung an Zielzellen, die aktivierende Liganden exdrücken, das membranstörende Protein Perforin und Serinproteasegranzyme durch Exozytose frei, die gemeinsam Apoptose in den Zielzellen12,13,14,15induzieren. Zusätzlich interagieren NK-Zellen, die FasL und Tumornekrose-Faktor-bezogene Apoptose-induzierenden Liganden (TRAIL) exezieren, mit Zielzellen, die Todesrezeptoren exdrücken (Fas/CD95), was zu einer caspaseabhängigen Apoptose16führt. Am wichtigsten ist, NK-Zellen erfordern keine Prästimulation, wie Antigen-Präsentation, um Pathogen-infizierte oder bösartige Zellen auszurotten; daher befinden sie sich in der Regel in einem killbereiten Zustand17,18. Um die Tumorentwicklung und -progression zu hemmen und Krebszellen auszurotten, müssen NK-Zellen zur Tumorstelle migrieren und einmal in der Tumormikroumgebung die Zielzellen identifizieren und angreifen.
In der Vergangenheit wurden NK-Zell-Effektor-Funktionen hauptsächlich durch Degranulation und Zytotoxizität s.a.19,20,21überwacht. NK-Zellzytotoxizität kann auch mit 51Chrom-Freisetzung assay22,23,24,25gemessen werden. Dieser Test hat jedoch einige spezifische Anforderungen, einschließlich der Notwendigkeit eines Gammazählers, und ist radioaktivitätsbasiert, was eine Schulung im Umgang mit und Entsorgung radioaktiver Materialien erfordert und ein Gewisses Risiko für den Benutzer darstellt. Daher wurden mehrere neue nicht-radioaktivitätsbasierte Assays entwickelt und eingesetzt, um die Aktivität von NK-Zellen zu untersuchen.
Hier beschreiben wir zwei solcher Protokolle, die kolorimetrische Milchdehydrogenase (LDH) messbasierte NK-Zell-vermittelte Zytotoxizitäts-Assay und Calceinacetoxymethyl (AM) Färbungsbasierte mikroskopische Methode zur Messung der NK-Zell-vermittelten Krebszellausrottung. Diese Assays erfordern nicht die Verwendung von Radioisotopen, sind einfach, empfindlich und identifizieren reproduzierbar Faktoren, die die NK-Zellfunktion modulieren. Da die NK-Zellfunktion nicht vollständig ausgewertet werden kann, ohne Änderungen bei der NK-Zellmigration zu überwachen, stellen wir außerdem eine auf Flow-Zytometrie basierende quantitative Methode zur Überwachung der NK-Zellmigration dar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra Centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH cytotoxic assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92MI cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKHEP-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable chambers</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells

Natürliche Killerzellen (NK) sind eine Teilmenge der zytotoxischen Lymphozytenpopulation des angeborenen Immunsystems und nehmen als erste Verteidigungslinie teil, indem sie pathogeninfizierte, bösartige und gestresste Zellen löschen. Die Fähigkeit von NK-Zellen, Krebszellen auszurotten, macht sie zu einem wichtigen Werkzeug im Kampf gegen Krebs. Mehrere neue immunbasierte Therapien werden für die Krebsbehandlung untersucht, die entweder auf die Verbesserung der Aktivität der NK-Zellen oder auf die Erhöhung der Empfindlichkeit von Krebszellen für die NK-Zell-vermittelte Ausrottung angewiesen sind. Um diese therapeutischen Ansätze effektiv zu entwickeln, sind jedoch auch kostengünstige In-vitro-Assays zur Überwachung der von NK zellvermittelten Zytotoxizität und Migration erforderlich. Hier stellen wir zwei In-vitro-Protokolle vor, die die Wirkung der NK-Zell-Zytotoxizität auf Krebszellen (oder andere Zielzellen) zuverlässig und reproduzierbar überwachen können. Diese Protokolle sind nicht radioaktivbasiert, einfach einzurichten und können für ein Screening mit hohem Durchsatz skaliert werden. Wir präsentieren auch ein auf Flow Cytometrie basierendes Protokoll zur quantitativen Überwachung der NK-Zellmigration, das auch für ein Hochdurchsatz-Screening skaliert werden kann. Zusammen können diese drei Protokolle verwendet werden, um wichtige Aspekte der NK-Zellaktivität zu überwachen, die für die Fähigkeit der Zellen, dysfunktionale Zielzellen auszurotten, notwendig sind.

NK-Zellzytotoxizitäts-Assays und NK-Zellmigrationstest wurden mit der SK-HEP-1-Lebertumorzelllinie als Modellsystem durchgeführt. Um die NK-Zellzytotoxizität mit dem LDH-Assay zu messen, wurden SK-HEP-1-Zellen, die entweder eine unspezifische (NS) shRNA oder shRNA-Targeting-Transkriptionsfaktor 4 (ATF4) exzättierten, mit NK92MI-Zellen in einer 96-Well-Platte für 3 h inkubiert (Abbildung 1A). ATF4 hat sich bisher gezeigt, nk Zellzytotoxizität durch Upregulating der aktivierenden Liganden ULBP128zu regulieren. Die LDH-Aktivität im Zusammenhang mit der tötung von NK-Zellen wurde kolorimetrisch gemessen, und die prozentuale Zytotoxizität wurde mit der in Protokoll 1 beschriebenen Formel berechnet. ATF4-Knockdown reduzierte die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität signifikant im Vergleich zu NK-Zellen, die NS shRNA exdrücken (Abbildung 1B-D). Wir haben auch die ZYtotoxizität der NK-Zelle mit einem Calcein AM-Färbe-basierten Assay gemessen. Zu diesem Zweck wurden SK-HEP-1-Zellen, die NS shRNA oder ATF4-targeting shRNAs exdrücken, mit Calcein AM beschriftet und mit NK92MI-Zellen in 96 Wellplatten für 4 h inkubiert, wie in Abbildung 2Adargestellt. Nach der Inkubation wurden Bilder von Calcein-AM-positiven Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem FITC/GFP-Filter erfasst. Zellen, die von NK-Zellen abgetötet werden, werden durch diesen Ansatz nicht erkannt, da sie den Calcein-AM-Farbstoff nicht mehr behalten. Wie in Abbildung 2B,Cdargestellt, wird die Anzahl der Calcein-AM-positiven SK-HEP-1-Zellen nach Co-Kultur mit NK92MI-Zellen im Vergleich zu SK-HEP-1-Zellen, die ohne NK92MI-Zellen angebaut wurden, verringert. Wie erwartet reduzierte jedoch der ATF4-Knockdown über shRNA die zellvermittelte TÖTUNG von SK-HEP-1-Zellen, beobachtet durch eine größere Anzahl von Calcein AM-positiven Zellen (Abbildung 2B,C). Daher zeigten sowohl LDH-basierte als auch Calcein-AM-Assays konsistente Ergebnisse und bestätigten, dass ATF4-Knockdown die NK-vermittelte Krebszellzytotoxizität reduziert. Beide dieser Assays reichen aus, um die mit NK zellvermittelte Zytotoxizität zu bewerten; Es wird jedoch empfohlen, beide Methoden zu verwenden, um sowohl die Stringenz als auch das Vertrauen in die Ergebnisse zu erhöhen.
Wir präsentieren auch die Ergebnisse eines 24 Well NK Zellmigration Assay. NK92MI-Zellen wurden in serumfreiem NK92MI-Medium in der oberen Kammer resuspendiert, und Chemokin, CC-Motiv, Ligand 2 (CCL2) wurde der unteren durchlässigen Kammer hinzugefügt. Die NK-Zellmigration wurde wie in Abschnitt 3 beschrieben (Abbildung 3A) beschrieben. Die Anzahl der migrierten NK92MI-Zellen wurde quantifiziert, indem Zählperlen für die Durchflusszytometrie hinzugefügt und anschließend die FACS-Analyse durchgeführt wurde. Wie in Abbildung 3B-Cdargestellt, war die Anzahl der NK92MI-Zellen, die in Richtung CCL2-haltiges Medium migriert waren, im Vergleich zum Kontrollmedium signifikant gestiegen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> Abbildung 1: Farbmetrischer LDH-aktivitätsbasierter NK-Zell-vermittelter Zytotoxizitätstest. (A) Schematisch, der die wichtigsten Schritte des kolorimetrischen LDH-Aktivitäts-basierten NK-Zellzytotoxizitäts-Assays darstellt. (B,C) Die ATF4-Expression wurde in SK-HEP-1-Zellen analysiert, die entweder unspezifische (NS) shRNA oder shRNAs exemittieren, die ATF4 durch quantitative RT-PCR und Western Blotting ins Visier nehmen. (B) Der relative ATF4-mRNA-Gehalt wird nach normalisierter AUF ACTINB-Ebene in SK-HEP-1-Zellen gezeigt, die NS shRNA oder ATF4 shRNAs exemitzen. (C) ATF4- und ACTINB-Proteinspiegel in SK-HEP-1-Zellen, die NS shRNA oder ATF4 shRNAs exdrücken. (D) DIE zellvermittelte Zytotoxizität wurde in SK-HEP-1-Zellen analysiert, die entweder NS shRNA oder ATF4 shRNAs nach der LDH-Methode exeklierten. Prozent (%) Gezeigt wird eine mit NK-Zell vermittelte Zytotoxizität. Die Daten werden als Mittelwert dargestellt: SEM; ns, nicht signifikant; **p < 0.01, ***p < 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> Abbildung 2: Calcein AM-Färbebasiertemikroskope Methode zur Messung der NK-Zell-vermittelten Zytotoxizität. (A) Schematisch, der die wichtigsten Schritte der kalzein-AM-Färbemethode zur Messung der kN-zellvermittelten Zytotoxizität darstellt. (B) DIE mit der Zellvermittelte Zytotoxizität von NK wurde in SK-HEP-1-Zellen analysiert, die entweder NS shRNA oder ATF4 shRNAs nach der Calcein-AM-Methode exeklierten. Repräsentative Bilder werden angezeigt. Skalenbalken = 200 m. (C) Prozent der Calcein AM-positiven Zellen für das Experiment, das in Panel B vorgestellt wurde. **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> Abbildung 3: FACS-basierter quantitativer NK-Zellmigrationstest. (A) Schematisch, der die wichtigsten Schritte des FACS-basierten NK-Zellmigrationstestes darstellt. (B,C) NK Zellmigration Assay wurde durchgeführt, nachdem 50 ng CCL2 in die untere Kammer der 24 Well-Platte hinzugefügt. (B) Repräsentative NK-Zellmigrationspunktdiagramme für Steuerelement- oder CCL2-behandelte Kulturmedien werden angezeigt. (C) DIE NK-Zellmigrationsdaten (Mittelwert SEM) werden für das experimentierte Inteil B. ***p < 0.001 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

Die Ausweichung von natürlichen Killer (NK) zellvermittelten Ausrottungen durch Krebszellen ist wichtig für die Krebsinitiierung und Progression. Hier stellen wir zwei nicht-radioaktivitätsbasierte Protokolle zur Bewertung der mit NK zellvermittelten Zytotoxizität gegenüber lebertumorzellen vor. Darüber hinaus wird ein drittes Protokoll zur Analyse der NK-Zellmigration vorgestellt.

Messung der natürlichen Killerzell-vermittelten Zytotoxizität und Migration im Kontext von leberassoziierten Tumorzellen

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Wir werden heute zwei Protokolle demonstrieren, die zeigen, wie man die Funktion der NK-Zellen untersucht. Es gibt zwei Schlüsselaspekte der NK-Zellfunktion, die in der Lage ist, Tumorzellen auszurotten und es ist in der Lage, in Tumor-Mikro-Umgebung zu migrieren. Diese beiden Protokolle zeigen wir NK-Zell-Fähigkeit, Tumorzellen auszurotten und es ist auch in der Lage, in Tumor-Mikro-Umgebung zu migrieren.Die beiden Protokolle, die wir heute demonstrieren werden, sind einfach, erfordern keine Verwendung von Radioaktivität und können in den meisten Laboren etabliert werden, die die Fähigkeit haben, Molekularbiologie und Zellkulturarbeit zu leisten. Suresh Bugide und Suresh Chava, zwei Postdoktoranden in meinem Labor, werden diese beiden Protokolle heute demonstrieren. Zwei bewerten NK-Zell vermittelte Zytotoxizität mit LDH, zuerst wachsen eine menschliche Leberkrebszelllinie zu 70-80%Konfluenz in einer 100-Millimeter-Zellkultur Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Waschen Sie am Tag des Experiments die Kultur mit fünf Millilitern PBS, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter 0,25% Trypsin EDTA behandeln, bis sich die Zellen vom Plattenboden gelöst haben. Wenn eine Einzelzellsuspension erhalten wurde, fügen Sie den Zellen 10 Milliliter Zellkulturmedium hinzu und übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein 15 Milliliter konisches Rohr. Waschen Sie das Zellpellet mit fünf Millilitern PBS, bevor Sie die Zellen mit einem Mal 10 bis zu den 5. Zellen pro Milliliter frischer Kulturmediumkonzentration wieder aufhängen.Als nächstes samen 100 Mikroliter der Ziel-Menschlichen Leberkrebszellen pro Brunnen in Dreifach-Pro-Behandlungsbedingung in einer 96-Well-Platte und fügen Sie ein mal 10 zu den 5. menschlichen NK-Zellen in 100 Mikroliter medium zu jeder Zielzelle gut hinzu. Dann legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für drei Stunden. Am Ende der Inkubation pellet die Zellen durch Zentrifugation und überträgt 100 Mikroliter Überstand aus jedem Brunnen in einzelne Brunnen einer neuen 96-Wellplatte.Fügen Sie 50 Mikroliter LDH-Substrat zu jedem Brunnen mit gründlichem Mischen und inkubieren Sie die Platte für 20 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt. Am Ende der Inkubation die Reaktion mit 50 Mikrolitern Stopplösung stoppen und sofort die Absorption eines Plattenlesers bei 490 und 680 Nanometern messen. Verwenden Sie dann die Formel, um die prozentuale NK-Zellzytotoxizität zu berechnen.Zur Beurteilung der nk-Zell-vermittelten Zytotoxizität mit Calcein AM nach dem Anbau menschlicher Leberkrebszelllinienzellen zu einer 70-80%-Konfluenz, wie gezeigt, suspendieren die Zellen in drei Milliliters serumfreiem DMEM erneut und kennzeichnen die Zellen mit 1,5 Mikrolitern 10 Millimolar Calcein AM-Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Zellen durch Zentrifugation sammeln und die Zellen zwei Mal mit fünf MilliliterPBS pro Waschgang waschen. Setzen Sie die Zellen bei einer zeitgemäßen 10 bis 5. Zelle pro Milliliter Kulturmediumkonzentration wieder aus und fügen Sie jedem Brunnen einer 96-Well-Platte in Dreifacharbeit pro Behandlungszustand 100 Mikroliter Zellen hinzu.Als nächstes, einmal 10 bis 5. menschliche NK-Zellen in 100 Mikroliter Kulturmedium zu jedem Brunnen der Zielzellen und legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für vier Stunden. Erfassen Sie nach dem Ende der Inkubation mindestens 10 verschiedene Bildfelder der Calcein AM-positiven Zellen für jede Replikation jeder Behandlungsbedingung auf einem Fluoreszenzmikroskop bei einer 10-fachen Vergrößerung. Berechnen Sie dann die prozentuale Zytotoxizität mit der Formel.Um die NK-Zellmigration als Reaktion auf chemotaktische Reize zu messen, sammeln menschliche NK-Zellen aus einer 70-80%-Konfluentkultur und setzen die Zellen mit einer 2,5-mal 10-fach entitobiszur 6. Zelle pro Milliliter serumfreier NK-Zellkultur mittlerer Konzentration wieder aus. Als nächstes fügen Sie 600 Mikroliter serumfreies Medium, das die NK-Zellchemo-Attraktion von Interesse pro Brunnen enthält, und legen Sie einen Kultureinsatz mit einem Durchmesser von 6,5 Millimetern mit fünf Mikrometer Poren in jeden Brunnen des Mediums. Dann fügen Sie 100 Mikroliter NK-Zellen in das obere Fach jedes Einsatzes und legen Sie die Platte in der Zellkultur Inkubator für vier Stunden.Übertragen Sie am Ende der Inkubation das gesamte Volumen der nicht haftenden migrierten Zellen vom Boden jedes Bohrplatzes in einzelne fünf Milliliter FACS-Röhren und fügen 50 Mikroliter einer vorgegebenen Anzahl von Durchflusszytometrie-Zählperlen in jedes Rohr ein. Anschließend bewerten Sie mit einem Durchflusszytometer jede Zellprobe gemäß den standardmäßigen zytometrischen Analyseprotokollen des Durchflusses und berechnen Sie die absolute Anzahl der migrierten NK-Zellen mit der Formel. ATF4-Knockdown reduziert die MIT NK-Zell vermittelte Zytotoxizität signifikant im Vergleich zu NK-Zellen, die unspezifische kurze Haarnadel-RNA exdrücken.Nach der Färbung mit Calcein AM nimmt die Anzahl der lebensfähigen menschlichen Leberkrebszellen nach der Kokultur mit menschlichen NK-Zellen im Vergleich zu menschlichen Leberkrebszellen ab, die ohne NK-Zellen kultiviert werden. Wie erwartet, ATF4 Knockdown über kurze Haarnadel-RNA reduziert NK zellvermittelte Tötung von menschlichen Leberkrebszellen, wie durch eine größere Anzahl von Calcein AM-positive Zellen in diesen Kulturen belegt. Darüber hinaus wird eine signifikant höhere Menge an NK-Zellmigration als Reaktion auf Chemokin-haltiges Medium im Vergleich zu NK-Zellen beobachtet, die einem Kontrollmedium ohne Chemokin ausgesetzt sind.Für NK-Zellzytotoxizität bewerten ist es wichtig, unsere Anstrengung und Zielverhältnisse und Inkubationszeit für jede Krebszelllinie zu standardisieren. Sobald Standards identifiziert und validiert sind, werden in vitro-Evaluierungen durch In-vivo-Mäuseexperimente ergänzt, um ihre Rolle bei der Ausrottung von Tumorzellen weiter zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Medicine

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Die Messung und Behandlung von Unterdrückung in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Forschung

Medizin

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Menschliche neuroendokrinen Tumor-Zelllinien als dreidimensionales Modell für das Studium der menschlichen neuroendokrinen Tumor-Therapie

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Einer präklinischen Mausmodell der Lebermetastasen

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

Monitoring of Systemic and Hepatic Hemodynamic Parameters in Mice

Überwachung der System und Leber hämodynamischen Parameter in Mäuse

The use of mouse models in experimental research is of enormous importance for the study of hepatic physiology and pathophysiological disturbances. ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studieren Bauchspeicheldrüsenkrebs Stammzelleigenschaften für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Isolierung und Vermehrung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Maus Cancer

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Die Injektion von syngenen murinen Melanomzellen ihre metastatische Potential in der Lunge zu bestimmen

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Optimierte Analyse von<em&gt; In Vivo</em&gt; und<em&gt; In Vitro</em&gt; Hepatosteatose

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...