Name: measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00
Duration: 6 min 55 s
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我々は、国立衛生研究所からの助成金を感謝して認める:R01CA195077-01A1(NW)、R01CA200919-01(NW)、および1R01 CA218008-01A1(NW)。我々はまた、国防総省がW81XWH1910480およびW81XWH-18-1-0069をNWに資金援助することを認める。

1. NK細胞および肝腫瘍細胞の培養培地の調製
<ol><li>ヒトの天然キラー細胞(例えば、NK92MI)およびヒト肝臓癌細胞株(例えば、SK-HEP-1)を用いる。</li>
	<li>NK92MIヒトNK細胞のNK細胞培養培地を、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドを含まない最小必須培地イーグルαの500mLに加えて、示された最終濃度に加えて、0.02mM葉酸(100mM葉酸の100μL)、0.2mMミオイノシトール(500mMミノロシトール(500mM)を調製する 0.1 mM β-メルカプトエタノール(14.3 M β-メルカプトエタノールの3.5μL)、2 mM L-グルタミン(200 mM L-グルタミンの5 mL)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(100倍ペニシリン/ステレプトマイシンの5 mL)、12.5%のボバチカン血清(FBS)、および12.5%の馬の血清。0.22 μm滅菌ろ過ユニットを使用して混合およびフィルター滅菌し、4 °Cで保管します。</li>
	<li>2 mM L-グルタミンを含む高グルコースDulbeccoの変性イーグル培地(DMEM)に10%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを加えて、肝腫瘍細胞株SK-HEP-1の培養培地を準備する。</li>
</ol>2. 色分性LDH測定ベースNK細胞媒介性細胞傷害アッセイ
<ol><li>CO2インキュベーターで37°Cで5%のCO2で100mm細胞培養ペトリ皿で70-80%の結合にSK-HEP-1細胞を成長させます。1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の5mLを有する最初の洗浄細胞を用いて単細胞懸濁液を生成し、続いて1つの細胞懸濁液が生成されるまでCO2インキュベーターで37°Cで5%CO2で0.25%トリプシンEDTAの1mLをインキュベートすることによって、単一細胞懸濁液を生成する。 注:NK細胞活性は、がん細胞におけるNK細胞活性化リガンドの発現変化により、ストレスを受けたがん細胞によって誘導され得る。したがって、健康でサブコンフルエントな癌細胞は、正確な結果を得るための使用が必要である。また、NK細胞受容体およびリガンドはトリプシン26、27に敏感であり得る点にも注意することが重要である。したがって、トリプシン化プロトコルは慎重に最適化されるべきであり、過度のトリプシン化は避けるべきである。</li>
	<li>トリプシン後、15 mL無菌円錐形の遠心管に160 x gでSK-HEP-1培養培地と遠心分離機を10 mL加えます。5 mLのPBS1xで細胞ペレットを洗浄し、5mLの培養液で再懸濁する。</li>
	<li>並行して、15 mLの無菌遠心管でNK92MI細胞を160 x gで3分間遠心分離します。5 mLの1x PBSで細胞ペレットを洗浄し、NK92MI細胞培地の5mLで再懸濁します。 注:NK92MI細胞はNK細胞培養培地で増殖し、同様にステップ2.1で説明したとおりに得られる。</li>
	<li>SK-HEP-1およびNK92MI細胞を、ヘモサイトメーターまたは使用可能な自動細胞カウンターを使用してカウントします。</li>
	<li>SK-HEP-1細胞(標的細胞)(1 x 104/100 μL/well)およびNK92MI細胞(エフェクター細胞)(1:105/100 μL/ウェル)の比率を1:10ターゲット:エフェクターおよび種子を96ウェルプレートの三重ウェルに添加する。</li>
	<li>95%の空気と5%のCO2の雰囲気で37°Cで96ウェルプレートを3時間インキュベートします。インキュベーション後、室温で5分間450 x gの遠心分離プレート。</li>
	<li>細胞ペレットを乱すことなく、各ウェルから100μLの上清を集め、新しい96ウェルプレートでウェルに移します。</li>
	<li>50 μLのLDH基板を加え、よく混ぜ、室温で20分間、暗闇の中でプレートをインキュベートします。</li>
	<li>50 μLの停止溶液(pH4.7で50%ジメチルホルムアミドと20%ドデシル硫酸ナトリウム)を加えて反応を停止します。プレートリーダーを使用して、プレートの吸光度を 490 nm および 680 nm ですぐに測定します。</li>
	<li>490 nmの吸光度から680nmの吸光度を差し引いた。パーセント (%)NK細胞細胞毒性は以下の式を用いた。 <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> ここでLDH実験(エフェクター+標的細胞)はNK92MI細胞およびSK-HEP-1細胞の吸光度であり、LDHエフェクター細胞はNK92MI細胞単独の吸光度であり、LDHはSK-HEP-1細胞単独の吸光度であり、LDH最大はSK-HEP-1の吸光度であるリシスバッファーを有する細胞。 注:血清干渉を軽減するには、常に以下のコントロールを使用してください:標的細胞単独(SK-HEP-1)、エフェクター細胞単独(NK92MI)、完全なリシスコントロールとしてのリシスバッファーを有する標的細胞、標的細胞培地、NK92MI培地、およびターゲット細胞培地および1:1の比率でNK92MI培地。</li>
</ol>3. カルセインAM染色法によるNK細胞媒介性細胞毒性の測定方法
<ol><li>SK-HEP-1細胞を70-80%の合流性に培養する。1x PBSの5 mLを用いた最初の洗浄細胞と、0.25%トリプシン-EDTAの1 mLのインキュベーションによって単細胞懸濁液を生成する。</li>
	<li>遠心分離機 SK-HEP-1 細胞 1 mL 無菌遠心管で 160 x gで 3 分間. 3 mL の無血清 DMEM でペレットを再懸濁します。.</li>
	<li>SK-HEP-1細胞に1.5μLのカルセインAM溶液(10 mM)を加え、室温で30分間インキュベートします。遠心分離機カルシンAM標識SK-HEP-1細胞 160 x gで 3 分間 15 mL 無菌遠心管内.</li>
	<li>細胞を1x PBSの5 mLで2回洗浄し、過剰カルセインAM色素を除去した。</li>
	<li>並行して、15 mL無菌遠心管で160 x gで160 x gでNK92MI細胞を遠心分離します。細胞ペレットを1x PBSの5 mLで1回洗浄し、NK92MI細胞培地の5mLで再懸濁します。</li>
	<li>ヘモサイトメーターまたは自動細胞カウンターを用いて、AM-HEP-1細胞およびNK92MI細胞を数え出す。</li>
	<li>培地中にSK-HEP-1細胞を1 x 105細胞/mLで再懸濁し、NK細胞培地中の1 x 106細胞/mLでNK92MI細胞を培養培地に再懸濁した。</li>
	<li>プレートカルシンAM標識SK-HEP-1細胞(標的細胞)(1 x 104/100 μL/ウェル)NK92MI細胞(エフェクター細胞)(1 x 105/100 μL/well)(1:10ターゲット:エフェクター比)あたりウェル当たり96ウェルプレート内のウェル。</li>
	<li>95%の空気と5%のCO2の雰囲気の37°Cで96ウェルプレートを4時間インキュベートします。インキュベーション後、10倍の倍率で蛍光顕微鏡を用いてカルセインAM標識細胞の蛍光画像を撮影します。各治療条件に対して、各レプリケートの少なくとも10の異なるフィールドをキャプチャします。</li>
	<li>反復ごとに10個の画像をランダムに選択し、NK92MI細胞の有無にかかわらずインキュベートされたカルセインAM陽性標識標的細胞をカウントします。以下の式を用いて、% 細胞毒性を計算する。 <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> 注:コントロールとして、完全なリシスコントロールとしてNK92MI細胞と完全にリセにされたターゲットセルのないターゲット細胞を使用してください。完全なリシスの場合、細胞を0.5%トリトンX-100で1時間(200μLの培養培地で5%トリトンX-100の20μL)にインキュベートします。</li>
</ol>4. NK細胞移動アッセイ
<ol><li>15 mLの無菌遠心管でNK92MI細胞と遠心分離器細胞を160 x gで3分間成長させます。</li>
	<li>5 mLの1x PBSで細胞ペレットを2回洗浄し、無血清NK92MI細胞培地の3mLで細胞を再懸濁した。ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用してNK92MI細胞をカウントします。</li>
	<li>トランスウェル透過チャンバ上部のコンパートメント(直径6.5 mmの挿入物と5μmの孔サイズ)にプレートNK92MI細胞(2.5 x 105セル/100 μL/ウェル)が入っています。</li>
	<li>底部チャンバーには、NK細胞ケモアタトリクス特性(例えば、コンディショニング培地、ケモカイン、サイトカイン)について試験される無血清培地含有物質を0.6mL添加する。 注:コンディショニングされた培地を調製する場合、移行アッセイの血清タンパク質からの干渉を排除するために、血清を添加せずに還元血清培地を使用してください。</li>
	<li>37 °Cで24の井戸透過性チャンバーを4時間インキュベートします。4時間後、下部チャンバーから非接着および移行NK92MI細胞を収集し、蛍光活性化細胞選別(FACS)チューブに移し、さらに分析する。 注:培養時間は、標的細胞の種類、ならびに標的細胞によって産生されるケモカインの量および運動薬によって異なる場合がある。したがって、この時間は、各細胞型、ケモカイン、および実験について経験的に決定されるべきである。</li>
	<li>移行したNK細胞を含む各チューブに50μLの量でフローサイトメトリー用の所定数のカウンティングビーズを加える。FACSベースの自動セルカウンティングが可能なフローサイトメーターを使用して、300μL/ウェルセル懸濁液の体積を評価します。 注:使用前に、使用前にフローサイトメトリー用のカウントビーズを混合またはボルテックス混合して、実験変動を最小限に抑えるために一定の数のビーズを使用します。逆ピペッティングは、精度を維持するためにカウントビーズを使用することをお勧めします。FACS分析制御として、フローサイトメトリーにはNK細胞とカウンティングビーズのみを使用します。著者らは、少なくとも10,000個のビーズ+NK細胞を組み合わせて読むことを推奨している。ただし、この数は実験条件によって異なる場合があります。したがって、ビーズ+NK細胞の組み合わせ数は、実験の種類ごとに経験的に決定されるべきである。さらに、生物学的トリプリケートを使用した実験を行い、統計的に有意な結果を得て、異なる細胞数の間の変動を考慮することが重要です。</li>
	<li>次の式を使用して、移行した NK92MI セルの絶対数を計算します。 <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> ここで、A = 細胞数、B = ビーズの数、C = ロットのビード数(フローサイトメトリー/50 μLのカウントビード数、この例では49,500個)、およびD = サンプルの体積(μL)が割り当てられます。 注:フローサイトメトリー用に50μLのカウントビーズを使用してFACS分析に300μLのサンプル量(移行した細胞)を使用する場合、移行した細胞の絶対数は1,700個のセル/3,300ビーズイベントx49,500ビーズ/300μL/ 84.975セル/μLです。サンプルが希釈されている場合、または異なる量の FACS カウントビーズが使用される場合は、計算を修正する必要があります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+and+other+innate+lymphoid+cells+in+cancer.">Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).</li><li>Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. 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著者たちは開示するものは何もない。

ここで説明する細胞毒性および移行方法は、悪性腫瘍における癌細胞およびNK細胞媒介性免疫回避機構に対するNK細胞細胞毒性を評価し、NK細胞活性/機能を高める治療薬を同定するために使用することができる。プロトコルは、シンプルで、感度が高く、再現可能で、古典的な放射能ベースの51クロム放出アッセイに代わるものが好ましい。プロトコルは、特に、ほとんどの研究所で使用するために容易に適応できるように設計されており、簡単な色素、顕微鏡、またはFACSベースの読み出しが解釈しやすく、研究者は信頼できる結論に達することができます。ハイスループットスクリーニングベースのアプローチには、すべてスケーラブルです。プロトコルは単一の肝腫瘍細胞株の文脈で提示されるが、それらは他の癌細胞タイプおよび/または他の非癌標的細胞に容易に適合させることができる。
提示されたすべての方法は堅牢で再現性がありますが、異なる癌細胞とNK細胞のバッチで実験間変動が発生する可能性があります。実験の結論を正確に裏付ける結果を得るためには、生物学的トリプリケートを用いて少なくとも2回実験を繰り返すことをお勧めします。
この方法の制限は、NK92MI細胞の増殖速度が遅くなることである。そのため、50個以上のサンプルを用いた実験では、遅延を防ぐために十分な数のNK92MIを事前に増やすべきである。また、プロトコルに記述されているすべてのコントロールは、偽りおよび再現不可能な結果を避けるために実装する必要があります。NK細胞毒性アッセイの別の制限は、NK対癌細胞比、ならびにインキュベーション時間が、各標的細胞に対して最適化されなければならないということである。例えば、肝がん細胞株に対するNK細胞に対するがん細胞の比率(1:5、1:10、1:20、1:40、1:80)と、マルチインキュベーション時間(2、3、4、5、6時間)を試験しました。我々の結果を基に、1:10と1:20のがん細胞とNK細胞の比率と3時間のインキュベーションで最も一貫した結果を観察しました。
また、固形腫瘍に由来するがん細胞は、培養板の表面に付着して増殖し、一方NK細胞は懸濁液中で増殖します。インキュベーション時間が3時間より長い場合、実験と生物学的複製の間の一貫性と再現性を向上させる超低アタッチメント96ウェルプレートを使用することをお勧めします。また、NK細胞誘導性細胞傷害性アッセイは、末梢血単核細胞(PBMC)から分離した一次NK細胞を用いて行うことも可能であることに注意することも重要である。しかし、そのような実験には幾つかの制限がある。まず、これらの実験はNK92MI細胞ほど簡単にスケーリングできません。第二に、PMBCから分離したNK細胞の細胞傷害活性のバッチ−バッチ変動は、再現性および結果の解釈の点で問題となる可能性がある。同様に、他のヒトNK細胞株は、文献に記載されており、NKL細胞29を含むこれらのタイプの実験に使用することができる。しかし、NK-92MI細胞とは異なり、NKL細胞はIL-2依存性であり、市販されていない。
記載されているカルセインAM実験を検討する場合、細胞死後のAMカルセインAMは細胞死後30に残ることを知ることが重要である。したがって、カルセインAM染色の定量は、NK細胞毒性の過小評価につながる可能性があるため、慎重に行う必要があります。
NK細胞媒介性細胞毒性と同様に、サイトカインおよび他のケモ惹起物質によるNK細胞遊走の調節は、NK細胞機能の調節において重要な役割を果たしている。ここで説明するNK細胞移動アッセイは、ケモカインやケモアタビ剤などの刺激のコンテキストでNK細胞の移動を評価するための簡単なプラットフォームを提供します。このアッセイは、NK細胞の移動を促進または妨害することができる薬剤を評価するために使用することができる - したがって、NK細胞の遊入のエンハンサーおよびリプレッサーを同定する。この方法は、遺伝的/エピジェネティックな変化(上方制御または下方制御)の結果として、または薬物治療のために生じるNK細胞移動調節能力を研究するのにも有用である。
NK細胞の移動を正確に測定するために、従うべき重要なステップはほとんどありません。すべての条件付き培地を用いた実験の場合、正確な測定を得るためには、対照条件と処理条件の両方から同等の条件付き培地を使用することが重要です。インキュベーションの時間は、精製された化学誘引物質および調合された培地で変化する。最後に、トランスウェル移行アッセイは十分に確立されており、NK細胞の移動を評価する優れた方法と考えられています。しかし、アッセイに用いられた均質な単一培養は、組織の複雑な生理学や、腫瘍の微小環境をより正確に模倣する可能性のある3D培養物を欠いている。
したがって、本稿で紹介したNK細胞傷害性アッセイおよびNK移行アッセイには幾分制限があるが、これらのアッセイは広範囲の免疫学的研究に適用可能であり、したがってNK細胞を評価する重要で信頼性の高い方法を提供する。機能とNK細胞変調免疫治療。

非自己を識別し、異物を根絶する人体の能力は、病原体および悪性腫瘍に対する人間の生存の鍵である1.ヒト免疫応答は、このプロセス2、3、4において最も重要な役割を果たしている。主要な特性と機能に基づいて、人間の免疫システムは、適応免疫系と自然免疫系の2つの主要な官能グループに大きく分類することができます。適応免疫系は、典型的には所定の病原体に特異的であり、免疫学的記憶を有し、したがって、同じ病原体5、6、7、8、9による将来の再感染に対して長期的かつ応答性である。対照的に、自然免疫は、その標的根絶においてはるかに広く、比較的非特異的である。したがって、典型的には、自然免疫応答は、免疫学的防御10の第一線として機能する。ナチュラルキラー(NK)細胞は自然免疫系に属し、循環リンパ球全体の10〜15%を表す11。NK細胞は、2つの主要なメカニズムを介して標的細胞を根絶する。まず、活性化リガンドを発現する標的細胞に結合すると、NK細胞は、エキソサイトーシスを介して膜破壊タンパク質パープロリンおよびセリンプロテアーゼの顆粒を放出し、これは標的細胞12、13、14、15においてアポトーシスを共同で誘導する。さらに、FasLおよび腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)を発現するNK細胞は、死性受容体を発現する標的細胞(Fas/CD95)と相互作用し、カスパーゼ依存性アポトーシス16に至る。最も重要なことは、NK細胞は、病原体感染細胞または悪性細胞を根絶するために、抗原提示などの事前刺激を必要としないことです。したがって、通常、それらはすぐに殺す状態17、18です。腫瘍の発生と進行を阻害し、癌細胞を根絶するためには、NK細胞は腫瘍部位に移行し、腫瘍微小環境に入ると標的細胞を同定して攻撃しなければならない。
これまで、NK細胞エフェクター機能は、主として脱顆粒および細胞毒性アッセイ19、20、21によってモニタリングされた。NK細胞傷害性は、51クロム放出アッセイ22、23、24、25によって測定することもできる。しかし、このアッセイにはガンマカウンターの必要性を含むいくつかの特定の要件があり、放射能ベースであり、放射性物質の取り扱いと処分の訓練を必要とし、ユーザーにリスクのレベルをもたらします。したがって、いくつかの新しい非放射活性ベースのアッセイが開発され、NK細胞活性を研究するために採用されている。
ここでは、このような2つのプロトコルを、NK細胞媒介性細胞傷害アッセイ法とカルセインアセトキシメチル(AM)染色法を用いてNK細胞介在癌細胞根絶を測定する測定系のNK細胞性細胞傷害性アッセイ法を用いて説明する。これらのアッセイは、放射性同位元素の使用を必要とせず、簡単で敏感であり、NK細胞機能を調節する因子を再現的に同定する。また、NK細胞の移動の変化をモニターしないとNK細胞の機能を十分に評価することはできないため、NK細胞の移動をモニタリングするフローサイトメトリーベースの定量法も紹介しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra Centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH cytotoxic assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92MI cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKHEP-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable chambers</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells

ナチュラルキラー(NK)細胞は、自然免疫系の細胞傷害性リンパ球集団のサブセットであり、病原体感染細胞、悪性細胞、ストレス細胞を除去することによって防御の第一線として参加する。NK細胞ががん細胞を根絶する能力は、がんとの闘いにおいて重要なツールとなります。いくつかの新しい免疫ベースの治療法は、NK細胞活性を高めるか、NK細胞媒介性根絶に対する癌細胞の感受性を高めることに依存する癌治療のために調査中である。しかし、これらの治療的アプローチを効果的に開発するためには、NK細胞媒介性細胞傷害性および移行をモニターするための費用対効果の高いインビトロアッセイも必要である。ここでは、がん細胞(または他の標的細胞)に対するNK細胞細胞傷害の影響を確実かつ再現的に監視できる2つのin vitroプロトコルを紹介します。これらのプロトコルは、非放射能ベースで、セットアップが簡単で、ハイスループットスクリーニングのためにスケールアップできます。また、NK細胞の移動を定量的にモニタリングするフローサイトメトリーベースのプロトコルも紹介し、ハイスループットスクリーニングのためにスケールアップすることもできます。これらの3つのプロトコルをまとめて、細胞が機能不全の標的細胞を根絶する能力に必要なNK細胞活性の主要な側面を監視するために使用することができる。

NK細胞傷害性アッセイおよびNK細胞遊入アッセイは、モデル系としてSK-HEP-1肝腫瘍細胞株を用いて行った。LDHアッセイを用いてNK細胞毒性を測定するために、非特異的(NS)shRNAまたはshRNAを発現するSK-HEP-1細胞は、転写因子4(ATF4)を活性化し、NK92MI細胞を96ウェルプレートに3hインキュベートした(図1A)。ATF4は、活性化リガンドULBP128をアップレギュリングすることによってNK細胞細胞傷害を調節することが以前に示されている。NK細胞媒介標的細胞死滅に関連するLDH活性を、色調的に測定し、プロトコル1に記載された式を用いて計算された細胞傷害率を求めた。ATF4ノックダウンは、NS shRNAを発現するNK細胞と比較してNK細胞媒介性細胞傷害性を有意に低下させた(図1B-D)。また、カルセインAM染色法によるNK細胞毒性の測定も行った。この目的のために、NS shRNAまたはATF4-ターゲティングshRNAを発現するSK-HEP-1細胞をカルセインAMで標識し、図2Aに示すように、96ウェルプレートにNK92MI細胞をインキュベートした。インキュベーション後、FITC/GFPフィルターを用いた蛍光顕微鏡により、カルセインAM陽性細胞の画像を撮影した。NK細胞によって死滅した細胞は、カルセインAM染色体を保持しなくなったため、このアプローチでは検出されません。図2B,Cに示すように、NK92MI細胞と共培養した後、カルセインAM陽性SK-HEP-1細胞の数は、NK92MI細胞を含まないSK-HEP-1細胞と比較して減少する。しかし、予想通り、SK-HEP-1細胞のNK細胞媒介死を減少させたshRNAによるATF4ノックダウンは、より多くのカルセインAM陽性細胞によって観察される(図2B、C)。したがって、LDHベースおよびカルセインAMアッセイはいずれも一貫した結果を示し、ATF4ノックダウンがNK媒介癌細胞傷害性を低下させることを確認した。これらのアッセイはいずれもNK細胞媒介性細胞毒性を評価するのに十分である。ただし、両方の方法を使用して、結果の信頼性と信頼性の両方を高めることをお勧めします。
また、24ウェルNK細胞移動アッセイの結果を紹介します。NK92MI細胞を上チャンバ内の無血清NK92MI培地に再懸濁し、ケモカイン、CCモチーフ、リガンド2(CCL2)を下側透過性チャンバに添加した。NK細胞の移行は、セクション3(図3A)に記載されているようにアッセイした。移行したNK92MI細胞の数を、フローサイトメトリー用のカウンティングビーズを加えて定量し、FACS分析を行った。図3B-Cに示すように、コントロール培地と比較してCCL2含有培地に移行したNK92MI細胞の数が有意に増加した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> 図1:LDH活性系NK細胞媒介性細胞傷害性アッセイ(A)LDH活性系NK細胞毒性アッセイの主要ステップを描写した模式図。(B,C)ATF4発現は、定量的RT-PCRおよびウェスタンブロッティングによりATF4を標的とする非特異的(NS)shRNAまたはshRNAのいずれかを発現するSK-HEP-1細胞で分析した。(B) 相対ATF4 mRNAレベルは、NS shRNAまたはATF4 shRNAを発現するSK-HEP-1細胞においてアクチンブレベルに対して正常化後に示される。(C) SK-HEP-1細胞におけるATF4およびアクチンBタンパク質レベルは、NS shRNAまたはATF4 shRNAを発現する。(D)NK細胞媒介性細胞傷害性を、LDH法によりNS shRNAまたはATF4 shRNAのいずれかを発現するSK-HEP-1細胞で分析した。パーセント (%)NK細胞媒介性細胞傷害性が示されている。データは平均値±SEMとして提示されます。ns、重要ではない。**p < 0.01, ***p < 0.001.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> 図2:NK細胞媒介性細胞毒性を測定するためのカルセインAM染色系顕微鏡法。(A)NK細胞媒介性細胞毒性を測定するためのカルセインAM染色ベース顕微鏡法の主要なステップを描写した模式図。(B)NK細胞媒介性細胞傷害性を、NS shRNAまたはATF4のいずれかのshRNAを発現するSK-HEP-1細胞でカルセインAM法を用いて分析した。代表的な画像が表示されます。スケールバー = 200 μm(C) パネル B に示した実験に対するカルセイン AM 陽性細胞のパーセント。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> 図3:FACS系定量NK細胞移動アッセイ(A)FACSベースNK細胞移動アッセイの主要ステップを示す模式図。(B,C)NK細胞遊入アッセイは、24ウェルプレートの底部チャンバーにCCL2の50ngを加えた後に行った。(B) 制御用またはCCL2処理培養液用の代表的なNK細胞移行ドットプロットが示されている。(C)NK細胞移行データ (平均 ± SEM) は、パネル B に示す実験のために提示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。

肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

NK細胞機能の研究方法を示す2つのプロトコルを今日実証します。NK細胞機能には、腫瘍細胞を根絶することができ、腫瘍微小環境に移行できる2つの重要な側面があります。これら2つのプロトコルは、腫瘍細胞を根絶するNK細胞能力を実証し、腫瘍微小環境にも移行することができる。したがって、今日実証しようとしている2つのプロトコルは簡単で、無線活動の使用を必要とせず、分子生物学と細胞培養の仕事を行う能力を持つほとんどの研究室で確立することができます。私の研究室の2人の博士研究員であるSuresh BugideとSuresh Chavaは、今日、これら2つのプロトコルを実証します。2つはLDHを用いてNK細胞媒介細胞毒性を評価し、まず、37度の摂氏および5%の二酸化炭素で100ミリメートル細胞培養ペトリ皿において70〜80%の合流度にヒト肝癌細胞株を成長させる。実験の日に、細胞がプレート底から剥離するまで0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルで細胞を処理する前に、PBSの5ミリリットルで培養を洗浄します。単一細胞懸濁液が得られた場合、細胞に10ミリリットルの細胞培養培地を加え、遠心分離のために細胞を15ミリリットルの円錐管に移す。培養液濃度の5ミリリットル当たり50分の5細胞で細胞を再懸濁する前に、5ミリリットルのPBSで細胞ペレットを洗浄します。次に、96ウェルプレートにおける治療条件毎の三重化でヒト肝癌細胞を対象の1ウェル当たり100マイクロリットルの種子とし、各標的細胞に100マイクロリットルの培地で第5ヒトNK細胞に10回10を加える。その後、細胞培養インキュベーターにプレートを3時間置きます。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞をペレットし、新しい96ウェルプレートの個々のウェルに各ウェルから上澄みの100マイクロリットルを移す。LDH基板50マイクロリットルを完全に混合して各ウェルに加え、光から保護された室温でプレートを20分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、50マイクロリットルの停止溶液で反応を阻止し、490および680ナノメートルのプレートリーダー上の吸光度を直ちに測定する。次に、式を使用してNK細胞毒性率を計算します。ヒト肝癌細胞株細胞を70~80%合流まで成長させた後のカルセインAMを用いてNK細胞媒介細胞毒性を評価するために、血清遊離DMEMの3ミリリットルで細胞を再懸濁し、室温で30分間1.5マイクロリットルの10ミリモルカルセインAM溶液で細胞に標識した。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を採取し、洗浄ごとに5ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄する。培地濃度のミリリットル当たり10~5番目の細胞で細胞を1回再懸濁し、治療条件ごとに3倍のウェルプレートの96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞を加える。次に、100マイクロリットルの培養培地中の10〜5番目のヒトNK細胞を1回の対象細胞のウェルに1回、細胞培養インキュベーターにプレートを4時間置いた。インキュベーション終了後、10倍の蛍光顕微鏡で各治療条件の複製ごとにカルセインAM陽性細胞の画像の少なくとも10の異なる分野を捕捉する。次に、式を用いて細胞毒性率を計算する。化学チック刺激に応答してNK細胞の遊走を測定するために、70〜80%のコンフルエント培養からヒトNK細胞を収集し、血清を含まないNK細胞培地培地濃度の1ミリリットル当たり2.5倍から6番目の細胞で細胞を再懸濁する。次に、NK細胞ケモ誘引剤を含む無血清培地600マイクロリットルをウェルごとに添加し、5マイクロメートルの細孔を含む直径6.5ミリメートルの培養インサートを培地の各ウェルに1つ入れる。次に、各インサートの上部コンパートメントに100マイクロリットルのNK細胞を加え、細胞培養インキュベーターにプレートを4時間置きます。インキュベーションの終わりに、非接着性の移行された細胞の全容を各ウェルの底部から個々の5ミリリットルFACSチューブに移し、所定の数のフローサイトメトリーカウントビーズの50マイクロリットルを各チューブに加える。次にフローサイトメーターを用いて、標準的なフローサイトメトリック解析プロトコルに従って各細胞サンプルを評価し、その式を用いて移動したNK細胞の絶対数を計算する。ATF4ノックダウンは、非特異的な短いヘアピンRNAを発現するNK細胞と比較して、NK細胞媒介性細胞毒性を有意に減少させる。カルセインAMで染色した後、NK細胞を含まないヒト肝癌細胞と比較してヒトNK細胞との共培養後に生存可能なヒト肝癌細胞の数が減少する。予想通り、短いヘアピンRNAによるATF4ノックダウンは、これらの培養においてより多くのカルセインAM陽性細胞によって証明されるように、ヒト肝癌細胞のNK細胞媒介性の殺死を減少させる。また、ケモカインを含まない制御培地に曝露されたNK細胞に比べ、ケモカイン含有培地に応答して有意に高い量のNK細胞移動が観察される。NK細胞毒性評価のためには、各がん細胞株の労力と目標比およびインキュベーション時間を標準化することが重要です。基準が特定され、インビトロ評価が確認されると、in vivoマウスの実験で補われ、腫瘍細胞根絶におけるその役割をさらに評価する。

Research

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Medicine

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