Name: measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells at JoVE.com

Agradecemos subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) e 1R01 CA218008-01A1 (NW). Também reconhecemos o financiamento do Departamento de Defesa W81XWH1910480 e W81XWH-18-1-0069 para nw.

1. Preparação do Meio de Cultura para células NK e células tumorais hepáticas
<ol><li>Use células assassinas naturais humanas (por exemplo, NK92MI) e linha celular de câncer de fígado humano (por exemplo, SK-HEP-1).</li>
	<li>Prepare o meio de cultura celular NK para as células NK92MI humanas NK adicionando os seguintes componentes a 500 mL de médio médio essencial mínimo Eagle alpha sem ribonucleose e desoxribonucleosides às concentrações finais indicadas: 0,02 mM ácido fólico (100 μL de ácido folico de 100 mM), 0,2 m mioinositol (500 μL de 200 mm meu miom inositol), 0,1 mM β-mercaptoetanol (3,5 μL de 14,3 M β-mercaptoetanol), 2 mM L-glutamina (5 mL de L-glutamina de 200 mM), 1% penicilina/estreptomicina (5 mL de 100x penicilina/estreptomicina), 12,5% bovino fetal soro (FBS) e 12,5% soro de cavalo. Misture e filtre esterilizar usando uma unidade de filtragem estéril de 0,22 μm e armazene a 4 °C.</li>
	<li>Prepare o meio de cultura para a linha de células tumorais hepáticas SK-HEP-1 adicionando 10% de FBS e 1% de penicilina/estreptomia ao meio de Águia modificado de Dulbecco de alta glicose (DMEM) contendo 2 mM L-glutamina.</li>
</ol>2. Ensaio de citotoxicidade mediado por células lDH colorimétricos NK
<ol><li>Cultivar células SK-HEP-1 para 70-80% de confluência em uma placa petri de 100 mm de cultura celular em 5% CO2 a 37 °C em uma incubadora de CO2. Gere uma suspensão unicelular pelas primeiras células de lavagem com 5 mL de soro soro tampão de fosfato 1x (PBS) seguido de incubação com 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA em 5% CO2 a 37 °C em uma incubadora de CO2 até que uma única suspensão celular seja gerada. NOTA: A atividade celular NK pode ser induzida por células cancerígenas estressadas devido a alterações na expressão de ligantes ativadores de células NK em células cancerosas. Portanto, as células cancerígenas saudáveis e subconfluentes devem ser usadas para resultados precisos. Também é importante notar que receptores e ligands de células NK podem ser sensíveis à experimentação26,27. Portanto, o protocolo de experimentação deve ser cuidadosamente otimizado e a experimentação excessiva deve ser evitada.</li>
	<li>Após a experimentação, adicione 10 mL de meio de cultura SK-HEP-1 e centrífuga em 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga círica cínica estéril de 15 mL. Lave a pelota celular com 5 mL de 1x PBS e resuspenda em 5 mL de meio cultural.</li>
	<li>Paralelamente, centrífugas as células NK92MI a 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Lave a pelota celular com 5 mL de 1x PBS e resuspenda em 5 mL de meio de cultura celular NK92MI. NOTA: As células NK92MI são cultivadas em meio de cultura celular NK e obtidas de forma semelhante, conforme descrito na etapa 2.1.</li>
	<li>Conte as células SK-HEP-1 e NK92MI usando um hemocímetro ou qualquer contador de células automatizadodisponível.</li>
	<li>Adicione células SK-HEP-1 (células-alvo) (1 x 104/100 μL/well) e células NK92MI (células effectoras) (1 x 105/100 μL/well) na proporção de 1:10 alvo:effector e semente em poços triplicados em uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Incubar a placa de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera de ar de 95% e 5% CO2 por 3 h. Após a incubação, placa de centrífuga a 450 x g por 5 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Sem perturbar a pelota celular, colete 100 μL de supernatante de cada poço e transfira para um poço em uma nova placa de poço de 96.</li>
	<li>Adicione 50 μL de substrato LDH, misture bem e incuba a placa por 20 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Pare a reação adicionando 50 μL de solução parada (50% de dimetilformaida e sulfato dodecyl de 20% de sódio no pH 4,7). Meça imediatamente a absorção da placa em 490 nm e 680 nm usando um leitor de placa.</li>
	<li>Subtraia a absorção a 680 nm da absorção a 490 nm. Calcule o percentual (%) Citotoxicidade celular NK usando a fórmula abaixo. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> onde o LDH experimental (effector + células-alvo) é a absorção de células NK92MI e células SK-HEP-1, células eficazes LDH é a absorção apenas de células NK92MI, LDH espontâneo é a absorção apenas de células SK-HEP-1, e máxima LDH é a absorção de Células SK-HEP-1 células com tampão de lise. NOTA: Para reduzir a interferência do soro, use sempre os seguintes controles: somente células-alvo (SK-HEP-1), células de efeito ou somente (NK92MI), células-alvo com tampão de lise como controle completo de lise, meio de célula sdestino, médio NK92MI, bem como meio celular alvo e Nk92MI médio em uma proporção 1:1.</li>
</ol>3. Método Microscópico baseado em manchas à base de calcein am para medir citotoxicidade mediada por célulaNK
<ol><li>Células SK-HEP-1 de cultura para 70-80% de confluência. Gere uma suspensão unicelular pelas primeiras células de lavagem com 5 mL de 1x PBS seguido de incubação com 1 mL de 0,25% de trypsin-EDTA.</li>
	<li>Centrífuga sk-HEP-1 células em um tubo de centrífuga estéril de 1 mL a 160 x g por 3 min. Resuspender a pelota em 3 mL de DMEM sem soro.</li>
	<li>Adicione 1,5 μL de solução AM de calceina (10 mM) às células SK-HEP-1 e incubar por 30 min em temperatura ambiente. Centrífuga calcein AM-labeled CÉLULAs SK-HEP-1 a 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.</li>
	<li>Lave as células duas vezes com 5 mL de 1x PBS para remover o excesso de calcein AM yye.</li>
	<li>Paralelamente, as células NK92MI centrífugas a 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Lave a pelota celular uma vez com 5 mL de 1x PBS e resuspenda em 5 mL de meio celular NK92MI.</li>
	<li>Conde calcein AM-labeled células SK-HEP-1 e células NK92MI usando um hemocímetro ou um contador de células automatizado.</li>
	<li>Resuspenda as células SK-HEP-1 em meio de cultura a 1 x 105 células/mL e células NK92MI a 1 x 106 células/mL em meio de células NK.</li>
	<li>Placas de calcein AM-rotuladas por CÉLULAs SK-HEP-1 (células-alvo) (1 x 104/100 μL/well) com células NK92MI (células effectoras) (1 x 105/100 μL/well) (1:10 alvo:relação effector) por poço em poços triplicados em uma placa de 96 poços.</li>
	<li>Incubar a placa de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera de ar de 95% e 5% CO2 por 4 h. Após a incubação, capture imagens de fluorescência das células rotuladas por Calcein AM usando um microscópio de fluorescência na ampliação de 10x. Capture pelo menos 10 campos diferentes de cada replicação para cada condição de tratamento.</li>
	<li>Selecione aleatoriamente 10 imagens para cada replicação e conte células-alvo am-positivas incubadas com ou sem células NK92MI. Calcule % de citotoxicidade usando a fórmula abaixo. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> NOTA: Como controles, use células-alvo sem células NK92MI e células-alvo completamente desordenadas como controle completo de lise. Para lise completa, incuba as células em 0,5% Triton X-100 por 1 h (20 μL de 5% Triton X-100 em 200 μL de mídia cultural).</li>
</ol>4. Nk Cell Migration Assay
<ol><li>Cresça células NK92MI e células centrífugas a 160 x g por 3 min em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL.</li>
	<li>Lave a pelota celular duas vezes com 5 mL de 1x PBS e resuspenda as células em 3 mL de meio de célula NK92MI livre de soro. Conte células NK92MI usando um hemocímetro ou um contador de células automatizados.</li>
	<li>Placa Células NK92MI (2,5 x 105 células/100 μL/well) no compartimento superior da câmara permeável transwell (inserção de 6,5 mm de diâmetro e tamanho de poro de 5 μm).</li>
	<li>Na câmara inferior adicione 0,6 mL de material de contenção médio sem soro para ser testado para propriedades quimiométricas de células NK (por exemplo, meio condicionado, quiminas, citocinas). NOTA: Ao preparar o meio condicionado, use meio de soro reduzido sem soro adicionado para eliminar a interferência de proteínas sésas no ensaio migratório.</li>
	<li>Incubar as 24 câmaras bem permeáveis a 37 °C por 4 h. Após 4 h, colete as células NK92MI não aderentes e migradas da câmara inferior e transfira-as para tubos de classificação celular ativado por fluorescência (FACS) para análise posterior. NOTA: O tempo da cultura pode variar dependendo do tipo de células-alvo, bem como da quantidade e cinética das quiminas produzidas pelas células-alvo. Portanto, desta vez deve ser empiricamente determinado para cada tipo de célula, quimioca e experimento.</li>
	<li>Adicione o número pré-determinado de contas de contagem para citometria de fluxo em um volume de 50 μL a cada tubo contendo células NK migradas. Avalie o volume de suspensão celular de 300 μL/poço usando qualquer citometro de fluxo capaz de contagem automatizada de células baseadas em FACS. NOTA: Misture ou misture as contas de contagem para citometria de fluxo completamente cada vez antes do uso para garantir que um número constante de contas seja usado para minimizar a variabilidade experimental. O tubo reverso é recomendado com contas de contagem para manter a precisão. Use apenas células NK e contas de contagem para citometria de fluxo como controles de análise FACS. Os autores recomendam a leitura de pelo menos 10.000 contas + células NK combinadas, uma quantidade que funcionou bem. No entanto, esse número pode variar dependendo das condições experimentais. Portanto, o número combinado de contas + células NK deve ser empiricamente determinado para cada tipo de experimento. Além disso, é importante realizar experimentos usando triplicatos biológicos para alcançar resultados estatisticamente significativos e explicar a variabilidade entre diferentes contagens de células.</li>
	<li>Calcule o número absoluto de células NK92MI migradas usando esta fórmula: <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> onde Um = número de células, B = número de contas, C = contagem de contas atribuídas do lote (número de contas de contagem para citometria de fluxo/50 μL; neste exemplo 49.500) e D = volume de amostra (μL). NOTA: Se 300 μL de volume amostral (células migradas) for usado para análise FACS com 50 μL de contagem de contas para citometria de fluxo, o número absoluto de células migradas = 1.700 células /3.300 eventos de contas x 49.500 contas/300 μL = 84.975 células/μL. O cálculo deve ser corrigido se a amostra for diluída ou se um volume diferente de contas de contagem FACS forem usados.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+and+other+innate+lymphoid+cells+in+cancer.">Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).</li><li>Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. 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Os autores não têm nada para divulgar.

Os métodos de citotoxicidade e migração descritos aqui podem ser usados para avaliar a citotoxicidade celular NK para células cancerosas e mecanismos de evasão imunológica mediado por células NK em tumores malignos, bem como para identificar agentes terapêuticos que melhorarão a atividade/função celular NK. Os protocolos são simples, sensíveis, reprodutíveis e preferíveis alternativas ao ensaio de lançamento de cromo 51baseado em radioatividade clássica. Os protocolos foram especificamente projetados para serem facilmente adaptáveis para uso na maioria dos laboratórios, com leituras colorimétricas simples, microscópicas ou baseadas em FACS que são fáceis de interpretar, permitindo que os pesquisadores alcancem conclusões confiáveis. Todos são escaláveis para abordagens baseadas em triagem de alto nível. Embora os protocolos sejam apresentados no contexto de uma única linha de células tumorais hepáticas, eles podem ser facilmente adaptados facilmente a outros tipos de células cancerígenas e/ou outras células-alvo não cancerígenas.
Considerando que todos os métodos apresentados são robustos e reprodutíveis, variação interexperimental pode ocorrer com diferentes lotes de células cancerígenas e células NK. Para garantir que os resultados apoiem com precisão as conclusões dos experimentos, é aconselhável repetir o experimento pelo menos duas vezes usando triplicados biológicos.
Uma limitação desse método é que a taxa de crescimento das células NK92MI pode ser lenta. Portanto, para experimentos com 50 ou mais amostras, um número suficiente de NK92MI deve ser cultivado antecipadamente para evitar atrasos. Além disso, todos os controles descritos nos protocolos devem ser implementados para evitar resultados espúrios e não reprodutíveis. Outra limitação do ensaio de citotoxicidade NK é que a razão nk para células cancerosas, bem como o tempo de incubação, deve ser otimizada para cada célula-alvo. Por exemplo, testamos várias proporções de células cancerígenas para células NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 e 1:80) para as linhas de células cancerígenas hepáticas, bem como múltiplos tempos de incubação (2, 3, 4, 5 e 6 h). Com base em nossos resultados, observamos resultados mais consistentes com proporções 1:10 e 1:20 de células cancerígenas para células NK e incubação por 3 h.
Além disso, as células cancerígenas derivadas de tumores sólidos se anexam e crescerão na superfície da placa de cultura, enquanto as células NK crescem em suspensão. Se o tempo de incubação for maior que 3h, é aconselhável usar o acessório ultrabaixo 96 placas de poço, o que melhorará a consistência e a reprodutibilidade entre experimentos e réplicas biológicas. Também é importante notar que os ensaios de citotoxicidade induzidas por células NK também podem ser realizados usando células NK primárias isoladas de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs). No entanto, existem várias limitações com tais experimentos. Em primeiro lugar, esses experimentos não podem ser tão facilmente dimensionados como com as células NK92MI. Em segundo lugar, a variação lote a lote da atividade citotóxica das células NK isoladas dos PMBCs pode ser problemática em termos de reprodutibilidade e interpretação dos resultados. Da mesma forma, outras linhas celulares NK humanas são descritas na literatura e podem ser usadas nesses tipos de experimentos, incluindo células NKL29; no entanto, ao contrário das células NK-92MI, as células NKL são dependentes do IL-2 e não estão disponíveis comercialmente.
Ao considerar os experimentos da Calcein AM descritos, é importante notar que calcein AM permanece em corpos apoptóticos após a morte celular30. Portanto, a quantitação da coloração AM de calceindeve ser cuidadosamente realizada, pois pode levar a uma subestimação da citotoxicidade NK.
Semelhante à citotoxicidade mediada por células NK, a modulação da migração celular NK por citocinas e outros quimioatrativores desempenha um papel importante na regulação da função celular NK. O ensaio de migração celular NK descrito aqui fornece uma plataforma simples para avaliar a migração celular NK no contexto de um estímulo como uma quimioterapia ou quimioatraidor. Este ensaio pode ser usado para avaliar agentes que podem promover ou interferir na migração de células NK - assim, identificando aprimoradores e repressores da migração de células NK. Este método também pode ser útil para estudar a capacidade regulatória de migração celular NK como resultado de uma alteração genética/epigenética (upregulation ou repressão) ou decorrentes devido ao tratamento medicamentoso.
Para medir com precisão a migração das células NK, há poucos passos críticos que devem ser seguidos. Para todos os experimentos que utilizam meio condicionado, é importante que o meio condicionado equivalente seja utilizado tanto das condições de controle quanto do tratamento para obter medições precisas. O tempo de incubação será variado com quimioatraidores purificados e meio condicionado. Finalmente, os ensaios de migração transwell são bem estabelecidos e considerados um excelente método para avaliar a migração de células NK; no entanto, as monoculturas homogêneas empregadas nos ensaios carecem da complexa fisiologia dos tecidos ou mesmo culturas 3D que podem imitar com mais precisão o microambiente tumoral.
Assim, embora existam algumas limitações aos ensaios de citotoxicidade celular NK e ensaio sé apresentado neste artigo, esses ensaios são aplicáveis a uma ampla gama de estudos imunológicos e, assim, fornecem métodos importantes e confiáveis para avaliar a célula NK função e terapêutica imunológica modulatória celular NK.

A capacidade do corpo humano de identificar objetos estranhos não-eu e erradicar objetos estranhos é fundamental para a sobrevivência humana contra patógenos e malignidades1. A resposta imune humana desempenha o papel mais importante nesse processo2,3,4. Com base em características e funções fundamentais, o sistema imunológico humano pode ser amplamente classificado em dois grandes grupos funcionais: o sistema imunológico adaptativo e o sistema imunológico inata. O sistema imunológico adaptativo é tipicamente específico para um determinado patógeno e tem memória imunológica e, portanto, é duradouro e responsivo à futura reinfecção pelo mesmo patógeno5,6,7,8,9. Em contraste, a imunidade inata é muito mais ampla em sua erradicação de alvos e relativamente inespecífica. Portanto, tipicamente, a resposta imune inata serve como a primeira linha de defesa imunológica10. As células assassinas naturais (NK) pertencem ao sistema imunológico inata e representam 10-15% do total de linfócitos circulantes11. As células NK erradicam as células-alvo através de dois mecanismos principais. Primeiro, ao vincular-se às células-alvo expressando ligantes ativados, as células NK liberam a perforina protena que interrompe a membrana e os granzymes protease serinos através da exocitose, que induzem conjuntamente a apoptose nas células-alvo12,13,14,15. Além disso, as células NK expressando apoptose (TRAIL) relacionadas ao fator FasL e necrosa (TRAIL) interagem com células-alvo expressando receptores de morte (Fas/CD95), levando à apoptose dependente da caspase16. Mais importante, as células NK não requerem preestimulação, como a apresentação de antígenos, para erradicar células infectadas por patógenos ou malignas; assim, eles geralmente estão em um estado pronto para matar17,18. Para inibir o desenvolvimento e a progressão do tumor e erradicar as células cancerígenas, as células NK devem migrar para o local do tumor e, uma vez no microambiente tumoral, identificar e atacar as células-alvo.
No passado, as funções de efeito nk-células eram monitoradas principalmente por ensaios de desgranulação e citotoxicidade19,20,21. A citotoxicidade celular NK também pode ser medida por 51ensaios de liberação de cromo22,23,24,25. No entanto, este ensaio tem alguns requisitos específicos, incluindo a necessidade de um contador gama, e é baseado em radioatividade, o que requer treinamento no manuseio e descarte de materiais radioativos e representa um nível de risco para o usuário. Portanto, vários novos ensaios não baseados em radioatividade foram desenvolvidos e empregados para estudar a atividade celular NK.
Aqui, descrevemos dois desses protocolos, método microscopico limétrico de desidrogenase (LDH) baseado em células NK mediadas por células NK e método microscópico à base de colorez (AM) para medir a erradicação da célula cancerígena mediada por célulaNK. Esses ensaios não exigem o uso de radioisótopos, são fatores simples, sensíveis e reprodutivelmente identificam fatores que modulam a função celular NK. Além disso, como a função celular NK não pode ser totalmente avaliada sem monitorar as alterações na migração celular NK, também apresentamos um método quantitativo baseado em citometria de fluxo para monitorar a migração celular NK.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra Centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH cytotoxic assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92MI cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKHEP-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable chambers</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells

As células assassinas naturais (NK) são um subconjunto da população citotóxica do sistema imunológico inata e participam como uma primeira linha de defesa, limpando células infectadas por patógenos, malignos e estressadas. A capacidade das células NK de erradicar células cancerígenas faz deles uma ferramenta importante na luta contra o câncer. Várias novas terapias imunológicas estão investigação para o tratamento do câncer, que dependem tanto do aumento da atividade celular NK quanto no aumento da sensibilidade das células cancerígenas à erradicação mediada por células NK. No entanto, para desenvolver efetivamente essas abordagens terapêuticas, ensaios in vitro econômicos para monitorar a citotoxicidade e migração mediadas por células NK também são necessários. Aqui, apresentamos dois protocolos in vitro que podem monitorar de forma confiável e reprodutivelmente o efeito da citotoxicidade das células NK nas células cancerosas (ou outras células-alvo). Esses protocolos não são baseados em radioatividade, simples de configurar, e podem ser dimensionados para triagem de alto nível. Também apresentamos um protocolo baseado em citometria de fluxo para monitorar quantitativamente a migração de células NK, que também pode ser ampliada para triagem de alto desempenho. Coletivamente, esses três protocolos podem ser usados para monitorar aspectos-chave da atividade celular NK que são necessários para a capacidade das células de erradicar células-alvo disfuncionais.

Ensaios de citotoxicidade celular NK e ensaio de migração celular NK foram realizados usando a linha de célula tumorais SK-HEP-1 como um sistema modelo. Para medir a citotoxicidade celular NK usando o ensaio LDH, as células SK-HEP-1 expressando um shRNA (NS) não específico ou shRNA visando ativar o fator de transcrição 4(ATF4)foram incubadas com células NK92MI em uma placa de poço de 96 por 3 h (Figura 1A). O ATF4 já foi mostrado anteriormente para regular a citotoxicidade das células NK, regulando a ativação ligand ULBP128. A atividade de LDH associada ao assassinato de células-alvo mediadas por célulank foi medida colorimetricamente, e por cento de citotoxicidade calculada usando a fórmula descrita no protocolo 1. O knockdown ATF4 reduziu significativamente a citotoxicidade mediada por células NK em comparação com as células NK expressando ns shRNA (Figura 1B-D). Também medimos a citotoxicidade das células NK usando um ensaio à base de calcein AM. Para isso, as células SK-HEP-1 expressando ns shRNA ou ATF4-targeting shRNAs foram rotuladas com calcein AM e incubadas com células NK92MI em 96 placas de poço por 4 h como ilustrado na Figura 2A. Após a incubação, imagens de células am-positivas de calcein foram capturadas por microscopia de fluorescência usando um filtro FITC/GFP. As células mortas pelas células NK não são detectadas por essa abordagem porque não retêm mais o calcein AM yye. Como mostrado na Figura 2B,C,o número de células SK-HEP-1 de calcein AM-positiva saquea-1 é reduzido após a co-cultura com células NK92MI em comparação com as células SK-HEP-1 cultivadas sem células NK92MI. No entanto, como esperado, o knockdown ATF4 via shRNA reduziu a morte mediada por células NK de células SK-HEP-1, observada sumida por um maior número de células am-positivas de calcein(Figura 2B,C). Portanto, tanto os ensaios de LDH baseados quanto calcein AM mostraram resultados consistentes e confirmaram que o knockdown ATF4 reduz a citotoxicidade das células cancerígenas mediadas pelo NK. Qualquer um desses ensaios é suficiente para avaliar a citotoxicidade mediada por células NK; no entanto, recomendamos o uso de ambos os métodos para aumentar a stringência e a confiança nos resultados.
Também apresentamos os resultados de um ensaio de migração celular NK de 24 poços. As células NK92MI foram resuspensas em meio NK92MI livre de soro na câmara superior, e a quimiofina, motivo cc, ligand 2 (CCL2) foi adicionada à câmara permeável inferior. A migração celular NK foi estocada como descrito na seção 3 (Figura 3A). O número de células NK92MI migradas foi quantificado adicionando contas de contagem para citometria de fluxo e seguido pela análise FACS. Como mostrado na Figura 3B-C,houve um aumento significativo no número de células NK92MI que haviam migrado para o meio contendo CCL2 em comparação com o meio de controle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> Figura 1: Ensaio de citotoxicidade mediada por células NK baseada em atividade lDH colorimétrica. (A)Esquemática retratando os principais passos do ensaio de citotoxicidade de células NK baseada em atividade lDH colorimétrica. (B,C) A expressão ATF4 foi analisada em células SK-HEP-1 expressando shRNA inespecífica (NS) ou shRNAs visando atf4 por RT-PCR quantitativo e manchas ocidentais. (B)O nível relativo atf4 mRNA é mostrado após a normalização ao nível ACTINB em células SK-HEP-1 expressando ns shRNA ou ATF4 shRNAs. (C) níveis de proteína ATF4 e ACTINB em células SK-HEP-1 expressando ns shRNA ou ATF4 shRNAs. (D) A citotoxicidade mediada por célulank foi analisada em células SK-HEP-1 expressando ns shRNA ou ATF4 shRNAs pelo método LDH. Percentual (%) A citotoxicidade mediada por células NK é mostrada. Os dados são apresentados como média ± SEM; ns, não significativo; **p < 0,01, ***p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> Figura 2: Método microscópico à base de coloração à base de calcein AM para medir citotoxicidade mediada por célulank. (A)Esquemática representando os principais passos do método microscópico à base de calcein AM para medir a citotoxicidade mediada por células NK. (B) A citotoxicidade mediada por célulank foi analisada em células SK-HEP-1 expressando ns shRNA ou ATF4 shRNAs usando o método CALcein AM. Imagens representativas são mostradas. Barra de escala = 200 μm. (C) Percentual das células am-positivas da calceina para o experimento apresentado no painel B. **p < 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> Figura 3: Ensaio quantitativo NK de migração de células NK baseado em FACS. (A)Esquemática retratando os principais passos do ensaio de migração de células NK baseado sê-facs. (B,C) O ensaio de migração celular NK foi realizado após adicionar 50 ng de CCL2 à câmara inferior da placa de poço 24. (B)São mostradas parcelas representativas de blocos de migração de células NK para controle ou meio de cultura tratado pelo CCL2. (C) Os dados de migração celular NK (média ± SEM) são apresentados para o experimento mostrado no painel B. ***p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>

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Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

A erradicação mediada por células por células cancerígenas é importante para a iniciação e progressão do câncer. Aqui, apresentamos dois protocolos não baseados em radioatividade para avaliar a citotoxicidade mediada por célulank em relação às células tumorais hepáticas. Além disso, um terceiro protocolo é apresentado para analisar a migração de células NK.

Medição da Citotoxicidade e Migração Mediadas por Células Assassinas Naturais no Contexto das Células Tumorais Hepáticas

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Vamos demonstrar dois protocolos hoje que demonstram como estudar a função celular NK. Há dois aspectos-chave da função celular NK que é capaz de erradicar células tumorais e é capaz de migrar para o micro ambiente tumoral. Esses dois protocolos vamos demonstrar a capacidade celular NK de erradicar células tumorais e também é capaz de migrar para o micro ambiente tumoral.Assim, os dois protocolos que vamos demonstrar hoje são simples, não exigem uso de atividade de rádio e podem ser estabelecidos na maioria dos laboratórios que tem a capacidade de fazer biologia molecular e trabalho de cultura celular. Suresh Bugide e Suresh Chava, que são dois associados pós-doutorado no meu laboratório, vão demonstrar esses dois protocolos hoje. Dois avaliam a citotoxicidade mediada por células NK usando LDH, primeiro crescem uma linha de células cancerígenas do fígado humano para 70-80% de confluência em uma placa petri de cultura celular de 100 milímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.No dia do experimento, lave a cultura com cinco mililitros de PBS antes de tratar as células com um mililitro de 0,25% de trippsina EDTA até que as células se despevem do fundo da placa. Quando uma única suspensão celular tiver sido obtida adicione 10 mililitros de cultura celular ao meio das células e transfira as células para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Lave a pelota celular com cinco mililitros de PBS antes de suspender as células em uma única vez 10 a 5 células por mililitro de concentração média de cultura fresca.Em seguida, semente 100 microliters das células de câncer de fígado humano alvo por poço em triplicado por condição de tratamento em uma placa de 96 poços e adicionar uma vezes 10 às 5 células NK humanas em 100 microliters de médio para cada célula alvo bem. Em seguida, coloque a placa na incubadora de cultura celular por três horas. No final da incubação, pelota as células por centrifugação e transfira 100 microliters de supernascer de cada poço para poços individuais de uma nova placa de poço 96.Adicione 50 microliters de substrato LDH a cada poço com uma mistura completa e incubar a placa por 20 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, prenda a reação com 50 microliters de solução stop e meça imediatamente a absorvância em um leitor de placas em 490 e 680 nanômetros. Em seguida, use a fórmula para calcular a citotoxicidade celular NK por cento.Avaliar a citotoxicidade mediada por células NK usando calcein AM depois de cultivar células de linha de células cancerígenas do fígado humano para uma confluência de 70-80%, como demonstrado, suspenda as células em três mililitros de DMEM sem soro e rotule as células com 1,5 microliters de 10 mililitros de solução AM de calceina por 30 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, recolham as células por centrifugação e lavem as células duas vezes com cinco mililitros de PBS por lavagem. Suspenda as células em uma única vez 10 a 5 células por mililitro de concentração média cultural e adicione 100 microliters de células a cada poço de uma placa de 96 poços em triplicado por condição de tratamento.Em seguida, em uma vez 10 a 5 células NK humanas em 100 microliters de cultura média para cada poço de células-alvo e colocar a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas. Após o término da incubação, capture pelo menos 10 diferentes campos de imagens das células positivas de calcein AM para cada réplica de cada condição de tratamento em um microscópio de fluorescência a uma ampliação de 10 vezes. Então calcule a por cento de citotoxicidade usando a fórmula.Para medir a migração celular NK em resposta aos estímulos quimotactic coletar células NK humanas de uma cultura 70-80% confluente e suspender as células a uma concentração média de cultura celular NK 2,5 vezes 10 vezes 10 a 6. Em seguida, adicione 600 microliters de meio livre de soro contendo a quimio da célula NK atraindo interesse por poço e coloque uma inserção de cultura de 6,5 milímetros de diâmetro com cinco poros de micrômetros em cada poço de meio. Em seguida, adicione 100 microliters de células NK ao compartimento superior de cada inserção e coloque a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas.No final da transferência de incubação, todo o volume de células migradas não aderentes da parte inferior de cada poço para tubos FACS individuais de cinco mililitros e adiciona 50 microliters de um número predeterminado de citometria de fluxo contando contas a cada tubo. Em seguida, usando um citómetro de fluxo avalie cada amostra celular de acordo com protocolos de análise citométrica de fluxo padrão e calcule o número absoluto de células NK migradas usando a fórmula. O knockdown atf4 reduz significativamente a citotoxicidade mediada por células NK em comparação com as células NK que expressam RNA de grampo curto não específico.Após a coloração com calcein AM, o número de células viáveis do câncer de fígado humano diminui após a co-cultura com células NK humanas em comparação com células cancerígenas do fígado humano cultivadas sem células NK. Como esperado, o knockdown atf4 via RNA de grampo de cabelo curto reduz a morte mediada por células NK de células humanas cancerosas, como evidenciado por um maior número de células am-positivas calcein nessas culturas. Além disso, uma quantidade significativamente maior de migração de células NK é observada em resposta ao meio contendo quimioterapia em comparação com células NK expostas ao meio de controle sem quimioterapia.Para a citotoxicidade celular NK avaliar é importante padronizar nosso esforço e relação-alvo e tempo de incubação para cada linha celular cancerosa. Uma vez que as normas são identificadas e validadas, a avaliação in vitro é complementada com experimentos de camundongos in vivo para avaliar ainda mais seu papel na erradicação de células tumorais.

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