Name: measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells
Uploaded: 2020-02-22T14:00:00
Duration: 6 min 55 s
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Agradecemos las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) y 1R01 CA218008-01A1 (NW). También reconocemos la financiación del Departamento de Defensa W81XWH1910480 y W81XWH-18-1-0069 a NW.

1. Preparación del medio de cultivo para células NK y células tumorales hepáticas
<ol><li>Utilice células asesinas naturales humanas (por ejemplo, NK92MI) y la línea celular de cáncer de hígado humano (por ejemplo, SK-HEP-1).</li>
	<li>Preparar el medio de cultivo celular NK para las células NK 92MI humanas NK añadiendo los siguientes componentes a 500 ml de alfa de águila media esencial mínima sin ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos a las concentraciones finales indicadas: 0,02 mM de ácido fólico (100 ml de ácido fólico de 100 mM), 0,2 mM de mioinositol (500 ml de ácido fólico de 200 mM) m-glutamina), 0,1 mM de lglutamina, 1% de penicilina/estreptomicina (5 ml de 100x penicilina/estreptomicina), 12,5% de bovina bovina) suero (FBS), y 12,5% de suero de caballo. Mezcle y filtre el esterilizado utilizando una unidad de filtración estéril de 0,22 m y guárdela a 4 oC.</li>
	<li>Preparar el medio de cultivo para la línea celular tumoral hepática SK-HEP-1 añadiendo 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina al medio águila modificado (DMEM) de alta glucosa de Dulbecco que contiene 2 mM de L-glutamina.</li>
</ol>2. Ensayo de citotoxicidad mediada por NK Cell basado en la medición de la medición de la medición de la medición colorimétrica
<ol><li>Cultivar células SK-HEP-1 a 70-80% de confluencia en un cultivo celular de 100 mm Plato Petri en 5% CO2 a 37 oC en una incubadora de CO2. Generar una suspensión de una sola célula mediante las primeras células de lavado con 5 ml de 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS) seguida de incubación con 1 ml de 0,25% de trippsina-EDTA en 5% de CO2 a 37 oC en una incubadora deCO2 hasta que se genere una suspensión de una sola célula. NOTA: La actividad celular NK puede ser inducida por células cancerosas estresadas debido a cambios en la expresión de ligando activador de células NK en las células cancerosas. Por lo tanto, las células cancerosas sanas y subconfluentes deben utilizarse para obtener resultados precisos. También es importante tener en cuenta que los receptores de células NK y ligandos pueden ser sensibles a la trippsinización26,27. Por lo tanto, el protocolo de trippsinización debe optimizarse cuidadosamente y se debe evitar la trippsinización excesiva.</li>
	<li>Después de la trippsinización, añadir 10 ml de medio de cultivo SK-HEP-1 y centrífuga a 160 x g durante 3 minutos en un tubo de centrífuga cónica estéril de 15 ml. Lavar el pellet celular con 5 ml de 1x PBS y resuspender en 5 ml de medio de cultivo.</li>
	<li>Paralelamente, centrifugar las células NK92MI a 160 x g durante 3 minutos en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml. Lavar el pellet celular con 5 ml de 1x PBS y resuspender en 5 ml de medio de cultivo celular NK92MI. NOTA: Las células NK92MI se cultivan en medio de cultivo de células NK y se obtienen de forma similar como se describe en el paso 2.1.</li>
	<li>Cuente las células SK-HEP-1 y NK92MI utilizando un hemocitómetro o cualquier contador de células automatizado disponible.</li>
	<li>Agregue las células SK-HEP-1 (células objetivo) (1 x 104/100 l/pozo) y las células NK92MI (células efectoras) (1 x 105/100 l/bien) en la proporción de 1:10 target:effector y semilla sin pozos triplicados en una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Incubar la placa de 96 pocillos a 37oC en una atmósfera de 95% de aire y 5% CO2 durante 3 h. Después de la incubación, placa centrífuga a 450 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sin perturbar el pellet celular, recoger 100 l de sobrenadante de cada pocata y transferir a un pozo en una nueva placa de 96 pozos.</li>
	<li>Añadir 50 l de sustrato de LDH, mezclar bien e incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Detenga la reacción añadiendo 50 ml de solución de parada (50% dimetilformamida y 20% sulfato de dodecilo sódico a pH 4.7). Mida inmediatamente la absorbancia de la placa a 490 nm y 680 nm utilizando un lector de placas.</li>
	<li>Restar la absorbancia a 680 nm de la absorbancia a 490 nm. Calcular el porcentaje (%) Citotoxicidad de células NK utilizando la fórmula siguiente. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq1.jpg"> donde ldH experimental (efector + células diana) es la absorbancia de las células NK92MI y células SK-HEP-1, las células efectoras LDH es la absorbancia de las células NK92MI sola, LDH espontánea es la absorbancia de las células SK-HEP-1 solo, y LDH maximal es la absorbancia de SK-HEP-1 células con tampón de lisis. NOTA: Para reducir la interferencia sérica, utilice siempre los siguientes controles: células diana solas (SK-HEP-1), células efectoras solas (NK92MI), células diana con tampón de lisis como control de lisis completo, medio de celda objetivo, medio NK92MI, así como medio de celda objetivo y NK92MI medio en una relación 1:1.</li>
</ol>3. Método microscópico basado en tinción AM de calceína para medir la citotoxicidad mediada por NK
<ol><li>Cultivo de células SK-HEP-1 a 70-80% de confluencia. Generar una suspensión de una sola célula mediante las primeras células lavadoras con 5 ml de 1pbS seguida de incubación con 1 ml de 0,25% de trippsina-EDTA.</li>
	<li>Centrífuga SK-HEP-1 células en un tubo centrífugo estéril de 1 ml a 160 x g durante 3 min. Resuspenda el pellet en 3 ml de DMEM libre de suero.</li>
	<li>Añadir 1,5 ml de solución de calceína AM (10 mM) a las células SK-HEP-1 e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Células SK-HEP-1 con etiqueta SK-HEP-1 con cérrifuga am a 160 x g durante 3 min en un tubo centrífugo estéril de 15 ml.</li>
	<li>Lave las células dos veces con 5 ml de 1x PBS para eliminar el exceso de colorante AM de calceína.</li>
	<li>Paralelamente, centrífuga células NK92MI a 160 x g durante 3 minutos en un tubo centrífugo estéril de 15 ml. Lavar el pellet celular una vez con 5 ml de 1x PBS y resuspender en 5 ml de medio celular NK92MI.</li>
	<li>Cuente las células SK-HEP-1 etiquetadas con am de calceína y las células NK92MI utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.</li>
	<li>Resuspenda las células SK-HEP-1 en el medio de cultivo a 1 x 105 células/ml y células NK92MI a 1 x 106 células/ml en el medio de célula s.k.</li>
	<li>Células SK-HEP-1 etiquetadas con placa calceina AM (células objetivo) (1 x 104/100 l/pozo) con células NK92MI (células efectoras) (1 x 105/100 l/pozo) (1:10 target:effector ratio) por pozo en pozos triplicados en una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Incubar la placa de 96 pocillos a 37oC en una atmósfera de 95% de aire y 5%co2 durante 4 h. Después de la incubación, capture imágenes de fluorescencia de las células etiquetadas con calceína AM utilizando un microscopio de fluorescencia a un aumento de 10x. Capture al menos 10 campos diferentes de cada réplica para cada condición de tratamiento.</li>
	<li>Seleccione aleatoriamente 10 imágenes para cada réplica y cuente las células diana etiquetadas con calceína AM positivas incubadas con o sin celdas NK92MI. Calcule el % de la citotoxicidad utilizando la fórmula siguiente. <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq2.jpg"> NOTA: Como controles, utilice celdas de destino sin celdas NK92MI y celdas de destino completamente lysed como control de lisis completo. Para una lisis completa, incubar las células en 0.5% Tritón X-100 durante 1 h (20 l de 5% de Tritón X-100 en 200 l de medios de cultivo).</li>
</ol>4. Ensayo de migración de células NK
<ol><li>Cultivar células NK92MI y células centrífugas a 160 x g durante 3 minutos en un tubo centrífugo estéril de 15 ml.</li>
	<li>Lavar el pellet celular dos veces con 5 ml de 1x PBS y resuspender las células en 3 ml de medio celular NK92MI libre de suero. Cuente las células NK92MI utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.</li>
	<li>Placa NK92MI células (2,5 x 105 celdas/100 l/pozo) en el compartimiento superior de la cámara permeable transwell (inserción de 6,5 mm de diámetro y tamaño de poro de 5 m).</li>
	<li>En la cámara inferior añadir 0,6 ml de medio libre de suero que contenga material que se va a probar para detectar propiedades quimioattractantes de células NK (p. ej., medio acondicionado, quimioquinas, citoquinas). NOTA: Al preparar el medio acondicionado, utilice un medio sérico reducido sin suero añadido para eliminar la interferencia de las proteínas séricas en el ensayo de migración.</li>
	<li>Incubar las 24 cámaras bien permeables a 37oC durante 4 h. Después de 4 h, recoja las células NK92MI no adherentes y migradas de la cámara inferior y transfiéralas a tubos de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) para su posterior análisis. NOTA: El tiempo de cultivo puede variar dependiendo del tipo de células diana, así como la cantidad y la cinética de las quimioquinas producidas por las células diana. Por lo tanto, este tiempo debe determinarse empíricamente para cada tipo de célula, quimiocina, y experimento.</li>
	<li>Agregue un número predeterminado de perlas de recuento para la citometría de flujo en un volumen de 50 ml a cada tubo que contenga celdas NK migradas. Evalúe el volumen de la suspensión celular de 300 l/pozo utilizando cualquier citómetro de flujo capaz de contar células automatizadas basadas en FACS. NOTA: Mezclar o tejer las perlas de conteo para la citometría de flujo a fondo cada vez antes de su uso para asegurarse de que se utiliza un número constante de perlas para minimizar la variabilidad experimental. Se recomienda el pipeteo inverso con perlas de recuento para mantener la precisión. Utilice sólo celdas NK y perlas de recuento para la citometría de flujo como controles de análisis FACS. Los autores recomiendan leer al menos 10.000 perlas + células NK combinadas, una cantidad que ha funcionado bien. Sin embargo, este número puede variar dependiendo de las condiciones experimentales. Por lo tanto, el número combinado de cuentas + células NK debe determinarse empíricamente para cada tipo de experimento. Además, es importante realizar experimentos utilizando triplicados biológicos para lograr resultados estadísticamente significativos y tener en cuenta la variabilidad entre los diferentes recuentos celulares.</li>
	<li>Calcule el número absoluto de celdas NK92MI migradas utilizando esta fórmula: <img src="/files/ftp_upload/60714/60714eq3.jpg"> donde A - número de celdas, B - número de perlas, C - recuento de perlas asignados del lote (número de cuentas de recuento para la citometría de flujo/50 l; en este ejemplo 49.500) y D - volumen de la muestra (L). NOTA: Si se utilizan 300 l de volumen de muestra (células migradas) para el análisis FACS con 50 sL de cuentas de recuento para la citometría de flujo, el número absoluto de celdas migradas: 1.700 celdas /3.300 eventos de perlas x 49.500 perlas/300 oL a 84.975 celdas/L. El cálculo debe corregirse si la muestra se diluye o si se utiliza un volumen diferente de cuentas de recuento FACS.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos de citotoxicidad y migración descritos aquí se pueden utilizar para evaluar la citotoxicidad de células NK a las células cancerosas y los mecanismos de evasión inmune mediados por células NK en tumores malignos, así como para identificar agentes terapéuticos que mejorarán la actividad/función celular NK. Los protocolos son alternativas simples, sensibles, reproducibles y preferibles al ensayo clásico de liberación de cromo 51basado en radiactividad. Los protocolos han sido diseñados específicamente para ser fácilmente adaptables para su uso en la mayoría de los laboratorios, con lecturas directas colorimétricas, microscópicas o basadas en FACS que son fáciles de interpretar, lo que permite a los investigadores llegar a conclusiones fiables. Todos son escalables para enfoques basados en cribado de alto rendimiento. Aunque los protocolos se presentan en el contexto de una sola línea celular tumoral hepática, se pueden adaptar fácilmente a otros tipos de células cancerosas y/u otras células diana no cancerosas.
Mientras que todos los métodos presentados son robustos y reproducibles, la variación interexperimental podría ocurrir con diferentes lotes de células cancerosas y células NK. Para garantizar que los resultados apoyen con precisión las conclusiones de los experimentos, es aconsejable repetir el experimento al menos dos veces utilizando triplicados biológicos.
Una limitación de este método es que la tasa de crecimiento de las células NK92MI puede ser lenta. Por lo tanto, para experimentos con 50 o más muestras, se debe cultivar de antemano un número suficiente de NK92MI para evitar retrasos. Además, todos los controles descritos en los protocolos deben implementarse para evitar resultados no reproducibles y no esenciales. Otra limitación del ensayo de citotoxicidad NK es que la relación NK a células cancerosas, así como el tiempo de incubación, deben optimizarse para cada célula objetivo. Por ejemplo, hemos probado varias proporciones de células cancerosas a células NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 y 1:80) para las líneas celulares de cáncer hepático, así como múltiples tiempos de incubación (2, 3, 4, 5 y 6 h). Basándonos en nuestros resultados observamos resultados más consistentes con 1:10 y 1:20 relaciones de células cancerosas a células NK e incubación durante 3 h.
Además, las células cancerosas derivadas de tumores sólidos se unirán y crecerán en la superficie de la placa de cultivo, mientras que las células NK crecen en suspensión. Si el tiempo de incubación es superior a 3 h, es aconsejable utilizar placas de 96 pocillos de fijación ultrabaja, lo que mejorará la consistencia y reproducibilidad entre experimentos y réplicas biológicas. También es importante tener en cuenta que los ensayos de citotoxicidad inducida por células NK también se pueden realizar utilizando células NK primarias aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PPBCD). Sin embargo, hay varias limitaciones con este tipo de experimentos. En primer lugar, estos experimentos no se pueden escalar tan fácilmente como con las celdas NK92MI. En segundo lugar, la variación lote a lote de la actividad citotóxica de células NK aisladas de pMBCs puede ser problemática en términos de reproducibilidad e interpretación de los resultados. Del mismo modo, otras líneas celulares NK humanas se describen en la literatura y podrían utilizarse en este tipo de experimentos, incluidas las célulasNKL 29; sin embargo, a diferencia de las células NK-92MI, las células NKL son dependientes de IL-2 y no están disponibles comercialmente.
Al considerar los experimentos de calceína AM descritos, es importante tener en cuenta que calceina AM permanece en cuerpos apoptoticos después de la muerte celular30. Por lo tanto, la cuantificación de la tinción de calcina AM debe realizarse cuidadosamente, ya que puede conducir a una subestimación de la citotoxicidad NK.
Al igual que la citotoxicidad mediada por células NK, la modulación de la migración celular NK por citoquinas y otros quimioatractores desempeña un papel importante en la regulación de la función celular NK. El ensayo de migración de células NK descrito aquí proporciona una plataforma simple para evaluar la migración de células NK en el contexto de un estímulo como una quimiocina o un quimioatractor. Este ensayo se puede utilizar para evaluar agentes que pueden promover o interferir con la migración de células NK, identificando así potenciadores y represores de la migración de células NK. Este método también puede ser útil para estudiar la capacidad reguladora de la migración de células NK como resultado de alteraciones genéticas/epigenéticas (upregulation o downregulation) o que surjan debido al tratamiento farmacológico.
Para medir con precisión la migración de celdas NK, hay pocos pasos críticos que se deben seguir. Para todos los experimentos con medio acondicionado, es importante que el medio acondicionado equivalente se utilice tanto a partir de condiciones de control como de tratamiento para obtener mediciones precisas. El tiempo de incubación será variado con quimioattractantes purificados y medio acondicionado. Por último, los ensayos de migración transwell están bien establecidos y se consideran un método excelente para evaluar la migración de células NK; sin embargo, los monocultivos homogéneos empleados en los ensayos carecen de la fisiología compleja de los tejidos o incluso de los cultivos 3D que podrían imitar con mayor precisión el microambiente tumoral.
Por lo tanto, aunque existen algunas limitaciones a los ensayos de citotoxicidad de células NK y al ensayo de migración de NK presentados en este artículo, estos ensayos son aplicables a una amplia gama de estudios inmunológicos y, por lo tanto, proporcionan métodos importantes y fiables para evaluar las células NK función y la terapia inmune modulatoria de células NK.

La capacidad del cuerpo humano para identificar objetos no autónomos y erradicar objetos extraños es clave para la supervivencia humana contra patógenos y neoplasias malignas1. La respuesta inmune humana juega el papel más importante en este proceso2,3,4. Sobre la base de características y funciones clave, el sistema inmunitario humano se puede clasificar ampliamente en dos grupos funcionales principales: el sistema inmune adaptativo y el sistema inmunitario innato. El sistema inmunitario adaptativo es típicamente específico de un patógeno dado y tiene memoria inmunológica y, por lo tanto, es de larga duración y sensible a la reinfección futura por el mismo patógeno5,6,7,8,9. En cambio, la inmunidad innata es mucho más amplia en su erradicación de objetivos y relativamente inespecífica. Por lo tanto, por lo general, la respuesta inmune innata sirve como la primera línea de defensa inmunológica10. Las células asesinas naturales (NK) pertenecen al sistema inmunitario innato y representan entre el 10 y el 15 % de los linfocitos circulantes totales11. Las células NK erradican las células diana a través de dos mecanismos principales. En primer lugar, al unirse a las células diana que expresan ligandos activadores, las células NK liberan la proteína que interrumpe la membrana perforina y los granzimas a la proteasa serina a través de la exocitosis, que inducen conjuntamente la apoptosis en las células diana12,13,14,15. Además, las células NK que expresan el ligando inductor de apoptosis relacionada con el factor fasL y la necrosis tumoral (TRAIL) interactúan con las células diana que expresan los receptores de muerte (Fas/CD95), lo que conduce a la apoptosis dependiente de la caspasa16. Lo más importante es que las células NK no requieren preestimulación, como la presentación del antígeno, para erradicar las células infectadas por patógenos o malignas; por lo tanto, por lo general están en un estado listo para matar17,18. Con el fin de inhibir el desarrollo y progresión del tumor y erradicar las células cancerosas, las células NK deben migrar al sitio del tumor y, una vez en el microambiente tumoral, identificar y atacar las células diana.
En el pasado, las funciones de efector de células NK se monitorizaban principalmente mediante ensayos de degranulación y citotoxicidad19,20,21. La citotoxicidad de células NK también se puede medir mediante 51ensayos de liberación de cromo22,23,24,25. Sin embargo, este ensayo tiene algunos requisitos específicos, incluyendo la necesidad de un contador gamma, y está basado en la radiactividad, que requiere capacitación en el manejo y eliminación de materiales radiactivos y plantea un nivel de riesgo para el usuario. Por lo tanto, se han desarrollado y empleado varios nuevos ensayos no basados en la radiactividad para estudiar la actividad celular nk.
Aquí, describimos dos protocolos de este tipo, el método microscópico basado en la deshidrogenasa de deshidrogenasa láctica colorimétrica (LDH) basado en la medición de células NK y el método microscópico basado en tinción de acetoximetil (AM) para medir la erradicación de células cancerosas mediadas por células NK. Estos ensayos no requieren el uso de radioisótopos, son sencillos, sensibles y identifican reproduciblemente los factores que modulan la función de la célula NK. Además, debido a que la función de celda NK no se puede evaluar completamente sin supervisar los cambios en la migración de celdas NK, también presentamos un método cuantitativo basado en citometría de flujo para monitorear la migración de células NK.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Absolute counting beads</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-MEM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M4256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon ultra Centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein AM dye</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>2530081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH cytotoxic assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>88953</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>myo-Inositol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92MI cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SKHEP-1 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell permeable chambers</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of natural killer cell-mediated cytotoxicity and migration in the context of hepatic tumor cells

Las células asesinas naturales (NK) son un subconjunto de la población de linfocitos citotóxicos del sistema inmunitario innato y participan como primera línea de defensa mediante la eliminación de células infectadas por patógenos, malignas y estresadas. La capacidad de las células NK para erradicar las células cancerosas las convierte en una herramienta importante en la lucha contra el cáncer. Varias nuevas terapias basadas en el sistema inmunitario están bajo investigación para el tratamiento del cáncer que se basan en mejorar la actividad celular NK o aumentar la sensibilidad de las células cancerosas a la erradicación mediada por células NK. Sin embargo, para desarrollar eficazmente estos enfoques terapéuticos, también se necesitan ensayos in vitro rentables para monitorear la citotoxicidad mediada por células NK y la migración. Aquí, presentamos dos protocolos in vitro que pueden monitorear de manera confiable y reproducible el efecto de la citotoxicidad de células NK en las células cancerosas (u otras células diana). Estos protocolos no están basados en la radiactividad, son fáciles de configurar y se pueden escalar verticalmente para la detección de alto rendimiento. También presentamos un protocolo basado en citometría de flujo para monitorear cuantitativamente la migración de células NK, que también se puede escalar verticalmente para la detección de alto rendimiento. Colectivamente, estos tres protocolos se pueden utilizar para monitorear los aspectos clave de la actividad celular NK que son necesarios para la capacidad de las células para erradicar las células diana disfuncionales.

Los ensayos de citotoxicidad de células NK y el ensayo de migración de células NK se realizaron utilizando la línea de células tumorales hepáticas SK-HEP-1 como sistema modelo. Para medir la citotoxicidad de células NK utilizando el ensayo LDH, las células SK-HEP-1 que expresan un shRNA inespecífico (NS) o un shRNA apuntando a activar el factor de transcripción 4 (ATF4) fueron incubadas con células NK92MI en una placa de 96 pozos durante 3 h(Figura 1A). ATF4 se ha demostrado previamente para regular la citotoxicidad de células NK mediante la regulación del ligando activador ULBP128. La actividad de LDH asociada con la matanza de células diana mediadas por células NK se midió colorimétricamente, y el porcentaje de citotoxicidad calculó utilizando la fórmula descrita en el protocolo 1. El derribo atf4 redujo significativamente la citotoxicidad mediada por células NK en comparación con las células NK que expresan el ARNN NS(Figura 1B-D). También medimos la citotoxicidad de células NK utilizando un ensayo a base de tinción AM de calceína. Con este fin, las células SK-HEP-1 que expresan NS shRNA o ATF4-targeting shRNAs fueron etiquetadas con calceína AM e incubadas con células NK92MI en 96 placas de pozo para 4 h como se ilustra en la Figura 2A. Después de la incubación, las imágenes de las células calceína AM positivas fueron capturadas por microscopía de fluorescencia utilizando un filtro FITC/GFP. Las células muertas por las células NK no son detectadas por este enfoque porque ya no retienen el tinte calceina AM. Como se muestra en la Figura 2B, C, el número de células SK-HEP-1 de calceína AM-positivas se reduce después del cocultivo con células NK92MI en comparación con las células SK-HEP-1 cultivadas sin células NK92MI. Sin embargo, como era de esperar, el derribo ATF4 a través de shRNA redujo la matanza mediada por células NK de células SK-HEP-1, observada por un mayor número de células calceína am positivas(Figura 2B,C). Por lo tanto, tanto los ensayos basados en LDH como los ensayos de calceína AM mostraron resultados consistentes y confirmaron que el derribo ATF4 reduce la citotoxicidad de células cancerosas mediadas por NK. Cualquiera de estos ensayos es suficiente para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK; sin embargo, se recomienda usar ambos métodos para aumentar la rigely y la confianza en los resultados.
También presentamos los resultados de un ensayo de migración de células NK de 24 pozos. Las células NK92MI fueron resuspendidas en medio NK92MI libre de suero en la cámara superior, y la quimiocina, el motivo CC, el ligando 2 (CCL2) se añadieron a la cámara permeable inferior. La migración de células NK se anuló como se describe en la sección 3(Figura 3A). El número de células NK92MI migradas se cuantificó agregando cuentas de recuento para la citometría de flujo y seguido por el análisis FACS. Como se muestra en la Figura 3B-C,hubo un aumento significativo en el número de células NK92MI que habían migrado hacia el medio que contiene CCL2 en comparación con el medio de control.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig1.jpg"> Figura 1: Ensayo de citotoxicidad mediada por células NK de LDH colorimétrica. (A) Esquema que representa los pasos clave del ensayo de citotoxicidad de células NK basado en la actividad de LDH colorimétrica. (B,C) La expresión ATF4 se analizó en células SK-HEP-1 que expresaban shRNA inespecífico (NS) o shRNAs dirigidos a ATF4 mediante RT-PCR cuantitativo y hincha occidental. (B) El nivel relativo de ARNm ATF4 se muestra después de la normalización al nivel ACTINB en células SK-HEP-1 que expresan shRNA NS o shRNAs ATF4. (C) niveles de proteína ATF4 y ACTINB en células SK-HEP-1 que expresan shRNA NS o shRNAs ATF4. (D) La citotoxicidad mediada por células NK se analizó en células SK-HEP-1 que expresaban shRNA NS o shRNA ATF4 por el método LDH. Porcentaje (%) Se muestra citotoxicidad mediada por células NK. Los datos se presentan como medias - SEM; ns, no significativo; **p < 0.01, ***p < 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig2.jpg"> Figura 2: Método microscópico basado en tinción AM de calceina para medir la citotoxicidad mediada por células NK. (A) Esquema que representa los pasos clave del método microscópico basado en la tinción AM de calcina para medir la citotoxicidad mediada por células NK. (B) Se analizó la citotoxicidad mediada por células NK en células SK-HEP-1 que expresaban shRNA NS o shRNAs ATF4 utilizando el método de calceína AM. Se muestran imágenes representativas. Barra de escala a 200 m. (C) Porcentaje de células calceína AM positivas para el experimento presentado en el panel B. **p < 0.01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60714/60714fig3.jpg"> Figura 3: Ensayo cuantitativo de migración de células NK basado en FACS. (A) Esquema que representa los pasos clave del ensayo de migración de celdas NK basado en FACS. (B,C) El ensayo de migración de células NK se llevó a cabo después de añadir 50 ng de CCL2 a la cámara inferior de la placa de 24 pozos. (B) Se muestran las gráficas representativas de puntos de migración de células NK para el control o el medio de cultivo tratado con CCL2. (C) Los datos de migración de células NK (media de SEM) se presentan para el experimento que se muestra en el panel B. ***p < 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60714/60714fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells

La evasión de la erradicación mediada por células mortales por asesinos naturales (NK) por las células cancerosas es importante para la iniciación y progresión del cáncer. Aquí, presentamos dos protocolos no basados en la radiactividad para evaluar la citotoxicidad mediada por células NK hacia las células tumorales hepáticas. Además, se presenta un tercer protocolo para analizar la migración de células NK.

Medición de la citotoxicidad y migración mediadas por células asesinas naturales en el contexto de las células tumorales hepáticas

Natural killer (NK) cells are a subset of the cytotoxic lymphocyte population of the innate immune system and participate as a first line of defense by ...

Vamos a demostrar dos protocolos hoy que demuestran cómo estudiar la función de la célula NK. Hay dos aspectos clave de la función celular NK que es capaz de erradicar las células tumorales y es capaz de migrar al microambiente tumoral. Estos dos protocolos demostraremos la capacidad de las células NK para erradicar las células tumorales y también es capaz de migrar al microambiente tumoral.Así que los dos protocolos que vamos a demostrar hoy son sencillos, no requieren el uso de la actividad radioeléctlica y se pueden establecer en la mayoría de los laboratorios que tienen la capacidad de hacer trabajo de biología molecular y cultivo celular. Suresh Bugide y Suresh Chava, que son dos asociados postdoctorados en mi laboratorio, demostrarán estos dos protocolos hoy. Dos evalúan la citotoxicidad mediada por células NK usando LDH, primero crecen una línea celular de cáncer de hígado humano a 70-80% de confluencia en un plato Petri de cultivo celular de 100 milímetros a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.El día del experimento, lave el cultivo con cinco mililitros de PBS antes de tratar las células con un mililitro de 0,25% de trippsina EDTA hasta que las células se hayan separado de la parte inferior de la placa. Cuando se haya obtenido una sola célula de suspensión añadir 10 mililitros de medio de cultivo celular a las células y transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación. Lavar el pellet celular con cinco mililitros de PBS antes de volver a suspender las células a una vez 10 a las 5a células por mililitro de concentración media de cultivo fresco.A continuación, sembrar 100 microlitros de las células de cáncer de hígado humano objetivo por pozo en triplicado por condición de tratamiento en una placa de 96 pozos y añadir una por 10 a las 5a células NK humanas en 100 microlitros de medio a cada pozo de célula objetivo. A continuación, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante tres horas. Al final de la incubación, peletiza las células por centrifugación y transfiere 100 microlitros de sobrenadantes de cada pozo a pozos individuales de una nueva placa de 96 pozos.Agregue 50 microlitros de sustrato de LDH a cada pozo mezclando a fondo e incubar la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, detener la reacción con 50 microlitros de solución de parada y medir inmediatamente la absorbancia en un lector de placas a 490 y 680 nanómetros. A continuación, utilice la fórmula para calcular el porcentaje de citotoxicidad de células NK.Evaluar la citotoxicidad mediada por células NK utilizando calceina AM después de cultivar células de línea celular de cáncer de hígado humano a una confluencia de 70-80%, como se demostró re-suspender las células en tres mililitros de DMEM libre de suero y etiquetar las células con 1,5 microlitros de 10 de la solución de calceina AM milimolar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, recoger las células por centrifugación y lavar las células dos veces con cinco mililitros de PBS por lavado. Re-suspender las células en un uno por 10 a las 5a células por mililitro de concentración media de cultivo y añadir 100 microlitros de células a cada pozo de una placa de 96 pozos en triplicado por condición de tratamiento.A continuación, en un tiempo 10 a la 5a células NK humanas en 100 microlitros de medio de cultivo a cada pozo de células diana y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas. Después del final de la incubación, capture al menos 10 campos diferentes de imágenes de las células positivas de calceina AM para cada réplica de cada condición de tratamiento en un microscopio de fluorescencia a un aumento de 10 veces. A continuación, calcule el porcentaje de citotoxicidad utilizando la fórmula.Para medir la migración de células NK en respuesta a estímulos quimiotácticos, recoja células NK humanas de un cultivo de 70-80% confluente y vuelva a suspender las células a una concentración media de cultivo celular NK 2,5 veces 10 a 6 por mililitro de concentración media de cultivo celular NK libre de suero. A continuación, agregue 600 microlitros de medio libre de suero que contenga el atractor de quimio de células NK de interés por pozo y coloque un inserto de cultivo de 6,5 milímetros de diámetro con cinco poros micrómetros en cada pozo de medio. Luego agregue 100 microlitros de células NK al compartimiento superior de cada plaquita y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas.Al final de la incubación transfiera todo el volumen de células migradas no adherentes desde la parte inferior de cada pozo a tubos FACS individuales de cinco mililitros y agregue 50 microlitros de un número predeterminado de cuentas de recuento de citometría de flujo a cada tubo. A continuación, utilizando un citometro de flujo evalúe cada muestra de celda de acuerdo con los protocolos de análisis citométrico de flujo estándar y calcule el número absoluto de células NK migradas utilizando la fórmula. El knockdown ATF4 reduce significativamente la citotoxicidad mediada por células NK en comparación con las células NK que expresan ARN de horquilla corta no específico.Después de la tinción con calceína AM el número de células de cáncer de hígado humano viables disminuye después del co-cultivo con células NK humanas en comparación con las células de cáncer de hígado humano cultivadas sin células NK. Como era de esperar, el knockdown DE ATF4 a través de ARN de horquilla corto reduce la matanza mediada por células NK de células cancerosas del hígado humano como lo demuestra un mayor número de células de calceína AM positivas en estos cultivos. Además, se observa una cantidad significativamente mayor de migración de células NK en respuesta al medio que contiene quimiocina en comparación con las células NK expuestas al medio de control sin quimiocina.Para la citotoxicidad de las células NK evaluar es importante estandarizar nuestro esfuerzo y las proporciones de objetivo y el tiempo de incubación para cada línea celular de cáncer. Una vez identificadas y validadas las normas, la evaluación in vitro se complementa con experimentos en ratones in vivo para evaluar aún más su papel en la erradicación de células tumorales.

Research

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Medicine

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