Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر كامياما علي التعليقات علي المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 NS107558 (إلى M.I. ، K.B. ، و دي).

1-المعدات واللوازم
<ol><li>مواد لجمع الاجنه وتدريب البالغين علي وضع البيض<ol>
<li>اعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب 50 mL وفتح فتحه ثقب في الغطاء لتعيين فلتر شبكه مع المسام من 100 μm (جدول المواد) في ما بين الأنبوب والغطاء. ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مصافي الخلية مع المسام من 100 μm (...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

استخدام الوسم صبغ لدراسة المورفولوجية العصبية لديها العديد من المزايا علي تقنيات الخلايا الوراثية وسم. يمكن لتقنية وضع العلامات صبغ تقليل مقدار الوقت اللازم لوضع العلامات والتصوير من مورفولوجيس من الخلايا العصبية الحركية. عمليه وضع العلامات صبغ سريع جدا لأنه ياخذ اقل من 2 ح وتمكننا من تح...

يوفر نظام الخلايا العصبية الجنينية للمحركات نموذجا تجريبيا قويا لتحليل أليات الكامنة وراء تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. نظام الخلايا العصبية الحركية قابل للتقنيات البيوكيميائية والجينية والتصويرية والكهربية. باستخدام التقنيات ، يمكن اجراء التلاعب الجيني والتحليلات الوظيفية علي مستوي الخلايا العصبية أحاديه المحرك2،4،5،6.
خلال التطور المبكر للجهاز العصبي ، والانفجارات العصبية الانقسام وتوليد عدد كبير من الخلايا العصبية والعصبية. وقد تم التحقيق سابقا في العلاقة المكانية بين الفصل والتعريف الجيني للتعبيرات العصبية في التفاصيل7،8،9. في حاله نظام الخلايا العصبية الحركية ، تمت دراسة تشكيل الوصلة العصبية العضلية الجنينية (nmj) علي نطاق واسع باستخدام aCC (خليه الزاوية الاماميه) ، RP2 (الجمبري الخام 2) ، والخلايا العصبية RP5 موتور2،10. علي سبيل المثال ، عندما تشكل الخلايا العصبية الحركية RP5 تقاطع متشابك الوليدة ، يتم مزج filدستور قبل متشابك وبعد متشابك11،12،13. مثل هذه الاتصالات الخلوية المباشرة أمر حيوي للبدء في تشكيل NMJ. علي عكس ما نعرفه عن فروع العصب المحيطيه ، معرفتنا كيف المحرك تشعبات بدء الاتصال متشابك داخل الاجهزه العصبية الخاصة لا تزال بدائية.
في هذا التقرير ، نقدم تقنيه تسمح بوضع العلامات الارتجاعية للخلايا العصبية الحركية في الاجنه عن طريق تقديم الاصباغ المضادة للدهون بواسطة الماصات المجهرية. هذه التقنية تمكننا من تتبع الخلايا العصبية الحركية 38 العصب كل من عضلات جدار الجسم 30 في الجزء هيمي في 15 ح بعد وضع البيض (AEL)14. باستخدام هذه التقنية ، وقد حققت مجموعتنا بدقه العديد من المكاسب من وظيفة/فقدان الوظيفة الاليلات15،16،17. وقد كشفنا مؤخرا أليات الجزيئية التي تدفع بدء الاتصال تغصن المحرك وأظهرت ان التفاعل Dscam1-قفص-باك يعرف موقع النمو تغصن في الخلايا العصبية الحركية aCC17. بشكل عام ، هذه التقنية قابله للتكيف مع التحليل الظاهري لأي من الخلايا العصبية الحركية الجنينية في السلالات البرية أو المتحولة ، مما يعزز قدرتنا علي توفير رؤى جديده في التصميم الوظيفي للجهاز العصبي دروفويلا .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

نحن وصف تقنيه لوضع العلامات إلى الوراء من الخلايا العصبية الحركية في دروفيبيلا. نستخدم صبغه زيتية ذائبه بالزيت ونقدم قطره صغيره إلى اعداد الشرائح الجنينية بواسطة الحاقن المجهري. يمكن بعد ذلك تسميه كل الخلايا العصبية الحركية التي يتم الاتصال بها بواسطة القطيرات بسرعة. يتم تسميه الخلايا العصبية الحركية الفردية بشكل مستمر ، مما يتيح التفاصيل الهيكلية الدقيقة ليتم تصورها بوضوح. النظر إلى ان الاصباغ محبه للدهون تاتي في ألوان مختلفه ، وتقنيه يوفر أيضا وسيله للحصول علي الخلايا العصبية المجاورة المسمية في متعدد ألوان. التالي فان تقنيه التتبع هذه مفيده لدراسة نشاه الخلايا العصبية والاتصال المتشابك في نظام الخلايا العصبية الحركية من دروفويلا.

ويظهر صوره تمثيليه لل aCC و RP3 الخلايا العصبية الحركية في الشكل 3ج لإظهار وسم متعدد ألوان من الخلايا العصبية الحركية في 15 ح AEL. المتحولات الخاصة بهم هي ثابته إلى حد كبير بين الاجنه. ويظهر نمط تلطيخ التي تم الحصول عليها مع الأجسام المضادة لمكافحه التناسل باللون الرماد?...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

نحن نقوم بوصف طريقه للتتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام اصباغ فلورية للدهون.

التتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام الاصباغ الفلورية الليبوهيلليك

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

تقنية التتبع الموصوفة في هذا البروتوكول يساعدنا على دراسة morphogenesis العصبية ومفاجئة الاتصال في نظام الخلايا العصبية الحركية من Drosophila. يمكن للصبغة الدهنية أن تنتشر بسرعة إلى كل جزء من الغشاء الخلوي بكثافة عالية للغاية. هذا هو السبب في بروتوكول لدينا يحل بكفاءة للعثور على هياكل من الخلايا العصبية المسمى.إذا كان يمكن الوصول إلى محطة محور عصبي باستخدام ميكروسيبيت الحقن ، يمكن تطبيق هذه التقنية على أي خلية عصبية في مراحل اليرقات والبالغين من الذباب أو في الكائنات الحية الأخرى. إذا لم يكن لديك أي خبرة في تشريح أو استخدام ناخن دقيق العملية على العينة، يمكن أن يكون تحديا. فهم تشريح الجنين، وسوف تساعد مع التوجيه للجزء المناسب من الأدوات لتنفيذ تشريح أو dinjection.لبدء، وإعداد وتخطيط جميع المواد جمع الجنين. إعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب 50 ملليلتر، وقطع فتح ثقب في الغطاء. ثم تعيين مرشح شبكة مع 100 المسام ميكرومتر في بين الأنبوب والغطاء.إعداد حقنة صبغ micropipette وإبرة تشريح من نفس الأنابيب الشعرية مع القطر الداخلي من 1.2 ملليمتر. سحب الأنابيب مع ميكروبيبيت، سحب في 7٪ من 170 فولت الحد الأقصى للإنتاج لإنشاء إبرة حادة مع تفتق من حوالي 0.4 سم في الطول. لإعداد ميكروسيبيت حقن صبغ، نقع طاحونة مع عامل التبول ووضع الإبرة على المشبك micropipette في 25 إلى 30 درجة.ثم خفض طرف على ثلثي نصف القطر من مركز سطح مشط. طحن الإبرة في حين أن حقنة مع أنابيب يدفع الهواء في ذلك. وضع علامة micropipette مع علامة دائمة طرف غرامة للإشارة إلى موقف الفتحة في الطرف بعد شطب لأنه يمكن أن يكون تحديا لتحديد مكان الفتحة الضيقة التي يتم تشكيلها في زاوية.السماح للذباب لوضع البيض بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة وجمع الأنابيب مع البيض في الصباح. لجمع الأجنة، إزالة الكلور البيض على لوحة مع 50٪ التبييض لمدة خمس دقائق. بمجرد أن يتم مسح الكلورات ، صب محتويات اللوحة من خلال جهاز الترشيح أو مصفاة الخلايا لعزل الأجنة.استخدام زجاجة ضغط من الماء لتخفيف التبييض اليسار على لوحة وجمع أكبر عدد ممكن من الأجنة عن طريق decanting الخليط في التصفية. اغسل الأجنة ثلاث إلى أربع مرات بالماء حتى تتبدد رائحة التبييض. إزالة مرشح من الجهاز وغسلها على آخر لوحة نظيفة بالماء.ثم قم بديس الماء من الطبق الجديد الذي تعمل عليه الأجنة. استخدم ملقطًا جيدًا لتحديد خمسة إلى 10 أجنة في 15 ساعة بعد وضع البويضة ووضعها على شريط مزدوج من جانب واحد مع الجانب الظهري الذي يواجه ما يصل. أضف ملحاً من حشرات الرنين إلى بركة التشريح لحماية الأجنة من الجفاف.استخدم إبرة زجاجية تحت مجهر تشريح لسحب الجنين من الغشاء المتوسط من الشريط على الزجاج ، مع الحرص على عدم تلف الأنسجة الداخلية للجنين. ثم قطع من خلال خط منتصف جنين واحد على سطح انها من الجزء الخلفي إلى الطرف الأمامي. قم بقلب الأنسجة الظهارية من المركز وأرفق الحافة البشرة على سطح الشريحة الزجاجية.استخدام إبرة أنبوب متصلة مع فتح تلميح من حوالي 300 ميكرومتر لpirate أو ضربة الهواء لإزالة جذوع القصبة الهوائية الطولية الظهرية وكذلك أي الشجاعة المتبقية. استخدام 4٪ PFA وBBS لإصلاح الأجنة لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية. ثم يغسل لهم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.وصمة عار الأجنة مع ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة بيروكسيديز المضادة للفرس مترافق مع صبغة سيانين3 و 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة على شاكر المدارية. وكرر يغسل في برنامج تلفزيوني. لملء الحقن micropipette، وضعه في حامل الشعرية.في المكان التالي الشريحة صبغ على خشبة المسرح واستخدام micromanipulator لوضعها على الشريحة. ثم ضبط المرحلة لوضع micropipette على الصبغة. جمع الصبغة في micropipette عن طريق تحديد ضغط الحقن إلى ما بين 200 و 500 الهكتوباسكال, وقت الحقن بين 0.1 و 0.5 ثانية وضغط التعويض إلى الصفر لمدة خمس دقائق.مرة واحدة وقد تم جمع الصبغة، وإزالة الشريحة الصبغة ووضع العينة على مرحلة المجهر. ثم زيادة ضغط التعويض إلى مجموعة من 30 إلى 60 هيكتوباسكال وخفض micropipette في العينة. استخدم العدسة 10 مرات الهدف لتحديد مكان الجنين ومحاذاة micropipette مع الجنين.تغيير العدسة الهدف إلى غمر الماء 40 مرة العدسة. وغمر العدسة في برنامج تلفزيوني. استخدام المجهر الفلوريس للتأكد من مورفولوجيا الخلايا العصبية التي تميزت CyP Cy3 المضادة للHRP وتحديد موقع الحقن.عندما يكون الجنين في التركيز تغيير موقف micropipette لإجراء اتصال لطيف مع غيض من محور الاهتمام. ثم استخدام المجهر حقل مشرق أثناء الحقن لرؤية قطرات الصبغة. إسقاط الصبغة في تجزئة البطن الأيمن عند تقاطع عصبي عضلي من aCC أو RP3 مع إما DID أو DiO.استخدام السيطرة على اليد للافراج عن الصبغة وإزالة micropipette. ثم الانتقال إلى موقع الحقن التالي. احتضان العينة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المدارية قبل التصوير.باستخدام ملقط غرامة، وإزالة الأشرطة من الشريحة الزجاجية. لتركيب العينة، إعداد زلة غطاء مع كمية صغيرة من الشحوم فراغ في الزوايا الأربع. وضعت بعناية على العينة، مع التأكد من تجنب فقاعات الهواء.ادفع زلة الغطاء لأسفل لضبط المساحة من العينة للسماح بمسافة العمل بين العدسة الهدف والشريحة. إزالة أي برنامج تلفزيوني زائد مع مناديل المهمة. ختم تماما حواف زلة الغطاء مع طلاء الأظافر.الصورة في 10 مرات و 100 مرة التكبير مع المجهر confocal ومعالجة الصور ، مع برنامج imageJ. وقد استخدم هذا البروتوكول لتسمية الوراء الخلايا العصبية الحركية aCC إغراء العضلات واحد وRP3 الخلايا العصبية الحركية innervating العضلات ستة وسبعة. الفروع Dendritic من ACC وRP3 تظهر الخلايا العصبية الحركية تداخل واسع النطاق.كلا الخلايا العصبية هي ثنائي القطب، وإنشاء اثنين من مجموعات مختلفة من dendrites. لإثبات القدرات الكمية لهذه الطريقة، تم حساب العدد الإجمالي للنصائح dendrite في نوع البرية وDscam1 المسوخ. يتم عرض dendrites ipsilateral من aCC للنوع البرية ، ولكن لوحظت بعض dendrites إييسيراتال لتحول Dscam1.عند محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن حجم قطرة صبغ أمر بالغ الأهمية، وهو ما يقرب من 10 إلى 20 ميكرومتر. اختبار حجم الشريط على جانبين ثم تطبيقه على موقع الحقن. باستخدام هذا الإجراء، يمكننا الاستفادة من خاصية تحويل الصور من مسبار DID للحصول على صور فائقة الدقة لغشاء البلازما.بهذه الطريقة يمكننا دراسة التوصيف الهيكلي الفائق للأغشية المتشابكة عند الوصلة العصبية العضلية. فعلنا النقرة. قمنا بتحليل ظاهري للتشعبات aCC في سلالة متحولة ، واكتشفنا أن حقن Dscam1-Dock-Pak يحدد موقع التغرين المتجث في aCC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

تحليل التنمية Cardiomyocyte باستخدام المناعي في القلب الجنينية الماوس

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

منهج في النسب الانسحاب من الخلايا القرنية عن طريق متعدد الألوان مراسل الفلورسنت الفئران

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome على من التنميط<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; إنتاج الأبقار الأجنة قبل الزرع عن طريق اللونين ميكروأري منصة

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

في فيفو تتبع البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة في نموذج الفئران هشاشة العظام ركبة مع صبغ الغشاء محبتين نيون

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

تتبع التعبير الجيني من خلال الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة كله الماوس

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

تصور المورفولوجية الساق الحركية محاور عصبية من خلال بشرة الكبار

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

التتبع الوراثي الكلونال باستخدام الماوس الحلويات لدراسة الانسجه المعدنية

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...