Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Kamiyama Lab for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B. og D.K.).

1. udstyr og forsyninger
<ol><li>Materialer til opsamling af embryoner og uddannelse af voksne til at lægge æg<ol>
<li>Forbered filtrerings apparatet ved at afskære et 50 mL rør og skæring Åbn et hul i hætten for at indstille et trådfilter med porer på 100 μm (tabel over materialer) mellem røret og hætten. Bemærk: Alternativt kan celle filtrere med porer på 100 μm (tabel over materialer) anvendes til filtrerings trinnet for embryo opsamling.</li>
		<li>Der fastgøres ...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

Brugen af farvemærkning for at studere neuronal morfologi har flere fordele i forhold til genetiske celle-mærkning teknikker. Den farvemærkning teknik kan minimere mængden af tid, der er nødvendige for mærkning og billeddannelse morfologier af motor neuroner. Den farvemærkning proces er ganske hurtigt, da det tager mindre end 2 h og gør det muligt for os at definere skitse af neuronal projektioner. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motor neuron ved at vælge en GAL4 linje, der udtrykker gæren GAL4 trans...

Den embryonale motor neuron system af Drosophila tilbyder en kraftfuld eksperimentel model til at analysere de mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af centralnervesystemet (CNS)1,2,3. Motoren neuron systemet er modtagelig for biokemiske, genetiske, billeddannelse, og elektrofysiologiske teknikker. Ved hjælp af teknikker, genetiske manipulationer og funktionelle analyser kan udføres på niveau med enkelt motor neuroner2,4,5,6.
Under den tidlige udvikling af nervesystemet, Neuro Blaster kløft og generere et stort antal af glia og neuroner. Det rumlige forhold mellem delaminering og Neuro Blaster-profilen for genekspression er tidligere blevet undersøgt i detaljer7,8,9. For så vidt angår motorens neuron system, er dannelsen af embryonale neuromuskulære Junction (nmj) blevet grundigt undersøgt ved hjælp af aCC (anterior Corner Cell), RP2 (rå rejer 2), og RP5 motor neuroner2,10. For eksempel, når RP5 motor neuron danner en spirende synaptisk Junction, den præ-synaptisk og post-synaptisk filopodia er sammenblandet11,12,13. En sådan direkte cellulær kommunikation er afgørende for at initiere NMJ dannelse. I modsætning til hvad vi ved om de perifere nerve grene, er vores viden om, hvordan motor dendritter initierer synaptisk konnektivitet inden for CNS, stadig primitiv.
I denne rapport præsenterer vi en teknik, der tillader tilbage mærkning af motoriske neuroner i embryoner ved hjælp af mikropipette medieret levering af lipofile farvestoffer. Denne teknik gør det muligt for os at spore de 38 motor neuroner endelser hver af de 30 kropsvæg muskler i en Hemi-segment på 15 h efter æglægning (AEL)14. Ved at bruge denne teknik, har vores gruppe grundigt undersøgt talrige gevinst-af-funktion/tab-of-funktion alleler15,16,17. Vi har for nylig trævlet de molekylære mekanismer, der driver initiering af motor dendrit tilslutningsmuligheder og viste, at en Dscam1-Dock-Pak interaktion definerer stedet for dendrit udvækst i aCC motor neuron17. I almindelighed, denne teknik er tilpasningsdygtig til fænotypiske analyse af enhver embryonale motoriske neuroner i vilde type eller mutant stammer, forbedre vores evne til at give ny indsigt i den funktionelle design af Drosophila nervesystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Vi beskriver en teknik til tilbage mærkning af motoriske neuroner i Drosophila. Vi bruger en olie-opløst lipofile farvestof og levere en lille dråbe til en embryonal filet forberedelse af en mikroinjektor. Hver motor neuron, hvis membran er kontaktet af dråbe kan derefter hurtigt mærkes. Individuelle motoriske neuroner mærkes kontinuerligt, så fine strukturelle detaljer kan visualiseres tydeligt. I betragtning af, at lipofile farvestoffer kommer i forskellige farver, teknikken giver også et middel til at få tilstødende neuroner mærket i flerfarvet. Denne sporings teknik er derfor nyttig til at studere neuronal morfogenesis og synaptisk konnektivitet i motorens neuron system af Drosophila.

Et repræsentativt billede af aCC og RP3 motor neuroner er vist i figur 3C at demonstrere flerfarvet mærkning af motor NEURONER på 15 h AEL. Deres dendritiske morfologier er stort set invariant mellem embryoner. Det farvnings mønster, der opnås med anti-HRP-antistoffer, vises med gråt. En lille dråbe af DiO eller gjorde blev deponeret på NMJ af muskel 1 eller 6/7, hhv. Figur 4 viser evnen til kvantitativt at måle fænotype af interesse. ...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Vi beskriver en metode til tilbagesporing af Drosophila embryonale motor neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer.

Retrograde sporing af Drosophila embryonale motoriske neuroner ved hjælp af lipofile fluorescerende farvestoffer

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Den sporing teknik, der er beskrevet i denne protokol hjælper os med at studere neuronal morfogenese og snap forbindelsen i den motoriske neuron system af Drosophila. Den lipofile farvestof kan hurtigt diffuse til alle dele af cellulære membran med en ekstremt høj tæthed. Det er derfor, vores protokol effektivt løser at finde strukturer af en mærket neuron.Hvis en axonterminal er tilgængelig med en mikropipette til injektion, kan denne teknik anvendes på enhver neuron i larve- og voksenstadiet af fluer eller i andre organismer. Hvis du ikke har nogen erfaring dissekere eller ved hjælp af en microinjector præcis operationen på prøven, kan være udfordrende. Forståelse af anatomi af fosteret, vil hjælpe med vejledning til korrekt portioning af værktøjer til at udføre dissektion eller en dinjection.For at starte, forberede og layoute alle embryoopsamlingsmaterialer. Opbered filtreringsapparatet ved at skære et 50 milliliterrør af og åbne et hul i hætten. Sæt derefter et meshfilter med 100 mikrometerporer mellem røret og hætten.Forbered farvestof injektion mikropipette og dissektion nål fra samme kapillær slange med en indre diameter på 1,2 millimeter. Træk slangen med en mikropipette, puller på 7% fra 170 volt maksimal effekt for at skabe en skarp nål med en konus på omkring 0,4 centimeter i længden. For at forberede farvestoffet injektion mikropipette, sættehad kværnen med en befugtningsmiddel og placere nålen på mikropipette klemme på 25 til 30 grader.Sænk derefter spidsen ned på to tredjedele af radiussen ud fra midten af bevelingsoverfladen. Grind nålen, mens en sprøjte med slanger skubber luft ind i den. Marker mikropipetten med en fin spids permanent markør for at angive placeringen af åbningen på spidsen efter beveling, fordi det kan være udfordrende at finde den smalle åbning, der dannes i en vinkel.Lad fluerne lægge æg natten over ved stuetemperatur og opsaml røret med æggene om morgenen. For at indsamle embryoner, dechlorinere æggene på pladen med 50% blegemiddel i fem minutter. Når kloriderne er fjernet, hældes indholdet af pladen gennem filtreringsapparatet eller cellesen for at isolere embryonerne.Brug en squeeze flaske vand til at fortynde blegemiddel venstre på pladen og samle så mange embryoner som muligt ved at dekantere blandingen i filteret. Vask embryoner tre til fire gange med vand, indtil blegemiddel lugt spredes. Fjern filteret fra apparatet, og vask det på en anden ren plade med vand.Derefter dekanteres vandet fra den nye plade, som embryonerne er tændt. Brug fine hæcener til at vælge fem til 10 embryoner på 15 timer efter æglægning og placere dem på dobbeltsidet tape med dorsal side vender opad. Tilføj insektring saltvand til dissektion pool for at beskytte embryoner fra udsivning.Brug en glasnål under et diseksekseksemroskop til at trække fosteret ud fra midtermembranen fra båndet på glasset, og pas på ikke at beskadige embryonets indvendige væv. Skær derefter gennem midterlinjen af et enkelt foster på dens overflade fra dens bageste til forreste ende. Vend epitelvævet fra midten og fastgør epidermal kant på overfladen af glasdiaset.Brug et rør tilsluttet nål med en spids åbning på omkring 300 mikrometer til at aspirere eller blæse luft for at fjerne dorsale langsgående luftrørets kufferter samt eventuelle resterende indvolde. Brug 4% PFA og PBS til at fastgøre embryonerne i fem minutter ved stuetemperatur på en orbital shaker. Vask dem tre gange med PBS.Plette embryoner med en mikroliter af anti peberrod peroxidase antistof konjugeret med Cyanine3 farvestof og 200 mikroliter af PBS i en time på orbital shaker. Og gentag vaskene i PBS. For at fylde injektionsmikropipetten skal den sættes ind i kapillærholderen.Næste sted farvestof dias på scenen og bruge mikromanipulator til at placere den over diaset. Juster derefter scenen for at placere mikropipetten på farvestoffet. Farvestoffet opsamls i mikropipetten ved at indstille injektionstrykket til mellem 200 og 500 hektopascal, injektionstiden mellem 0,1 og 0,5 sekunder og kompensationstrykket til nul i fem minutter.Når farvestoffet er opsamlet, fjernes farveskredsen, og prøven anbringes på mikroskopstadiet. Forøg derefter kompensationstrykket til et interval på 30 til 60 hektopascal, og sænk derefter mikropipetten ned i prøven. Brug den 10 gange objektive linse til at lokalisere embryonet og tilpasse mikropipetten med fosteret.Skift objektivet til en vandnedsænkning 40 gange linse. Og nedsænke linsen i PBS. Brug fluorescensmikroskopi til at kontrollere den neuronale morfologi, der er kendetegnet ved anti-HRP Cy3, og fastgør injektionsstedet.Når embryonet er i fokus ændre placeringen af mikropipetten at gøre blid kontakt med spidsen af axon af interesse. Brug derefter lys feltmikroskopi under injektionen for at se farvedråbe. Drop farvestoffet i højre abdominal hemisegment ved neuromuskulær krydset af aCC eller RP3 med enten DiD eller DiO.Brug håndbetjeningen til at frigøre farvestoffet og fjerne mikropipetten. Gå derefter videre til det næste injektionssted. Prøven inkuberes i en time ved stuetemperatur på en orbitalshaser før billeddannelse.Brug fine vicessper, fjern båndene fra glasdiaset. For at montere prøven skal du forberede en dækselsseddel med en lille mængde vakuumfedt i de fire hjørner. Forsigtigt placeret det på prøven, og sørg for at undgå luftbobler.Tryk dækslet ned for at justere afstanden fra prøven, så der er arbejdsafstand mellem objektivets linse og diaset. Fjern eventuelt overskydende PBS med opgaveservietter. Luk helt kanterne af dækslet slip med neglelak.Billede på 10 gange og 100 gange forstørrelse med en konfokal mikroskop og behandle billederne, med imageJ software. Denne protokol blev brugt til at tilbageskridt etiketten aCC motor neuron innervating muskel en og RP3 motor neuron innervating muskler seks og syv. Dendritiske grene fra ACC og RP3 motor neuroner viser omfattende overlapning.Begge neuroner er bipolar, oprettelse af to forskellige populationer af dendritter. For at demonstrere den kvantitative kapacitet af denne metode blev det samlede antal dendrite-spidser talt med vild type og Dscam1-mutanter. Den ipsilateral dendrites af aCC er vist for den vilde type, men kun få ipsilateral dendritter blev observeret for Dscam1 mutant.Når du forsøger denne procedure, er det vigtigt at huske, at størrelsen af farvestofdråbe er afgørende, hvilket er ca. 10 til 20 mikrometer. Test størrelsen på det dobbeltsidede bånd, og anvend den derefter på injektionsstedet. Ved hjælp af denne procedure kan vi drage fordel af DiD-sondens fotoskiftelige egenskab for at få superopløsningsbilleder af plasmamembranen.På denne måde kan vi studere den ultra strukturelle karakterisering af de synaptiske membraner ved det neuromuskulære kryds. Vi gjorde det klik. Vi udførte fænotopypisk analyse af aCC-dendritterne i mutant stamme, og opdager, at en Dscam1-Dock-Pak injektion definerer stedet for dendrite udvækst i aCC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En Metode til Lineage Sporing af hornhindeceller Brug Multi-color Fluorescent Reporter Mus

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering<em&gt; In-vivo</em&gt; Produceret Bovine præimplantationsembryoner Brug To farve Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion og immunfluorescent farvning af champignon krop og fotoreceptor neuroner i voksen Drosophila melanogaster hjerner

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Sporing af menneskers fedt-afledt mesenkymale stamceller i en rotte knæet slidgigt Model med fluorescerende lipofile membran farvestof

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genekspression gennem påvisning af β-galactosidase aktivitet i hele musen embryoner

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualisere Drosophila ben Motor Neuron Axons gennem voksen neglebånd

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk sporing ved hjælp af Confetti-musen til at studere mineraliseret væv

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurale differentiering ved hjælp af enkelt cellekultur af humane embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...