Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Wij danken de leden van het Kamiyama Lab voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01 NS107558 (naar M.I., K.B., en D.K.).

1. uitrusting en benodigdheden
<ol><li>Materialen voor het verzamelen van embryo's en het trainen van volwassenen om eieren te leggen<ol>
<li>Bereid het filtratie apparaat door een buis van 50 mL te verbreken en snijd een gat in de dop open om een mesh filter met poriën van 100 μm (Inhoudsopgave) tussen de buis en de dop te zetten. Opmerking: als alternatief kunnen celstrainers met poriën van 100 μm (Inhoudsopgave) worden gebruikt voor de filtratie stap van de embryo verzameling...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

Het gebruik van kleurstof labeling voor het bestuderen van neuronale morfologie heeft verschillende voordelen ten opzichte van genetische cel-labeling technieken. De kleurstof etiketterings techniek kan de hoeveelheid tijd die nodig is voor het labelen en beeldvorming van de morfologieën van motorische neuronen minimaliseren. De kleurstof labeling proces is vrij snel als het duurt minder dan 2 h en stelt ons in staat om de omtrek van neuronale projecties definiëren. Als alternatief kan men de aCC motor neuron visualise...

Het embryonale motorische neuron systeem van Drosophila biedt een krachtig experimenteel model om de onderliggende mechanismen van de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel (CNS)1,2,3te analyseren. Het motorische neuron systeem is vatbaar voor biochemische, genetische, beeldvormende en elektrofysiologische technieken. Met behulp van de technieken kunnen genetische manipulaties en functionele analyses worden uitgevoerd op het niveau van de enkelvoudige motorneuronen2,4,5,6.
Tijdens de vroege ontwikkeling van het zenuwstelsel verdelen en genereren neuro blasten een groot aantal gli's en neuronen. De spatiotemporele relatie tussen de delaminatie en het genexpressie profiel van neuroblasten is eerder onderzocht in detail7,8,9. In het geval van het motorische neuron systeem is de vorming van embryonale neuromusculaire junctie (nmj) uitgebreid bestudeerd met behulp van de aCC (anterieure hoekcel), RP2 (RAW garnalen 2) en RP5 motorneuronen2,10. Bijvoorbeeld, wanneer de RP5 motor neuron vormt een ontluikende synaptische kruising, de vooraf synaptische en post-synaptische filopodia worden vermengd11,12,13. Dergelijke directe cellulaire communicatie is van vitaal belang voor het initiëren van de NMJ-formatie. In tegenstelling tot wat we weten over de perifere zenuw takken, onze kennis van hoe motor dendrites initiëren synaptische connectiviteit binnen het CZS is nog steeds primitief.
In dit rapport presenteren we een techniek die retrograde labeling van motorneuronen in embryo's mogelijk maakt door middel van micropipet-gemedieerde levering van lipofiele kleurstoffen. Deze techniek stelt ons in staat om de 38 motorneuronen te traceren die elk van de 30 lichaamsspieren in een Hemi-segment innervating op 15 h na het ei leggen (AEL)14. Door gebruik te maken van deze techniek heeft onze groep een grondige onderzoek uitgevoerd naar talrijke gain-of-functie/verlies-van-functie allelen15,16,17. We hebben onlangs de moleculaire mechanismen ontrafeld die de initiatie van de motorische dendriet-connectiviteit aandrijden en aangetoond dat een Dscam1-Dock-pak interactie de plaats van dendriet-uitgroei definieert in de aCC motor neuron17. Over het algemeen is deze techniek aanpasbaar voor de fenotypische analyse van embryonale motorneuronen in wild type-of Mutante stammen, wat ons vermogen om nieuwe inzichten in het functionele ontwerp van het zenuwstelsel van Drosophila te bieden verbetert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

We beschrijven een techniek voor het retrograde labelen van motorneuronen in Drosophila. We gebruiken een olie-opgeloste lipofiele kleurstof en leveren een kleine druppel aan een embryonale filet preparaat door een micro injector. Elke motor neuron wiens membraan wordt benaderd door de druppel kan vervolgens snel worden gelabeld. Individuele motorneuronen worden voortdurend gelabeld, waardoor fijne structurele details duidelijk kunnen worden gevisualiseerd. Gezien het feit dat lipofiele kleurstoffen komen in verschillende kleuren, de techniek biedt ook een middel om aangrenzende neuronen gelabeld in Multicolor. Deze traceer techniek is daarom nuttig voor het bestuderen van neuronale morfogenese en synaptische connectiviteit in het motorische neuron systeem van Drosophila.

Een representatief beeld van de aCC en RP3 motorneuronen wordt getoond in Figuur 3C om de Multicolor labeling van motorneuronen bij 15 h AEL aan te tonen. Hun dendritische morfologieën zijn grotendeels invariant tussen embryo's. Het kleurings patroon dat is verkregen met anti-HRP-antilichaam wordt grijs weergegeven. Een kleine druppeltje van DiO of deed werd afgezet op de NMJ van spier 1 of 6/7, respectievelijk. Figuur 4 toont het vermogen om h...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

De traceringstechniek beschreven in dit protocol helpt ons neuronale morfogenese te bestuderen en de connectiviteit in het motorneuronsysteem van Drosophila te breken. De lipofiele kleurstof kan snel verspreiden naar elk deel van het cellulaire membraan met een extreem hoge dichtheid. Dit is de reden waarom ons protocol efficiënt oplost om structuren van een gelabeld neuron te vinden.Als een axonterminal toegankelijk is met een injectiemicropipet, kan deze techniek worden toegepast op elk neuron in de larve- en volwassen stadia van vliegen of in andere organismen. Als u geen ervaring hebt met ontleden of het gebruik van een microinjector nauwkeurig de werking op het monster, kan een uitdaging zijn. Inzicht in de anatomie van het embryo, zal helpen met begeleiding om een goede portionering van instrumenten uit te voeren dissectie of een dinjection.Om alle embryo's te starten, voor te bereiden en in te stellen. Bereid het filtratieapparaat voor door een buis van 50 milliliter te snijden en een gat in de dop open te snijden. Stel vervolgens een meshfilter in met 100 micrometer poriën tussen de buis en de dop.Bereid de kleurstof injectie micropipet en dissectie naald uit dezelfde capillaire buizen met een binnendiameter van 1,2 millimeter. Trek de slang met een micropipet, trekker op 7%van 170 volt maximale output om een scherpe naald te creëren met een versmaling van ongeveer 0,4 centimeter in lengte. Ter voorbereiding van de kleurstof injectie micropipet, weken de molen met een bevochtigingsmiddel en plaats de naald op de micropipet klem op 25 tot 30 graden.Laat vervolgens de punt op twee derde van de straal uit het midden van het afschuindeoppervlak zakken. Maal de naald terwijl een spuit met slang duwt lucht in. Markeer de micropipet met een fijne punt permanente marker om de positie van de opening aan te geven aan de tip na het afschuinen, omdat het een uitdaging kan zijn om de smalle opening die wordt gevormd onder een hoek te lokaliseren.Laat de vliegen 's nachts eieren leggen op kamertemperatuur en verzamel de pijp met de eieren in de ochtend. Om de embryo's te verzamelen, dechlorinate de eieren op het bord met 50% bleekmiddel gedurende vijf minuten. Zodra de chlorions zijn gewist, giet de inhoud van de plaat door het filtratieapparaat of de celzeef om de embryo's te isoleren.Gebruik een knijpfles water om het bleekmiddel op de plaat te verdunnen en verzamel zoveel mogelijk embryo's door het mengsel in het filter te decanteren. Was de embryo's drie tot vier keer met water totdat de bleekmiddelgeur verdwijnt. Haal het filter uit het apparaat en was ze met water op een andere schone plaat.Decanteer vervolgens het water van de nieuwe plaat waarop de embryo's staan. Gebruik fijne tangen om vijf tot 10 embryo's te selecteren op 15 uur na het leggen van eieren en leg ze op dubbelzijdige tape met de rugzijde naar boven gericht. Voeg insectenring zou zout aan de dissectiepool om de embryo's te beschermen tegen uitdroging.Gebruik een glazen naald onder een dissectiemicroscoop om het embryo uit het middenmembraan van de tape op het glas te slepen, waarbij u ervoor zorgt dat de binnenweefsels van het embryo niet worden beschadigd. Snijd vervolgens door de middellijn van een enkel embryo op het oppervlak van het achterste naar het voorste uiteinde. Draai de epitheelweefsels vanuit het midden om en bevestig de opperhuidrand op het oppervlak van de glazen schuif.Gebruik een buis verbonden naald met een tip opening van ongeveer 300 micrometer aan te trekken of blazen lucht om de dorsale lengtetradine boomstammen evenals eventuele resterende ingewanden te verwijderen. Gebruik 4%PFA en PBS om de embryo's vijf minuten op kamertemperatuur te fixeren op een orbitale shaker. Was ze dan drie keer met PBS.Bevlek de embryo's met één microliter anti mierikswortelperoxidaseantilichaam geconjugeerd met Cyanine3 kleurstof en 200 microliter PBS gedurende een uur op de orbitale shaker. En herhaal de wasbeurten in PBS. Om de injectiemicropipet te vullen, plaats deze in de capillaire houder.Plaats vervolgens de kleurstof schuiven op het podium en gebruik de micromanipulator om het te plaatsen over de dia. Pas vervolgens het podium aan om de micropipet op de kleurstof te plaatsen. Verzamel de kleurstof in de micropipet door de injectiedruk in te stellen op tussen de 200 en 500 hectopascal, de injectietijd tussen 0,1 en 0,5 seconden en de compensatiedruk op nul gedurende vijf minuten.Zodra de kleurstof is verzameld, verwijder de kleurstof dia en plaats het monster op de microscoop stadium. Verhoog vervolgens de compensatiedruk tot een bereik van 30 tot 60 hectopascal en verlaag de micropipet in het monster. Gebruik de 10 keer objectieve lens om het embryo te lokaliseren en de micropipet uit te lijnen met het embryo.Verander de objectieve lens in een wateronderdompeling 40 keer lens. En dompel de lens onder in de PBS. Gebruik fluorescentiemicroscopie om de neuronale morfologie te controleren die wordt gekenmerkt door anti-HRP Cy3 en de injectieplaats te bepalen.Wanneer het embryo scherp is, verandert de positie van de micropipet om voorzichtig contact te maken met de punt van de axon van belang. Gebruik vervolgens heldere veldmicroscopie tijdens de injectie om de kleurstofdruppel te zien. Laat de kleurstof in het rechter buikhemisegment vallen op de neuromusculaire kruising van aCC of RP3 met DiD of DiO.Gebruik de handbediening om de kleurstof los te laten en de micropipet te verwijderen. Ga dan naar de volgende injectieplaats. Broed het monster een uur lang bij kamertemperatuur op een orbitale shaker voorafgaand aan de beeldvorming.Verwijder met behulp van fijne tangen de banden van de glazen schuif. Om het monster te monteren, bereid een deklip met een kleine hoeveelheid vacuümvet op de vier hoeken. Zorgvuldig geplaatst op het monster, zorg ervoor dat luchtbellen te voorkomen.Druk de afdekslip naar beneden om de ruimte van het monster aan te passen voor het toestaan van werkafstand tussen de objectieve lens en de dia. Verwijder overtollige PBS met taakdoekjes. Sluit de randen van de afdek slip volledig af met nagellak.Beeld bij 10 keer en 100 keer vergroting met een confocale microscoop en de beelden verwerken, met de imageJ-software. Dit protocol werd gebruikt om retrograde label van de aCC motorneuron innervating spier een en de RP3 motorneuron innervating spieren zes en zeven. Dendritische takken van de ACC en RP3 motorneuronen vertonen een grote overlap.Beide neuronen zijn bipolair, tot oprichting van twee verschillende populaties van dendrieten. Om de kwantitatieve mogelijkheden van deze methode aan te tonen, werd het totale aantal dendriettips geteld in wilde typen en Dscam1-mutanten. De ipsilaterale dendrieten van aCC worden getoond voor het wilde type, maar weinig ipsilaterale dendrieten werden waargenomen voor de Dscam1 mutant.Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de grootte van de kleurstof druppel is van cruciaal belang, dat is ongeveer 10 tot 20 micrometer. Test de grootte op de dubbelzijdige tape en breng deze vervolgens aan op de injectieplaats. Met behulp van deze procedure kunnen we profiteren van de foto schakelbare eigenschap van DiD-sonde om superresolutiebeelden van het plasmamembraan te verkrijgen.Op deze manier kunnen we de ultra structurele karakterisering van de synaptische membranen op de neuromusculaire verbinding bestuderen. We hebben de klik. We voerden fenotypische analyse uit van de aCC-dendrieten in mutantenstam, en ontdekten dat een Dscam1-Dock-Pak-injectie de plaats van de dendrietextgroei in aCC definieert.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse van Cardiomyocyte Development behulp Immuunfluorescentie in Embryonale Muis Hart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profilering van<em&gt; In-Vivo</em&gt; Geproduceerd Bovine Pre-implantatie embryo&#39;s met behulp van twee-kleuren Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissectie en immunefluorescentie kleuring van Mushroom lichaam en fotoreceptor neuronen in de hersenen van de volwassen Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualiseren van Drosophila been Motor Neuron axonen via de volwassen cuticula

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonale genetische tracing met de confetti muis om gemineraliseerde weefsels te bestuderen

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Efficiënte Neurale differentiatie met behulp van eencellige cultuur van menselijke embryonale stamcellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...