Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Nous remercions les membres du laboratoire Kamiyama pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par un NIH R01 NS107558 (à M.I., K.B., et D.K.).

1. Équipement et fournitures
<ol><li>Matériel pour la collecte d'embryons et la formation des adultes à pondre<ol>
<li>Préparer l'appareil de filtration en coupant un tube de 50 ml et en coupant un trou dans le bouchon pour régler un filtre à mailles avec des pores de 100 m(tableau des matériaux)entre le tube et le bouchon. REMARQUE : Alternativement, les passoires cellulaires avec des pores de 100 m(tableau des matériaux)peuvent être utilisées pour l'étape de filtration ...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

L'utilisation de l'étiquetage des colorants pour l'étude de la morphologie neuronale présente plusieurs avantages par rapport aux techniques d'étiquetage génétique des cellules. La technique d'étiquetage des colorants peut réduire au minimum le temps nécessaire à l'étiquetage et à l'imagerie des morphologies des neurones moteurs. Le processus d'étiquetage des colorants est assez rapide car il faut moins de 2 h et nous permet de définir le contour des projections neuronales. Comme alternative, on peut visual...

Le système de neurones moteurs embryonnaires de Drosophila offre un modèle expérimental puissant pour analyser les mécanismes sous-jacents au développement du système nerveux central (SNC)1,2,3. Le système de neurones moteurs est favorable aux techniques biochimiques, génétiques, d'imagerie et d'électrophysiologie. En utilisant les techniques, les manipulations génétiques et les analyses fonctionnelles peuvent être effectuées au niveau des neurones moteurs uniques2,4,5,6.
Au début du développement du système nerveux, les neuroblastes se divisent et génèrent un grand nombre de glies et de neurones. La relation spatiotemporale entre la délamination et le profil d'expression génique des neuroblastes a déjà été étudiée en détail7,8,9. Dans le cas du système de neurones moteurs, la formation de la jonction neuromusculaire embryonnaire (NMJ) a été largement étudiée en utilisant l'aCC (cellule d'angle antérieure), RP2 (crevette brute 2), et RP5 neurones moteurs2,10. Par exemple, lorsque le neurone moteur RP5 forme une jonction synaptique naissante, la filopodia pré-synaptique et post-synaptique se mêle11,12,13. Une telle communication cellulaire directe est essentielle pour initier la formation nMJ. Contrairement à ce que nous savons sur les branches nerveuses périphériques, notre connaissance de la façon dont les dendrites motrices initier la connectivité synaptique au sein du SNC est encore primitive.
Dans ce rapport, nous présentons une technique qui permet l'étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans les embryons au moyen de la livraison micropipette-négociée des colorants lipophiles. Cette technique nous permet de retracer les 38 neurones moteurs qui intériorisent chacun des 30 muscles de la paroi du corps dans un segment d'hémi à 15 h après la ponte (AEL)14. En utilisant cette technique, notre groupe a étudié à fond de nombreux gains de fonction/perte de fonction alleles15,16,17. Nous avons récemment démêlé les mécanismes moléculaires qui conduisent l'initiation de la connectivité de dendrite moteur et démontré qu'une interaction Dscam1-Dock-Pak définit le site de la croissance dendrite dans le neurone moteur aCC17. En général, cette technique est adaptable pour l'analyse phénotypique de tous les neurones moteurs embryonnaires de type sauvage ou souches mutantes, ce qui améliore notre capacité à fournir de nouvelles informations sur la conception fonctionnelle du système nerveux Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Nous décrivons une technique pour l'étiquetage rétrograde des neurones moteurs dans Drosophila. Nous utilisons un colorant lipophile dissous à l'huile et livrons une petite gouttelette à une préparation de filet embryonnaire par un micro-injecteur. Chaque neurone moteur dont la membrane est contactée par la gouttelette peut alors être rapidement étiqueté. Les neurones moteurs individuels sont continuellement étiquetés, ce qui permet de visualiser clairement les détails structuraux fins. Étant donné que les colorants lipophiles viennent dans différentes couleurs, la technique fournit également un moyen d'obtenir des neurones adjacents étiquetés en multicolore. Cette technique de traçage est donc utile pour étudier la morphogénèse neuronale et la connectivité synaptique dans le système de neurones moteurs de Drosophila.

Une image représentative des neurones moteurs aCC et RP3 est montrée dans la figure 3C pour démontrer l'étiquetage multicolore des neurones moteurs à 15 h AEL. Leurs morphologies dendritiques sont en grande partie invariantes entre les embryons. Le modèle de coloration obtenu avec l'anticorps anti-HRP est montré en gris. Une petite gouttelette de DiO ou DiD a été déposée sur le NMJ du muscle 1 ou 6/7, respectivement. La figure 4 démo...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Nous décrivons une méthode pour le traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires de Drosophila utilisant des colorants fluorescents lipophiles.

Traçage rétrograde des neurones moteurs embryonnaires drosophila à l'aide de colorants fluorescents lipophiles

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

La technique de traçage décrite dans ce protocole nous aide à étudier la morphogenèse neuronale et à casser la connectivité dans le système de neurones moteurs de Drosophila. Le colorant lipophile peut rapidement se propager à toutes les parties de la membrane cellulaire avec une densité extrêmement élevée. C’est pourquoi notre protocole se résout efficacement à trouver les structures d’un neurone étiqueté.Si un terminal d’axone est accessible avec une micropipette d’injection, cette technique pourrait être appliquée à n’importe quel neurone dans les stades larvaires et adultes des mouches ou dans d’autres organismes. Si vous n’avez aucune expérience de disséquer ou d’utiliser un microinjecteur précis de l’opération sur le spécimen, peut être difficile. Comprendre l’anatomie de l’embryon, aidera avec des conseils à la portion appropriée des outils pour effectuer la dissection ou une dinjection.Pour commencer, préparer et mettre en page tous les matériaux de collecte d’embryons. Préparer l’appareil de filtration en coupant un tube de 50 millilitres et en coupant un trou dans le bouchon. Ensuite, placez un filtre à mailles avec 100 pores micromètres entre le tube et le bouchon.Préparer la micropipette d’injection de colorant et l’aiguille de dissection du même tube capillaire d’un diamètre intérieur de 1,2 millimètre. Tirez le tube avec une micropipette, puller à 7%de 170 volts sortie maximale pour créer une aiguille pointue avec un cône d’environ 0,4 centimètres de longueur. Pour préparer la micropipette d’injection de colorant, faire tremper le broyeur avec un agent mouillant et placer l’aiguille sur la pince de micropipette à 25 à 30 degrés.Puis abaissez la pointe sur les deux tiers du rayon à partir du centre de la surface biseautante. Moudre l’aiguille pendant qu’une seringue avec tube pousse l’air dedans. Marquez la micropipette avec un marqueur permanent à pointe fine pour indiquer la position de l’ouverture à la pointe après le biseauté, car il peut être difficile de localiser l’ouverture étroite qui se forme à un angle.Laissez les mouches pondre des œufs toute la nuit à température ambiante et recueillez le tuyau avec les œufs le matin. Pour recueillir les embryons, déchlorer les œufs dans l’assiette avec 50% d’eau de Javel pendant cinq minutes. Une fois les chlorions effacées, versez le contenu de la plaque à travers l’appareil de filtration ou la passoire cellulaire pour isoler les embryons.Utilisez une bouteille d’eau de compression pour diluer l’eau de Javel laissée sur la plaque et recueillir autant d’embryons que possible en décantant le mélange dans le filtre. Laver les embryons trois à quatre fois avec de l’eau jusqu’à ce que l’odeur d’eau de Javel se dissipe. Retirez le filtre de l’appareil et lavez-le sur une autre assiette propre avec de l’eau.Puis décanter l’eau de la nouvelle plaque que les embryons sont sur. Utilisez des forceps fins pour sélectionner cinq à dix embryons à 15 heures après la ponte et placez-les sur du ruban adhésif à double face avec le côté dorsal orienté vers le haut. Ajouter la solution saline de sonnerie d’insectes à la piscine de dissection pour protéger les embryons contre la dessiccation.Utilisez une aiguille en verre sous un microscope à dissection pour faire glisser l’embryon hors de la membrane de middling de la bande sur le verre, en prenant soin de ne pas endommager les tissus intérieurs de l’embryon. Ensuite, couper à travers la ligne médiane d’un seul embryon à sa surface de son postérieur à l’extrémité antérieure. Retournez les tissus épithéliales du centre et fixez le bord épidermique sur la surface de la glissière de verre.Utilisez une aiguille reliée par tube avec une ouverture de pointe d’environ 300 micromètres pour aspirer ou souffler de l’air pour enlever les troncs trachéaux longitudinals dorsal ainsi que les intestins restants. Utilisez 4%PFA et PBS pour fixer les embryons pendant cinq minutes à température ambiante sur un shaker orbital. Ensuite, lavez-les trois fois avec PBS.Tacher les embryons avec un microlitre d’anticorps anti-raifort peroxidase conjugué avec le colorant Cyanine3 et 200 microlitres de PBS pendant une heure sur le shaker orbital. Et répétez les lavages dans PBS. Pour remplir la micropipette d’injection, placez-la dans le support capillaire.Placez ensuite la glissade de teinture sur la scène et utilisez le micromanipulateur pour le positionner au-dessus de la glissière. Ajustez ensuite la scène pour placer la micropipette sur le colorant. Recueillir le colorant dans la micropipette en fixant la pression d’injection entre 200 et 500 hectopascal, le temps d’injection entre 0,1 et 0,5 secondes et la pression de compensation à zéro pendant cinq minutes.Une fois que le colorant a été recueilli, retirez la toboggan de teinture et placez l’échantillon sur le stade du microscope. Ensuite, augmenter la pression de compensation à une gamme de 30 à 60 hectopascal et abaisser la micropipette dans l’échantillon. Utilisez la lentille 10 fois objective pour localiser l’embryon et aligner la micropipette avec l’embryon.Changer l’objectif de lentille à une immersion d’eau 40 fois lentille. Et submerger la lentille dans le PBS. Utilisez la microscopie de fluorescence pour vérifier la morphologie neuronale marquée par l’anti-HRP Cy3 et déterminer le site d’injection.Lorsque l’embryon est au point changer la position de la micropipette pour entrer en contact doux avec la pointe de l’axon d’intérêt. Ensuite, utilisez la microscopie de champ lumineux pendant l’injection pour voir la gouttelette de colorant. Déposez le colorant dans l’hémisegment abdominal droit à la jonction neuromusculaire de l’aCC ou du RP3 avec did ou dio.Utilisez le contrôle de la main pour libérer le colorant et enlever la micropipette. Passez ensuite au site d’injection suivant. Incuber l’échantillon pendant une heure à température ambiante sur un shaker orbital avant l’imagerie.À l’aide de forceps fins, retirer les bandes de la glissière de verre. Pour monter l’échantillon, préparer un glissement de couvercle avec une petite quantité de graisse sous vide aux quatre coins. Placez-le soigneusement sur l’échantillon, en vous assurant d’éviter les bulles d’air.Poussez vers le bas le glissement de couverture pour ajuster l’espace de l’échantillon pour permettre la distance de travail entre l’objectif et la glissière. Retirez tout excès de PBS avec des lingettes de tâches. Sceller complètement les bords du bordereau de couverture avec du vernis à ongles.Image à 10 fois et 100 fois grossissement avec un microscope confocal et traiter les images, avec le logiciel imageJ. Ce protocole a été employé pour rétrograder l’étiquette le muscle innervating de neurone de moteur d’aCC un et le neurone moteur RP3 innervating muscles six et sept. Les branches dendritiques des neurones moteurs ACC et RP3 présentent un chevauchement important.Les deux neurones sont bipolaires, établissant deux populations différentes de dendrites. Pour démontrer les capacités quantitatives de cette méthode, le nombre total de pointes de dendrite a été compté dans le type sauvage et les mutants Dscam1. Les dendrites ipsilateral d’aCC sont montrés pour le type sauvage, mais peu de dendrites ipsilateral ont été observés pour le mutant de Dscam1.Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que la taille de la gouttelette de teinture est cruciale, qui est d’environ 10 à 20 micromètres. Testez la taille sur le ruban à double face, puis appliquez-le sur le site d’injection. En utilisant cette procédure, nous pouvons profiter de la propriété commutable photo de la sonde DiD pour obtenir des images de super résolution de la membrane plasmatique.De cette façon, nous pouvons étudier la caractérisation ultra structurelle des membranes synaptiques à la jonction neuromusculaire. On a fait le clic. Nous avons effectué l’analyse phénotypique des dendrites d’aCC dans la souche mutante, et découvrons qu’une injection de Dscam1-Dock-Pak définit le site de l’excroissance dendrite dans aCC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse du développement des cardiomyocytes par immunofluorescence dans le Coeur embryonnaires de souris

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Recherche

Biologie du développement

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Une méthode pour Lineage Tracing de cellules de la cornée Utilisation du Multi-couleurs Souris rapporteur fluorescent

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome profilage des<em&gt; In-Vivo</em&gt; embryons de bovins pré-implantation à l&#39;aide de deux couleurs Microarray Plate-forme

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Suivi des humains dérivés adipeux cellules souches mésenchymateuses dans un modèle de l’arthrose du genou de Rat avec un colorant Fluorescent Membrane lipophiles

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Suivi de l’Expression génique par la détection d’activité β-galactosidase dans des embryons de souris entière

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualiser les Drosophila jambe axones des motoneurones à travers la cuticule de l’adulte

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Dégel, cultivant et cryoconservation des lignées de cellules de drosophile

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Tracing génétique clonale à l'aide de la souris confettis pour étudier les tissus minéralisés

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...