Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Wir danken den Mitgliedern des Kamiyama Lab für die Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 NS107558 (nach M.I., K.B. und D.K.) unterstützt.

1. Ausrüstung und Zubehör
<ol><li>Materialien für das Sammeln von Embryonen und die Ausbildung von Erwachsenen zum Eierlegen<ol>
<li>Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50 ml-Rohr abtrennen und ein Loch in der Kappe öffnen, um einen Netzfilter mit Poren von 100 m (Materialtabelle) zwischen Rohr und Kappe zu setzen. HINWEIS: Alternativ können Zellsiebe mit Poren von 100 m (Materialtabelle) für den Filtrationsschritt der Embryoentnahme verwendet werden.</li>
		<li>A...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

Die Verwendung von Farbstoffkennzeichnungen zur Untersuchung der neuronalen Morphologie hat mehrere Vorteile gegenüber genetischen Zelletikettierungstechniken. Die Färbeetikettierungstechnik kann den Zeitaufwand für die Etikettierung und Abbildung der Morphologien von motorischen Neuronen minimieren. Der Färbeetikettierungsprozess ist recht schnell, da er weniger als 2 h dauert und es uns ermöglicht, die Umrisse neuronaler Projektionen zu definieren. Alternativ kann man das aCC-Motorneuron visualisieren, indem man e...

Das embryonale motorische Neuronensystem von Drosophila bietet ein leistungsfähiges experimentelles Modell zur Analyse der Mechanismen, die der Entwicklung des Zentralnervensystems (ZNS)1,2,3zugrunde liegen. Das motorische Neuronensystem ist für biochemische, genetische, bildgebende und elektrophysiologische Techniken zugänglich. Mit den Techniken können genetische Manipulationen und funktionelle Analysen auf der Ebene der einzelnen motorischen Neuronen2,4,5,6durchgeführt werden.
Während der frühen Entwicklung des Nervensystems, Neuroblasten teilen und erzeugen eine große Anzahl von Glia und Neuronen. Die räumlich-zeitliche Beziehung zwischen der Delamination und dem Genexpressionsprofil von Neuroblasten wurde zuvor im Detail untersucht7,8,9. Im Falle des motorischen Neuronsystems wurde die Bildung embryonaler neuromuskulärer Knoten (NMJ) mit dem aCC (vordere Eckzelle), RP2 (Rohgarnelen 2) und RP5 Motorneuronen2,10ausgiebig untersucht. Wenn das RP5-Motorneuron beispielsweise eine entstehende synaptische Verbindung bildet, werden die präsynaptischen und postsynaptischen Filopodia11,12,13vermischt. Eine solche direkte zelluläre Kommunikation ist entscheidend, um die NMJ-Bildung zu initiieren. Im Gegensatz zu dem, was wir über die peripheren Nervenzweige wissen, ist unser Wissen darüber, wie motorische Dendriten eine synaptische Konnektivität innerhalb des ZNS initiieren, immer noch primitiv.
In diesem Bericht stellen wir eine Technik vor, die eine retrograde Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Embryonen mittels mikropipettevermittelter Abgabe lipophiler Farbstoffe ermöglicht. Diese Technik ermöglicht es uns, die 38 motorischen Neuronen zu verfolgen, die jede der 30 Körperwandmuskeln in einem Hemi-Segment bei 15 h nach Dereiablage (AEL)14innervieren. Mit dieser Technik hat unsere Gruppe zahlreiche Funktionsverstärkungs-/Funktionsverlust-Allele15,16,17gründlich untersucht. Wir haben vor kurzem die molekularen Mechanismen entwirrt, die die Initiierung der motorischen Dendritenkonnektivität vorantreiben, und gezeigt, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Interaktion den Ort des Dendritenauswachsens im aCC-Motorneuron17definiert. Im Allgemeinen ist diese Technik anpassungsfähig für die phänotypische Analyse von embryonalen motorischen Neuronen in wilden Typ- oder mutierten Stämmen, was unsere Fähigkeit verbessert, neue Einblicke in das funktionelle Design des Drosophila-Nervensystems zu geben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Wir beschreiben eine Technik zur retrograden Kennzeichnung von motorischen Neuronen in Drosophila. Wir verwenden einen ölaufgelösten lipophilen Farbstoff und liefern ein kleines Tröpfchen an ein embryonales Filetpräparat durch einen Mikroinjektor. Jedes Motorneuron, dessen Membran vom Tröpfchen kontaktiert wird, kann dann schnell beschriftet werden. Einzelne Motorneuronen werden kontinuierlich beschriftet, so dass feine Strukturdetails klar visualisiert werden können. Da lipophile Farbstoffe in verschiedenen Farben erhältlich sind, bietet die Technik auch ein Mittel, um benachbarte Neuronen in mehrfarbig beschriftet zu bekommen. Diese Tracing-Technik ist daher nützlich für die Untersuchung der neuronalen Morphogenese und synaptischen Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila.

Ein repräsentatives Bild der motorischen Neuronen aCC und RP3 ist in Abbildung 3C dargestellt, um die mehrfarbige Kennzeichnung von motorischen Neuronen bei 15 h AEL zu demonstrieren. Ihre dendritischen Morphologien sind weitgehend invariant zwischen Embryonen. Das mit Anti-HRP-Antikörpern erhaltene Färbemuster ist grau dargestellt. Ein kleines Tröpfchen DiO oder DiD wurde auf dem NMJ von Muskel 1 bzw. 6/7 abgelagert. Abbildung 4 zeigt die F...

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Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Wir beschreiben eine Methode zur retrograden Rückverfolgung der embryonalen motorischen Neuronen Von Drosophila mit lipophilen Fluoreszenzfarbstoffen.

Retrograde Tracing von Drosophila Embryonal Motor Neuronen mit lipophilen fluoreszierenden Farbstoffen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Die in diesem Protokoll beschriebene Tracing-Technik hilft uns, neuronale Morphogenese zu studieren und die Konnektivität im motorischen Neuronensystem von Drosophila zu schnappen. Der lipophile Farbstoff kann schnell auf jeden Teil der Zellmembran mit einer extrem hohen Dichte diffundieren. Aus diesem Grund löst unser Protokoll effizient, Strukturen eines markierten Neurons zu finden.Wenn ein Axonterminal mit einer Injektionsmikropipette zugänglich ist, könnte diese Technik auf jedes Neuron in den Larven- und Erwachsenenstadien von Fliegen oder in anderen Organismen angewendet werden. Wenn Sie keine Erfahrung mit der Sezieren oder Verwendung eines Mikroinjektors haben, der die Operation an der Probe präzise, kann dies eine Herausforderung darstellen. Das Verständnis der Anatomie des Embryos, wird mit Anleitung zu richtigen Portionierung von Werkzeugen helfen, um Sezieren oder eine Dinjektion durchzuführen.Um zu beginnen, vorzubereiten und Layout alle Embryo-Sammlung Materialien. Bereiten Sie das Filtergerät vor, indem Sie ein 50-Milliliter-Rohr abtrennen und ein Loch in der Kappe öffnen. Legen Sie dann einen Netzfilter mit 100 Mikrometer Poren zwischen rohr und kappe n.A. fest.Bereiten Sie die Farbstoffinjektionsmikropipette und Diesektionsnadel aus demselben Kapillarschlauch mit einem Innendurchmesser von 1,2 Millimetern vor. Ziehen Sie die Schläuche mit einer Mikropipette, Ziehen bei 7% von 170 Volt maximale Leistung, um eine scharfe Nadel mit einer Verjüngung von etwa 0,4 Zentimeter n Länge zu schaffen. Um die Farbstoffinjektionsmikropipette vorzubereiten, den Schleifer mit einem Benetzungsmittel einweichen und die Nadel auf die Mikropipetteklemme bei 25 bis 30 Grad legen.Senken Sie dann die Spitze auf zwei Drittel des Radius aus der Mitte der Abschrägungsfläche heraus. Schleifen Sie die Nadel, während eine Spritze mit Schläuchen Luft hineinschiebt. Markieren Sie die Mikropipette mit einem feinspitzen permanenten Marker, um die Position der Öffnung an der Spitze nach dem Abschrägen anzuzeigen, da es schwierig sein kann, die schmale Öffnung zu lokalisieren, die in einem Winkel gebildet wird.Lassen Sie die Fliegen Eier über Nacht bei Raumtemperatur legen und sammeln Sie die Pfeife mit den Eiern am Morgen. Um die Embryonen zu sammeln, entchloren Sie die Eier auf dem Teller mit 50% Bleichmittel für fünf Minuten. Sobald die Chlorionen geklärt sind, gießen Sie den Inhalt der Platte durch das Filtrationsgerät oder Zellsieb, um die Embryonen zu isolieren.Verwenden Sie eine Squeeze-Flasche Wasser, um die Bleichmittel auf dem Teller zu verdünnen und so viele Embryonen wie möglich zu sammeln, indem Sie die Mischung in den Filter dekantieren. Waschen Sie die Embryonen drei- bis viermal mit Wasser, bis sich der Bleichgeruch auflöst. Entfernen Sie den Filter aus dem Gerät und waschen Sie ihn auf eine andere saubere Platte mit Wasser.Dann dekantieren Sie das Wasser von der neuen Platte, auf der sich die Embryonen befinden. Verwenden Sie feine Zangen, um fünf bis zehn Embryonen bei 15 Stunden nach der Eiablage auszuwählen und legen Sie sie auf doppelseitiges Klebeband mit der dorsalen Seite nach oben. Fügen Sie Insektenringer-Salzin in den Sezierpool, um die Embryonen vor Austrocknung zu schützen.Verwenden Sie eine Glasnadel unter einem Seziermikroskop, um den Embryo aus der Middling-Membran aus dem Band auf das Glas zu ziehen, wobei darauf geachtet wird, dass das innere Gewebe des Embryos nicht beschädigt wird. Dann durchschneiden Sie die Mittellinie eines einzelnen Embryos an seiner Oberfläche von seinem hinteren zum vorderen Ende. Drehen Sie das Epithelgewebe von der Mitte und befestigen Sie die epidermale Kante an der Oberfläche des Glasschlittens.Verwenden Sie eine Rohr-verbundene Nadel mit einer Spitzenöffnung von etwa 300 Mikrometern, um Luft zu aspirieren oder zu blasen, um die dorsalen Längs-Trachealstämme sowie alle verbleibenden Eingeweide zu entfernen. Verwenden Sie 4%PFA und PBS, um die Embryonen für fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker zu fixieren. Dann waschen Sie sie dreimal mit PBS.Färben Sie die Embryonen mit einem Mikroliter Anti-Meerrettichperoxidase-Antikörper, der mit Cyanine3-Farbstoff konjugiert ist, und 200 Mikroliter PBS für eine Stunde auf dem Orbitalshaker. Und wiederholen Sie die Wähungen in PBS. Um die Injektionsmikropipette zu füllen, legen Sie sie in den Kapillarhalter.Als nächstes legen Sie den Farbstoff auf die Bühne und verwenden Sie den Mikromanipulator, um ihn über dem Schlitten zu positionieren. Passen Sie dann die Bühne an, um die Mikropipette auf den Farbstoff zu legen. Sammeln Sie den Farbstoff in der Mikropipette, indem Sie den Injektionsdruck auf 200 bis 500 Hektopascal, die Injektionszeit zwischen 0,1 und 0,5 Sekunden und den Kompensationsdruck auf Null für fünf Minuten einstellen.Sobald der Farbstoff gesammelt wurde, entfernen Sie den Farbstoffschlitten und legen Sie die Probe auf die Mikroskopstufe. Erhöhen Sie dann den Kompensationsdruck auf einen Bereich von 30 bis 60 Hektopascal und senken Sie die Mikropipette in die Probe. Verwenden Sie die 10-fache Objektivlinse, um den Embryo zu lokalisieren und die Mikropipette mit dem Embryo auszurichten.Ändern Sie die Objektivlinse in eine 40-fache Linse. Und tauchen Sie die Linse in die PBS. Verwenden Sie Fluoreszenzmikroskopie, um die neuronale Morphologie zu überprüfen, die durch Anti-HRP Cy3 gekennzeichnet ist, und bestimmen Sie die Injektionsstelle.Wenn der Embryo im Fokus ist, ändern Sie die Position der Mikropipette, um sanften Kontakt mit der Spitze des Axons von Interesse zu machen. Verwenden Sie dann die Hellfeldmikroskopie während der Injektion, um das Farbstofftröpfchen zu sehen. Lassen Sie den Farbstoff im rechten Bauchhemisegment an der neuromuskulären Kreuzung von aCC oder RP3 entweder mit DiD oder DiO fallen.Verwenden Sie die Handsteuerung, um den Farbstoff loszulassen und die Mikropipette zu entfernen. Fahren Sie dann zur nächsten Injektionsstelle. Inkubieren Sie die Probe für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker vor der Bildgebung.Entfernen Sie die Bänder mit feinen Zangen von der Glasrutsche. Um die Probe zu montieren, bereiten Sie einen Abdeckschlupf mit einer kleinen Menge Vakuumfett an den vier Ecken vor. Legen Sie es vorsichtig auf die Probe, um sicherzustellen, dass Luftblasen zu vermeiden.Drücken Sie den Deckelbeleg nach unten, um den Abstand von der Probe anzupassen, um den Arbeitsabstand zwischen der Objektivlinse und dem Dia zu ermöglichen. Entfernen Sie überschüssige PBS mit Aufgabentüchern. Die Ränder des Deckelschlupfs vollständig mit Nagellack versiegeln.Bild bei 10-facher und 100-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskop und verarbeiten die Bilder mit der imageJ-Software. Dieses Protokoll wurde verwendet, um das aCC Motorneuron innervating Muskel eins und die RP3 Motor Neuron innervating Muskeln sechs und sieben retrograd. Dendritische Zweige aus den Motorneuronen ACC und RP3 weisen eine große Überlappung auf.Beide Neuronen sind bipolar und stellen zwei verschiedene Populationen von Dendriten her. Um die quantitativen Fähigkeiten dieser Methode zu demonstrieren, wurde die Gesamtzahl der Dendritenspitzen in Wildtyp- und Dscam1-Mutanten gezählt. Die ipsilateralen Dendriten von aCC werden für den wilden Typ gezeigt, aber nur wenige ipsilaterale Dendriten wurden für die Dscam1 Mutant beobachtet.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Größe des Farbstofftröpfchens entscheidend ist, die etwa 10 bis 20 Mikrometer beträgt. Testen Sie die Größe auf dem doppelseitigen Band, und wenden Sie sie dann auf die Injektionsstelle an. Mit diesem Verfahren können wir die fotoschaltbare Eigenschaft der DiD-Sonde nutzen, um hochauflösende Bilder der Plasmamembran zu erhalten.Auf diese Weise können wir die ultrastrukturelle Charakterisierung der synaptischen Membranen an der neuromuskulären Kreuzung untersuchen. Wir haben den Klick gemacht. Wir führten eine phänotypische Analyse der aCC Dendriten in mutierter Sorte durch und entdecken, dass eine Dscam1-Dock-Pak-Injektion die Stelle des Dendritenauswachsens in aCC definiert.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse Cardiomyocyte Entwicklung mit Immunfluoreszenz in embryonalen Maus Herz

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilieren<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Genexpression durch Nachweis der Aktivität der β-Galaktosidase in ganze Mausembryonen

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Drosophila Bein Motoneuronen Axone durch die Erwachsenen Nagelhaut zu visualisieren

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Auftauen, Kultivierung und Cryopreserving Drosophila -Zell-Linien

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Clonale genetische Tracing mit der Konfetti-Maus zur Untersuchung mineralisierter Gewebe

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effiziente neuronale Differenzierung mit einzelzellischer Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...