Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

אנו מודים לחברי מעבדת קמיאיאמה על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכת על-ידי NIH R01 NS107558 (למ, K.B. ו-D.K.).

1. ציוד ואספקה
<ol><li>חומרים לאיסוף עוברים והכשרת מבוגרים להטיל ביצים<ol>
<li>הכן את מנגנון הסינון על ידי ניתוק שפופרת 50 mL וחיתוך לפתוח חור כובע כדי להגדיר מסנן רשת שינוי עם נקבוביות של 100 יקרומטר (טבלת חומרים) בין הצינור לבין הכובע. הערה: לחלופין, משתמשים בתאים עם נקבוביות של 100 יקרומט?...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

השימוש בתיוג צבע ללימוד מורפולוגיה עצבית יש מספר יתרונות על טכניקות גנטיות של תיוג תאים. הטכניקה תיוג צבע יכול למזער את כמות הזמן הדרוש לתיוג והדמיה של מורפולוגיות של נוירונים מוטוריים. תהליך תיוג הצבע הוא מהיר למדי כפי שלוקח פחות מ 2 h ומאפשר לנו להגדיר את המתאר של התחזיות הנוירואליות. כחל...

מערכת העצב המוטורית העובריים של דרוסופילה מציעה מודל ניסיוני רב-עוצמה כדי לנתח את המנגנונים שבבסיס הפיתוח של מערכת העצבים המרכזית (cn)1,2,3. מערכת העצב המוטורית היא קלה לטכניקות ביוכימיות, גנטיות, דימות ואלקטרופיזיולוגיה. באמצעות טכניקות, מניפולציות גנטיות וניתוחים פונקציונליים ניתן לבצע ברמת הנוירונים מנוע יחיד2,4,5,6.
במהלך ההתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים, הפער המפורז ויצירת מספר רב של גליה ונוירונים. מערכת היחסים הטמפורלית בין הדלאמנציה לבין ביטוי הגנים פרופיל של neuroblasts נחקרו בעבר בפירוט7,8,9. במקרה של מערכת תא העצב מנוע, היווצרות של הצומת העצבי העובריים (NMJ) נחקרו בהרחבה באמצעות aCC (תא בפינה הקדמית), RP2 (סרטנים גולמיים 2), ו RP5 מוטוריים נוירונים2,10. למשל, כאשר תא העצב המוטורי RP5 מהווה צומת סינפטיות המתהווה, הפרה-סינפטית ופוסט-סינפטית התערבבו בין11,12,13. תקשורת סלולרית ישירה כזו חיונית ליזום את היווצרות NMJ. בניגוד למה שאנחנו יודעים על הענפים העצביים ההיקפית, הידע שלנו איך הדנדריטים מוטוריים ליזום קישוריות סינפטית בתוך ה-CN הוא עדיין פרימיטיבי.
בדו ח זה, אנו מציגים טכניקה המאפשרת התיוג נסיגה של נוירונים מוטוריים העוברים באמצעות מיקרופיפטה-תיווך משלוח של צבעי ליפוליים. טכניקה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר 38 הנוירונים מנוע innervating כל אחד 30 שרירי הקיר הגוף בפלח חמי ב 15 h לאחר הנחת ביצה (ח. א.)14. על-ידי שימוש בטכניקה זו, הקבוצה שלנו חקרה ביסודיות מספר רב של כולל של הפונקציה/אובדן של התפקוד הכולל,15,16,17. לאחרונה יש לנו את המנגנונים המולקולריים כי הכונן ייזום של קישוריות מוטורית של דנדריטים והפגינו כי Dscam1-Dock-פאק האינטראקציה מגדירה את האתר של דנדריטים מוצלח בתוך תא מנוע aCC17. באופן כללי, טכניקה זו היא להתאמה לניתוח פנוטיפ של כל הנוירונים מוטוריים מתחלקים בסוג פראי או זנים מוטציה, שיפור היכולת שלנו לספק תובנות חדשות לתוך העיצוב הפונקציונלי של מערכת העצבים Drosophila ילה .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

אנו מתארים טכניקה לנסיגה של הנוירונים מוטוריים בדרוסופילה. אנו משתמשים בדיו מומס שמן ולספק droplet קטן להכנת פילה עובריים על ידי מיקרומזרק. כל תא העצב מנוע שהקרום שלו נוצר על ידי ה-droplet יכול להיות מתויג במהירות. מנוע נוירונים בודדים מתויג ברציפות, המאפשר פרטים מבניים עדינים להיות דמיינו בבירור. בהינתן כי הצבעים ליפופילית מגיעים בצבעים שונים, הטכניקה מספקת גם אמצעי לקבל הנוירונים סמוכים המסומנים בצבע רב. טכניקת העקיבה הזאת שימושית לצורך לימוד מורפולגנזה וקישוריות סינפטית במערכת העצב המוטורית של דרוזוהילה.

דמות מייצגת של הנוירונים aCC ו RP3 מוטוריים מוצג באיור 3C כדי להדגים את התיוג ריבוי צבעים של נוירונים מוטוריים ב 15 h. מורפולוגיות דנדריטים שלהם הם קבוע במידה רבה בין העוברים. דפוס הצביעת המתקבל עם נוגדן anti-HRP מוצג באפור. Droplet קטן של DiO או עשה הופקד על NMJ של שריר 1 או 6/7, בהתא?...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

אנו מתארים שיטה עבור מעקב נסיגה של הנוירונים המנוע העובריים מוטוריים באמצעות צבעי פלורסנט ליפופילית.

מעקב רטרוגרדי של דרוזופילה ממונע נוירונים מוטוריים שימוש בצבעי פלורסנט

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

טכניקת המעקב המתוארת בפרוטוקול זה מסייעת לנו לחקור מורפוגנזה עצבית ולצלם את הקישוריות במערכת הנוירונים המוטוריים של דרוסופילה. הצבע ליפופילי יכול להתפזר במהירות לכל חלק של קרום התא עם צפיפות גבוהה מאוד. זו הסיבה שהפרוטוקול שלנו פותר ביעילות למצוא מבנים של נוירון שכותרתו.אם מסוף אקסון נגיש עם micropipette הזרקה, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על כל נוירון בשלבים הזחל ומבוגרים של זבובים או באורגניזמים אחרים. אם אין לך ניסיון לנתח או להשתמש microinjector מדויק הפעולה על הדגימה, יכול להיות מאתגר. הבנת האנטומיה של העובר, תסייע בהנחיית החלקה נכונה של כלים לביצוע ניתוח או דינג'ק.כדי להתחיל, להכין ולתווה את כל חומרי איסוף העוברים. הכן את מנגנון הסינון על ידי ניתוק צינור 50 מיליליטר, וחיתוך לפתוח חור בכובע. לאחר מכן להגדיר מסנן רשת עם 100 נקבוביות מיקרומטר בין הצינור ואת הכובע.הכינו את מיקרופיגט הזרקת הצבע ומחט הניתוח מאותו צינור נימי בקוטר פנימי של 1.2 מילימטרים. משוך את הצינור עם micropipette, מושך ב 7% מ 170 וולט התפוקה המרבית כדי ליצור מחט חדה עם תחדד של כ 0.4 ס"מ אורך. כדי להכין את micropipette הזרקת צבע, להשרות את המטחנה עם סוכן הרטבה מניחים את המחט על מהדק micropipette ב 25 עד 30 מעלות.לאחר מכן הורידו את הקצה לשני שליש מהרדיוס ממרכז משטח המשפער. לטחון את המחט בעוד מזרק עם צינורות דוחף אוויר לתוכו. סמן את micropipette עם סמן קבוע קצה עדין כדי לציין את המיקום של הפתח בקצה לאחר משופע כי זה יכול להיות מאתגר לאתר את הפתח הצר שנוצר בזווית.אפשר לזבובים להטיל ביצים לילה בטמפרטורת החדר ולאסוף את הצינור עם הביצים בבוקר. כדי לאסוף את העוברים, dechlorinate את הביצים על הצלחת עם 50% אקונומיקה במשך חמש דקות. לאחר הכלורות התבהרו, יוצקים את תכולת הצלחת דרך מנגנון הסינון או מסננת התא כדי לבודד את העוברים.השתמש בקבוק לסחוט מים כדי לדלל את האקונומיקה שנותרה על הצלחת ולאסוף עוברים רבים ככל האפשר על ידי decanting את התערובת לתוך המסנן. לשטוף את העוברים שלוש עד ארבע פעמים עם מים עד ריח אקונומיקה מתפוגג. מוציאים את המסנן מהמוסד ושוטפים אותם לצלחת נקייה אחרת עם מים.ואז לדק את המים מהצלחת החדשה כי העוברים הם על. השתמש מטלפים עדין כדי לבחור חמישה עד 10 עוברים ב 15 שעות לאחר הטלת ביצה ולהניח אותם על קלטת דו צדדית עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה. הוסף צלצול חרקים מלוחים לבריכת הניתוח כדי להגן על העוברים מפני ייעוד.השתמש מחט זכוכית תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי לגרור את העובר מתוך קרום בינוני מן הסרט אל הזכוכית, דואג לא לפגוע ברקמות הפנימיות של העובר. ואז לחתוך דרך קו האמצע של עובר יחיד על פני השטח שלו מה האחורי שלה לקצה הקדמי. הופכים את רקמות האפיתל מהמרכז ומחברים את קצה האפידרמיס לפני השטח של מגלשת הזכוכית.השתמש מחט מחובר צינור עם פתח קצה של כ 300 מיקרומטרים כדי לשאף או לפוצץ אוויר כדי להסיר את גזעי קנה הנשימה האורך הגבי, כמו גם את כל המעיים הנותרים. השתמשו ב-4%PFA וב-PBS כדי לתקן את העוברים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. ואז לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.הכתם את העוברים עם מיקרוליטר אחד של נוגדן פרוקסידאז נגד חזרת גדום צבע Cyanine3 ו 200 microliters של PBS במשך שעה אחת על שייקר מסלולית. ולחזור על הכביסה ב-PBS. כדי למלא את מיקרופיגט ההזרקה, מניחים אותו לתוך מחזיק נימי.לאחר מכן מקם את החלקת הצבע על הבמה ולהשתמש micromanipulator למקם אותו מעל השקופית. לאחר מכן להתאים את הבמה כדי למקם את micropipette על הצבע. לאסוף את הצבע micropipette על ידי הגדרת לחץ ההזרקה בין 200 ל 500 hectopascal, זמן ההזרקה בין 0.1 ו 0.5 שניות ואת לחץ הפיצוי לאפס במשך חמש דקות.לאחר איסוף הצבע, הסר את מגלשת הצבע והצב את הדגימה על שלב המיקרוסקופ. לאחר מכן להגדיל את לחץ הפיצוי לטווח של 30 עד 60 hectopascal ולהוריד את micropipette לתוך המדגם. השתמש בעדשה אובייקטיבית 10 פעמים כדי לאתר את העובר וליישר את micropipette עם העובר.שנה את העדשה האובייקטיבית לעדשה טבילת מים 40 פעמים. ולהטביע את העדשה לתוך PBS. השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לבדוק את המורפולוגיה העצבית המסומנת על ידי אנטי HRP Cy3 ולקבוע את אתר ההזרקה.כאשר העובר נמצא בפוקוס לשנות את המיקום של micropipette כדי ליצור קשר עדין עם קצה האקסון של עניין. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר במהלך ההזרקה כדי לראות את טיפת הצבע. זרוק את הצבע בהמיסגמנט הבטן הימנית בצומת neuromuscular של ACC או RP3 עם DID או DiO.השתמש בבקרת היד כדי לשחרר את הצבע ולהסיר את micropipette. לאחר מכן עבור לאתר ההזרקה הבא. הדגירה את המדגם במשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית לפני הדמיה.באמצעות מדפים עדין, להסיר את הקלטות ממגלשת הזכוכית. כדי לטעון את המדגם, להכין להחליק כיסוי עם כמות קטנה של שומן ואקום בארבע הפינות. הניח אותו בזהירות על המדגם, הקפדה להימנע בועות אוויר.דחוף כלפי מטה את החלקת המכסה כדי להתאים את השטח מהדגימה כדי לאפשר מרחק עבודה בין העדשה האובייקטיבית לשקופית. הסר את כל PBS עודף עם מחיקת משימות. לאטום לחלוטין את הקצוות של החלקת המכסה עם לק.תמונה ב 10 פעמים ו 100 פעמים הגדלה עם מיקרוסקופ confocal ולעבד את התמונות, עם תוכנת imageJ. פרוטוקול זה שימש כדי לדרדר את התווית הנוירון המוטורי ACC innervating שריר אחד ואת נוירון מוטורי RP3 innervating השרירים שש ושבע. ענפים דנדריטיים מהנוירונים המוטוריים ACC ו- RP3 מראים חפיפה נרחבת.שני הנוירונים הם דו קוטביים, הקמת שתי אוכלוסיות שונות של דנדריטים. כדי להדגים את היכולות הכמותיות של שיטה זו, המספר הכולל של טיפים דנדריט נספר סוג פראי מוטציות Dscam1. דנדריטים ipsilateral של ACC מוצגים עבור סוג הבר, אבל כמה דנדריטים ipsilateral נצפו עבור מוטציה Dscam1.כאשר מנסים הליך זה, חשוב לזכור כי גודל טיפת הצבע הוא חיוני, שהוא כ 10 עד 20 מיקרומטר. בדוק את הגודל על קלטת דו צדדית ולאחר מכן להחיל אותו על אתר ההזרקה. באמצעות הליך זה, אנחנו יכולים לנצל את המאפיין הניתן להחלפה תמונה של בדיקה DiD כדי להשיג תמונות ברזולוציה סופר של קרום הפלזמה.בדרך זו אנו יכולים ללמוד את האפיון המבני אולטרה של הממברנות הסינפטיות בצומת neuromuscular. עשינו את הקליק. ביצענו ניתוח פנוטיפי של ה-aCC dendrites בזן מוטנטים, ולגלות כי הזרקת Dscam1-Dock-Pak מגדיר את האתר של דנדריט גדילה ב ACC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

ניתוח של Cardiomyocyte פיתוח באמצעות Immunofluorescence בלב העכבר עוברי

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

דמיינו דרוזופילה הרגל מוטור נוירון אקסונים דרך הקוטיקולה למבוגרים

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

מעקב גנטי שבטים באמצעות עכבר קונפטי למחקר רקמות מינרליזציה

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

בידול עצבי יעיל באמצעות התרבות תא יחיד של תאי גזע האדם העובריים

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...