Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Ringraziamo i membri del Kamiyama Lab per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. e D.K.).

1. Attrezzature e forniture
<ol><li>Materiali per la raccolta di embrioni e formazione degli adulti a deporre le uova<ol>
<li>Preparare l'apparato di filtrazione tagliando un tubo da 50 mL e tagliando un foro nel tappo per impostare un filtro a rete con pori di 100 m (Tabella dei Materiali) tra il tubo e il tappo. NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare i colini cellulari con pori di 100 m (Tabella dei materiali) per la fase di filtrazione della raccolta degli embrioni.</li>
	...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

L'uso dell'etichettatura dei coloranti per studiare la morfologia neuronale ha diversi vantaggi rispetto alle tecniche di etichettatura delle cellule genetiche. La tecnica di etichettatura dei colori può ridurre al minimo il tempo necessario per etichettare e immaginare le morfologie dei motoneuroni. Il processo di etichettatura del colore è abbastanza veloce in quanto ci vuole meno di 2 h e ci permette di definire il contorno delle proiezioni neuronali. In alternativa, si può visualizzare il neurone motore aCC scegli...

Il sistema di motoneuroni embrionali della Drosophila offre un potente modello sperimentale per analizzare i meccanismi alla base dello sviluppo del sistema nervoso centrale (CNS)1,2,3. Il sistema dei motoneuroni è suscettibile alle tecniche biochimiche, genetiche, di imaging ed elettrofisiologiche. Utilizzando le tecniche, le manipolazioni genetiche e le analisi funzionali possono essere effettuate a livello di singoli motoneuroni2,4,5,6.
Durante lo sviluppo precoce del sistema nervoso, i neuroblasti si dividono e generano un gran numero di glia e neuroni. La relazione spatiotemporale tra la delaminazione e il profilo di espressione genica dei neuroblasti è stata precedentemente studiata nel dettaglio7,8,9. Nel caso del sistema dei motoneuroni, la formazione di giunzione neuromuscolare embrionale (NMJ) è stata ampiamente studiata utilizzando l'aCC (cellula d'angolo anteriore), RP2 (gambero grezzo 2) e i motoneuroni RP52,10. Ad esempio, quando il motoneurone RP5 forma una giunzione sinaptica nascente, la filopodia pre-sinaptica e post-sinaptica viene mescolata11,12,13. Tale comunicazione cellulare diretta è vitale per avviare la formazione di NMJ. Contrariamente a quanto sappiamo sui rami nervosi periferici, la nostra conoscenza di come i dendriti motori avviano la connettività sinaptica all'interno del SNC è ancora primitiva.
In questa relazione, presentiamo una tecnica che permette l'etichettatura retrograda dei motoneuroni negli embrioni attraverso la somministrazione mediata da micropipette di coloranti lipofili. Questa tecnica ci permette di tracciare i 38 motoneuroni innervando ciascuno dei 30 muscoli della parete del corpo in un emi-segmento a 15 h dopo la deposizione delle uova (AEL)14. Utilizzando questa tecnica, il nostro gruppo ha studiato a fondo numerosi atleti di funzione/perdita di funzionealleli 15,16,17. Recentemente abbiamo svelato i meccanismi molecolari che guidano l'avvio della connettività dendrite motoria e dimostrato che un'interazione Dscam1-Dock-Pak definisce il sito di crescita dendrite nel motoneurone aCC17. In generale, questa tecnica è adattabile per l'analisi fenotipica di eventuali motoneuroni embrionali in ceppi di tipo selvatico o mutanti, migliorando la nostra capacità di fornire nuove intuizioni sulla progettazione funzionale del sistema nervoso della Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Descriviamo una tecnica per l'etichettatura retrograda dei motoneuroni in Drosophila. Usiamo un coloranti lipofilo disciolto di olio e forniamo una piccola gocciolina a una preparazione di filetto embrionale da un microiniettore. Ogni neurone motorio la cui membrana viene contattata dalla goccia può quindi essere rapidamente etichettato. I singoli motoneuroni sono continuamente etichettati, consentendo di visualizzare chiaramente i dettagli strutturali fini. Dato che i coloranti lipofili sono disponibili in vari colori, la tecnica fornisce anche un mezzo per ottenere neuroni adiacenti etichettati in multicolore. Questa tecnica di tracciamento è quindi utile per studiare la morfogenesi neuronale e la connettività sinaptica nel sistema dei neuroni motori della Drosophila.

Un'immagine rappresentativa dei motoneuroni aCC e RP3 è mostrata nella Figura 3C per dimostrare l'etichettatura multicolore dei motoneuroni a 15 h AEL. Le loro morfologie dendritiche sono in gran parte invariabili tra gli embrioni. Il modello di colorazione ottenuto con anticorpo anti-HRP è mostrato in grigio. Una piccola goccia di DiO o DiD è stata depositata sull'NMJ del muscolo 1 o 6/7, rispettivamente. La figura 4 dimostra la capacità di...

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Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Descriviamo un metodo per la tracciatura retrograda dei motoneuroni embrionali della Drosophila usando coloranti fluorescenti lipofilici.

Tracciamento retrogrado dei neuroni motori embrionali della Drosophila utilizzando coloranti fluorescenti lipofilici

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

La tecnica di tracciamento descritta in questo protocollo ci aiuta a studiare la morfogenesi neuronale e a spezzare la connettività nel sistema dei motoneuroni della Drosophila. Il colorante lipofilo può diffondersi rapidamente in ogni parte della membrana cellulare ad altissima densità. Questo è il motivo per cui il nostro protocollo si risolve in modo efficiente per trovare strutture di un neurone etichettato.Se un terminale di assone è accessibile con una micropipetta di iniezione, questa tecnica potrebbe essere applicata a qualsiasi neurone negli stadi larvale e adulto delle mosche o in altri organismi. Se non si ha esperienza di sezionare o utilizzare un microiniettore preciso l'operazione sul campione, può essere impegnativo. Comprendere l'anatomia dell'embrione, aiuterà con la guida a una corretta porzione di strumenti per eseguire la dissezione o una dinjection.Per iniziare, preparare e impaginazione di tutti i materiali di raccolta degli embrioni. Preparare l'apparato di filtrazione tagliando un tubo da 50 millilitri e tagliando aprire un foro nel cappuccio. Quindi impostare un filtro a rete con pori da 100 micrometri tra il tubo e il cappuccio.Preparare la micropipetta di iniezione di colorante e l'ago di dissezione dallo stesso tubo capillare con un diametro interno di 1,2 millimetri. Tirare il tubo con una micropipetta, tirare al 7% da 170 volt di uscita massima per creare un ago affilato con un cono di circa 0,4 centimetri di lunghezza. Per preparare la micropipetta di iniezione di colorante, immergere la smerigliatrice con un agente bagnante e posizionare l'ago sul morsetto della micropipetta a 25-30 gradi.Quindi abbassare la punta su due terzi del raggio dal centro della superficie smussata. Macinare l'ago mentre una siringa con tubi spinge l'aria in esso. Contrassegnare la micropipetta con un marcatore permanente a punta fine per indicare la posizione dell'apertura sulla punta dopo la smussatura perché può essere difficile individuare l'apertura stretta che si forma ad angolo.Consentire alle mosche di deporre le uova durante la notte a temperatura ambiente e raccogliere il tubo con le uova al mattino. Per raccogliere gli embrioni, declorinare le uova sul piatto con il 50% di candeggina per cinque minuti. Una volta che i cloruri sono stati cancellati, versare il contenuto della piastra attraverso l'apparato di filtrazione o il filtro cellulare per isolare gli embrioni.Utilizzare una bottiglia d'acqua spremuta per diluire la candeggina lasciata sul piatto e raccogliere il maggior numero possibile di embrioni decantando la miscela nel filtro. Lavare gli embrioni da tre a quattro volte con acqua fino a quando l'odore di candeggina si dissipa. Rimuovere il filtro dall'apparecchio e lavarlo su un'altra piastra pulita con acqua.Quindi decantare l'acqua dal nuovo piatto su cui si trovano gli embrioni. Utilizzare forcep fini per selezionare da cinque a 10 embrioni a 15 ore dalla deposizione delle uova e posizionarli su nastro a doppia mano con il lato dorsale rivolto verso l'alto. Aggiungere la suoneria degli insetti al pool di dissezione per proteggere gli embrioni dall'essiccazione.Utilizzare un ago di vetro al microscopio a dissezione per trascinare l'embrione dalla membrana di metà del nastro sul vetro, facendo attenzione a non danneggiare i tessuti interni dell'embrione. Quindi tagliare attraverso la linea media di un singolo embrione sulla sua superficie dalla sua estremità posteriore a anteriore. Capovolgere i tessuti epiteliali dal centro e attaccare il bordo epidermico sulla superficie dello scivolo di vetro.Utilizzare un ago collegato a tubo con un'apertura della punta di circa 300 micrometri per aspirare o soffiare aria per rimuovere i tronchi tracheali longitudinali dorsali e le eventuali viscere rimanenti. Utilizzare 4%PFA e PBS per fissare gli embrioni per cinque minuti a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Quindi lavarli tre volte con PBS.Macchiare gli embrioni con un microlitro di anticorpo anti rafano perossidasi coniugato con colorante cianina3 e 200 microlitri di PBS per un'ora sullo shaker orbitale. E ripetere i lavaggi in PBS. Per riempire la micropipetta di iniezione, posizionarla nel supporto capillare.Posizionare quindi lo scivolo di tintura sul palco e utilizzare il micromanipolatore per posizionarlo sullo scivolo. Quindi regolare il palco per posizionare la micropipetta sul colorante. Raccogliere il colorante nella micropipetta impostando la pressione di iniezione tra 200 e 500 ettopascal, il tempo di iniezione tra 0,1 e 0,5 secondi e la pressione di compensazione a zero per cinque minuti.Una volta raccolto il colorante, rimuovere lo scivolo di tintura e posizionare il campione sullo stadio del microscopio. Quindi aumentare la pressione di compensazione a un intervallo da 30 a 60 ettopascal e abbassare la micropipetta nel campione. Utilizzare la lente 10 volte obiettiva per localizzare l'embrione e allineare la micropipetta con l'embrione.Cambia l'obiettivo in un'immersione in acqua 40 volte l'obiettivo. E immergere l'obiettivo nel PBS. Utilizzare la microscopia a fluorescenza per controllare la morfologia neuronale contrassegnata dall'anti-HRP Cy3 e determinare il sito di iniezione.Quando l'embrione è a fuoco cambiare la posizione della micropipetta per fare un contatto delicato con la punta dell'assone di interesse. Quindi utilizzare la microscopia a campo luminoso durante l'iniezione per vedere la goccia di colorante. Far cadere il colorante nell'emisegmento addominale destro alla giunzione neuromuscolare di aCC o RP3 con DiD o DiO.Utilizzare il controllo della mano per rilasciare il colorante e rimuovere la micropipetta. Quindi passare al sito di iniezione successivo. Incubare il campione per un'ora a temperatura ambiente su uno shaker orbitale prima dell'imaging.Utilizzando forcep fini, rimuovere i nastri dal vetrino. Per montare il campione, preparare un coperchio scivolare con una piccola quantità di grasso sottovuoto ai quattro angoli. Posizionato con cura sul campione, assicurandosi di evitare bolle d'aria.Spingere verso il basso lo slittamento del coperchio per regolare lo spazio dal campione per consentire la distanza di lavoro tra l'obiettivo e lo scivolo. Rimuovere il PBS in eccesso con le salviette delle attività. Sigillare completamente i bordi del coperchio scivolare con smalto per unghie.Immagine a 10 volte e 100 volte l'ingrandimento con un microscopio confocale ed elaborare le immagini, con il software imageJ. Questo protocollo è stato utilizzato per retrogradare etichettare il motoneurone aCC innervating muscle one e il motoneurone RP3 innervating muscles six and seven. I rami dendritici dei motoneuroni ACC e RP3 mostrano una sovrapposizione estesa.Entrambi i neuroni sono bipolari, stabilendo due diverse popolazioni di dendriti. Per dimostrare le capacità quantitative di questo metodo, il numero totale di punte di dendrite è stato conteggiato in caratteri selvatici e mutanti Dscam1. I dendriti ipsilaterali dell'aCC sono mostrati per il tipo selvaggio, ma sono stati osservati pochi dendriti ipsilaterali per il mutante Dscam1.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare che la dimensione della goccia di colorante è cruciale, che è di circa 10-20 micrometri. Testare le dimensioni sul nastro a doppia parte e quindi applicarlo al sito di iniezione. Utilizzando questa procedura, possiamo sfruttare la proprietà foto commutabile della sonda DiD per ottenere immagini a super risoluzione della membrana plasmatica.In questo modo possiamo studiare la caratterizzazione ultra strutturale delle membrane sinaptiche alla giunzione neuromuscolare. Abbiamo fatto il clic. Abbiamo eseguito un'analisi fenotipico dei dendriti aCC nel ceppo mutante e scopriamo che un'iniezione Dscam1-Dock-Pak definisce il sito della crescita della dendrite in aCC.

Research

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Trascrittoma Profiling di<em&gt; In-Vivo</em&gt; Embrioni bovini pre-impianto prodotto con piattaforma microarray a due colori

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissezione e macchiatura immunofluorescente del corpo di fungo e del fotoricettore neuroni nel cervello adulto Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Rilevamento di umani cellule staminali mesenchimali adiposo-derivate in un modello di osteoartrite del ginocchio di ratto con colorante fluorescente lipofilico membrana

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

L'analisi di espressione genica tramite rilevazione di attività di β-galattosidasi in embrioni di topo intero

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualizzare Drosophila gamba del neurone di motore assoni attraverso la cuticola adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Scongelamento, coltura e Cryopreserving linee di cellule di Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Clonal Genetic Tracing utilizzando il mouse Corfetti per studiare i tessuti mineralizzati

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...