Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

원고에 대한 의견에 대해 가미야마 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH R01 NS107558(M.I., K.B., D.K.)에 의해 지원되었습니다.

1. 장비 및 소모품
<ol><li>배아 를 수집하고 알을 낳기 위해 성인을 훈련하기위한 자료<ol>
<li>튜브와 캡 사이에 100μm(재료표)의기공이 있는 메쉬 필터를 설정하도록 캡에 구멍을 열어 50 mL 튜브를 절단하여 여과 장치를 준비한다. 참고: 또는, 100 μm(재료표)의기공을 가진 세포 스트레이너는 배아 수집의 여과 단계에 사용될 수 있다.</li>
		<li>나열된 지침에 따라 포도 한천 ...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

신경 형태학을 공부하기위한 염료 라벨링의 사용은 유전 세포 라벨링 기술에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 라벨링 기술은 운동 뉴런의 형태에 라벨링 및 이미징에 필요한 시간을 최소화할 수 있습니다. 염료 라벨링 과정은 2 시간 미만이 걸리고 뉴런 돌기의 윤곽을 정의 할 수 있기 때문에 매우 빠릅니다. 대안으로, aCC에서 효모 GAL4 전사 인자를 발현하는 GAL4 라인을 선택하고, 상류 활성화 ?...

Drosophila의 배아 운동 뉴런 시스템은 중추 신경계 (CNS)1,2,3의발달의 기초가되는 메커니즘을 분석하는 강력한 실험 모델을 제공합니다. 모터 뉴런 시스템은 생화학적, 유전적, 이미징 및 전기 생리학적 기술을 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 유전 적 조작 및 기능 분석은 단일 운동 뉴런2,4,5,6의수준에서 수행 될 수있다.
신경계의 초기 발달 도중, neuroblasts는 분할하고 glia와 신경의 다수를 생성합니다. 신경아세포의 배분과 유전자 발현 프로필 사이의 시공간적 관계는 이전에 상세히 조사되어왔다 7,8,9. 운동 뉴런 시스템의 경우, 배아 신경근육 접합부(NMJ)의 형성은 aCC(전방 코너 셀), RP2(원시 새우 2), 및 RP5 운동 뉴런2,10을사용하여 광범위하게 연구되었다. 예를 들어, RP5 운동 뉴런이 초기 시냅스 접합을 형성할 때, 시냅스 전 및 시냅스 후 필로포디아는11,12,13을혼합한다. 이러한 직접적인 세포 통신은 NMJ 형성을 시작하는 데 필수적이다. 우리가 말초 신경 지점에 관하여 알고 있는 것과는 반대로, 어떻게 모터 수상돌이 CNS 내의 시냅스 연결을 개시하는지의 우리의 지식은 아직도 원시적입니다.
이 보고에서는, 우리는 친유성 염료의 micropipette 중재한 납품을 통해 태아에 있는 모터 신경의 역행 표지를 허용하는 기술을 제시합니다. 이 기술은 우리가 계란 누워 후 15 시간 (AEL)14에서헤미 세그먼트에 30 신체 벽 근육의 각각을 내음 38 모터 뉴런을 추적 할 수 있습니다. 이 기술을 사용하여, 우리 그룹은 철저하게 수많은 기능 의 이득 / 기능 상실 - 기능 의 상실 을 조사했다15,16,17. 우리는 최근에 모터 모수석 연결의 개시를 구동하는 분자 메커니즘을 해명하고 Dscam1-Dock-Pak 상호 작용이 aCC 모터뉴런(17)에서모수석 의 자성장 부위를 정의한다는 것을 입증했다. 일반적으로, 이 기술은 야생 형 또는 돌연변이 균주에 있는 어떤 배아 운동 뉴런든지의 표현형 분석에 적응할 수 있습니다, Drosophila 신경계의 기능적인 디자인에 새로운 통찰력을 제공하는 우리의 기능을 강화하.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

우리는 Drosophila에있는 모터 신경의 역행 표지를 위한 기술을 기술합니다. 우리는 오일 용해 된 친유성 염료를 사용하고 마이크로 인젝터에 의해 배아 필렛 제제에 작은 물방울을 전달합니다. 그 막이 물방울에 의해 접촉되는 각 모터 신경은 그 때 급속하게 표지될 수 있습니다. 개별 운동 뉴런은 지속적으로 라벨을 부착하여 미세한 구조적 세부 사항을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 친유성 염료가 다양한 색상으로 제공된다는 점을 감안할 때, 이 기술은 또한 인접한 뉴런을 여러 가지 색으로 표시할 수 있는 수단을 제공한다. 이 추적 기술은 따라서 Drosophila의모터 뉴런 시스템에서 신경 형태 형성 및 시냅스 연결을 연구하는 데 유용합니다.

aCC 및 RP3 운동 뉴런의 대표적인 이미지는 15시간 AEL에서 운동 뉴런의 다색 라벨링을 입증하기 위해 도 3C에 도시되어 있다. 그들의 수지상 형태는 배아 사이에 크게 불변성입니다. 항-HRP 항체로 수득된 염색 패턴은 회색으로 나타내었다. DiO 또는 DiD의 작은 물방울은 각각 근육 1 또는 6/7의 NMJ에 증착되었다. 도 4는 관심 표현형을 정량적으로 ?...

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Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

우리는 친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 운동 뉴런의 역행 추적방법을 기술한다.

친유성 형광 염료를 사용하여 Drosophila 배아 모터 뉴런의 역행 추적

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

이 프로토콜에 설명 된 추적 기술은 우리가 신경 형태 발생을 연구하고 Drosophila의 운동 신경 시스템에서 연결을 스냅하는 데 도움이됩니다. 지포성 염료는 매우 높은 밀도로 세포막의 모든 부분에 빠르게 확산 될 수 있습니다. 이것이 우리의 프로토콜이 라벨이 붙은 뉴런의 구조를 찾기 위해 효율적으로 해결하는 이유입니다.축 사 단자가 주입 마이크로 파이프로 접근 할 수있는 경우,이 기술은 파리의 애벌레와 성인 단계 또는 다른 유기체에 어떤 뉴런에 적용 될 수있다. 시편의 정밀한 조작을 해부하거나 사용하는 경험이 없다면 어려울 수 있습니다. 태아의 해부학을 이해, 해부 또는 주사를 수행하는 도구의 적절한 분배에 대한 지침에 도움이 될 것입니다.시작하려면 모든 배아 수집 재료를 준비하고 배치하십시오. 50 밀리리터 튜브를 절단하고 캡에 구멍을 열어 절단하여 여과 장치를 준비합니다. 그런 다음 튜브와 캡 사이에 100 마이크로미터 모공을 가진 메쉬 필터를 설정합니다.1.2 밀리미터의 내지름으로 동일한 모세관 튜브에서 염료 주입 마이크로 피펫 및 해부 바늘을 준비합니다. 마이크로피펫으로 튜빙을 당기고, 풀러는 170볼트 최대 출력에서 7%로 당겨 길이가 약 0.4cm의 테이퍼로 날카로운 바늘을 만듭니다. 염료 주입 마이크로피펫을 준비하려면, 습윤제로 분쇄기를 담그고 25~30도의 마이크로피펫 클램프에 바늘을 놓습니다.그런 다음 반경의 3분의 2에 팁을 베벨링 표면의 중심에서 내립니다. 튜브가 있는 주사기가 공기를 밀어 넣는 동안 바늘을 갈아 넣습니다. 마이크로피펫을 미세 팁 영구 마커로 표시하여 각도로 형성되는 좁은 개구부를 찾는 것이 어려울 수 있기 때문에 베벨링 후 팁에서 개구부 위치를 나타내도록 한다.파리가 실온에서 하룻밤 사이에 알을 낳고 아침에 계란으로 파이프를 수집할 수 있도록 하십시오. 배아를 수집하려면 접시에 있는 계란을 50%의 표백제로 5분간 탈염시합니다. 염화물이 지워지면 여과 장치 또는 세포 여과기를 통해 플레이트의 내용을 부어 배아를 분리합니다.접시에 남아있는 표백제를 희석하고 필터에 혼합물을 해독하여 가능한 한 많은 배아를 수집하기 위해 물 짜기 병을 사용합니다. 표백제 냄새가 사라질 때까지 배아를 물로 3~4회 씻으시다. 장치에서 필터를 제거하고 물로 다른 깨끗한 접시에 씻어.그런 다음 배아가 있는 새로운 판에서 물을 데수수유한다. 미세 한 집게를 사용 하 여 5 ~ 10 알 누워 후 15 시간에 배아를 선택 하 고 등쪽 측면을 향하고 있는 양면 테이프에 배치. 해부 풀에 곤충 링거 식염수식을 추가하여 배아를 탈수로부터 보호합니다.해부 현미경의 밑에 유리 바늘을 사용하여 테이프에서 유리로 중간 막에서 배아를 끌어내어 배아의 내부 조직을 손상시키지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 뒤쪽에서 전방 끝까지 표면의 단일 배아의 중간 선을 잘라냅니다. 중앙에서 상피 조직을 뒤집고 표피 가장자리를 유리 슬라이드 표면에 부착합니다.튜브 연결 바늘에 약 300 마이크로미터의 팁 개구부를 사용하여 공기를 흡인하거나 날려 도르경계 기관 트렁크와 남은 내장을 제거하십시오. 4%의 PFA와 PBS를 사용하여 궤도 셰이커의 실온에서 5분 동안 배아를 수정합니다. 그런 다음 PBS로 세 번 씻으시기 만합니다.항 고추냉이 과산화제 항체의 마이크로리터 1개와 함께 배아를 염색하고 Cyanine3 염료와 200 마이크로리터의 PBS를 궤도 셰이커에서 1시간 동안 접촉시. 그리고 PBS에서 세동을 반복합니다. 사출 마이크로 피펫을 채우기 위해 모세관 홀더에 넣습니다.그런 다음 염료 슬라이드를 스테이지에 배치하고 미세 조작기를 사용하여 슬라이드 위에 배치합니다. 그런 다음 스테이지를 조정하여 마이크로 피펫을 염료에 놓습니다. 주입 압력을 200~500헤코칼로 설정하여 마이크로피펫에서 염료를 수집하고, 주입 시간은 0.1초에서 0.5초 사이이며 보상 압력을 5분 동안 0으로 설정한다.염료를 채취하면 염료 슬라이드를 제거하고 샘플을 현미경 단계에 배치하십시오. 그런 다음 보상 압력을 30~ 60개의 혈소판 범위로 증가시키고 마이크로피펫을 시료로 낮춥춥시다. 10배의 객관적인 렌즈를 사용하여 배아를 찾고 마이크로 파이프를 배아와 정렬합니다.목표 렌즈를 물에 침지 40회 렌즈로 변경합니다. 그리고 렌즈를 PBS에 담급합니다. 형광 현미경 검사를 사용하여 항 HRP Cy3로 표시된 신경 형태여부를 확인하고 주사 부위를 결정합니다.배아가 초점을 맞출 때 마이크로피펫의 위치를 변경하여 축축의 끝과 부드럽게 접촉합니다. 그런 다음 주사 중에 밝은 필드 현미경 검사를 사용하여 염료 액적을 확인하십시오. DiD 또는 DiO와 함께 aCC 또는 RP3의 신경 근육 접합부에서 오른쪽 복부 중간 세그먼트에 염료를 떨어 뜨립니다.손 컨트롤을 사용하여 염료를 방출하고 마이크로 피펫을 제거합니다. 그런 다음 다음 주입 사이트로 이동합니다. 이미징 전에 궤도 셰이커의 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.미세 한 집게를 사용 하 여 유리 슬라이드에서 테이프를 제거 합니다. 시료를 장착하려면 4개의 모서리에 소량의 진공 그리스로 커버 슬립을 준비합니다. 조심스럽게 시료에 배치하여 기포를 피하십시오.커버 슬립을 아래로 밀어 샘플에서 공간을 조정하여 객관적인 렌즈와 슬라이드 사이의 작업 거리를 허용합니다. 작업 와이프로 초과 PBS를 제거합니다. 매니큐어로 커버 슬립의 가장자리를 완전히 밀봉합니다.이미지J 소프트웨어로 공초점 현미경으로 10 배율 및 100 배율로 이미지를 처리합니다. 이 프로토콜은 ACC 모터 뉴런 내분 근육 1과 RP3 운동 뉴런 내분 근육 6 및 7 라벨을 역그레이드하는 데 사용되었다. ACC 및 RP3 모터 뉴런의 수지상 분기는 광범위한 중복을 보여줍니다.두 뉴런은 양극성이며, 수선제의 두 가지 다른 인구를 확립합니다. 이 방법의 정량적 기능을 보여주기 위해 총 원더라이트 팁 수는 야생 유형 및 Dscam1 돌연변이체로 계산되었습니다. aCC의 입체 말단은 야생 타입에 대해 나타내지만 Dscam1 돌연변이에 대해 몇 개의 입각 형원가 관찰되었습니다.이 절차를 시도할 때, 염료 물방울의 크기가 약 10 내지 20 마이크로미터인 중요하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 양면 테이프의 크기를 테스트한 다음 사출 부위에 적용합니다. 이 절차를 사용하여, 우리는 플라즈마 멤브레인의 슈퍼 해상도 이미지를 얻기 위해 DiD 프로브의 사진 전환 가능한 특성을 활용할 수 있습니다.이렇게 하면 신경 근육 접합부에서 시냅스 멤브레인의 매우 구조적 특성을 연구할 수 있습니다. 우리는 클릭을했다. 돌연변이 균주에서 aCC 원점의 표면 분석을 수행하고, Dscam1-Dock-Pak 주사가 aCC에서 원원지 아웃스승 부위를 정의한다는 것을 발견했습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

배아 마우스 마음에 면역 형광을 이용하여 심근 개발 분석

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

연구

발생학

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

멀티 컬러 형광 기자 마우스를 사용하여 각막 세포의 리니지 추적하는 방법

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

의 사체 프로파일 링<em&gt; 생체</em2 색의 마이크로 어레이 플랫폼을 사용하여&gt; 제작 소 착상 전 배아

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

전체 마우스 배아에서 β-galactosidase 활동의 감지를 통해 유전자 발현 추적

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

성인 표 피를 통해 초파리 다리 모터 신경 축 삭을 시각화

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

녹고, 경작, 그리고 초파리 셀 라인 Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...