Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Kamiyama Lab for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B., og dk).

1. utstyr og forsyninger
<ol><li>Materialer for innsamling av embryo og trening voksne å legge egg<ol>
<li>Klargjør filtrerings apparatet ved å severing et 50 mL rør og skjære opp et hull i hetten for å sette et maske filter med porene i 100 μm (tabell over materialer) mellom slangen og hetten. Merk: Alternativt kan celle siler med porer 100 μm (tabell med materialer) brukes til Filtreringstrinnet i embryo-kolleksjonen.</li>
		<li>Lag agar plater med drue agar Premix (<stron...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

Bruken av fargestoff merkingsteknikker for å studere neuronal morfologi har flere fordeler fremfor genetisk celle-merking teknikk. Fargestoffet merkingsteknikker kan minimere mengden tid som trengs for merking og Imaging morfologier av motor neurons. Fargestoffet merkingsprosessen er ganske rask som det tar mindre enn 2 h og gjør oss i å definere omrisset av neuronal anslag. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motoriske Nevron ved å velge en GAL4 linje som uttrykker gjær GAL4 transkripsjon faktor i aCC, og kr...

Den embryonale motor Nevron system av Drosophila tilbyr en kraftig eksperimentell modell for å analysere mekanismene underliggende utviklingen av sentralnervesystemet (CNS)1,2,3. Den motoriske Nevron systemet er mottagelig for biokjemiske, genetisk, Imaging, og elektrofysiologisk teknikker. Ved hjelp av teknikker, kan genetiske manipulasjoner og funksjonelle analyser utføres på nivå med én motor neurons2,4,5,6.
I løpet av tidlig utvikling av nervesystemet, neuroblasts dividere og generere et stort antall glia og neurons. Spatiotemporal forholdet mellom delaminering og gen uttrykks profilen til neuroblasts har tidligere blitt undersøkt i detalj7,8,9. I tilfelle av motor Nevron systemet, dannelsen av embryonale nevromuskulær Junction (nmj) har blitt grundig studert ved hjelp av aCC (fremre hjørne celle), RP2 (RAW reke 2), og RP5 motor neurons2,10. For eksempel, når RP5 motor Nevron danner en begynnende Synaptic Junction, pre-Synaptic og post-Synaptic filopodia er blandet11,12,13. Slik direkte cellulær kommunikasjon er avgjørende for å starte NMJ formasjon. I motsetning til hva vi vet om perifere nerve grener, vår kunnskap om hvordan motor dendrites initiere Synaptic tilkobling innenfor CNS er fortsatt primitive.
I denne rapporten presenterer vi en teknikk som gjør at retrograd merking av motor neurons i embryo ved hjelp av micropipette-mediert levering av lipofile fargestoffer. Denne teknikken gjør det mulig for oss å spore 38 motor neurons innervating hver av de 30 kroppen veggen musklene i en hemi-segmentet på 15 h etter egglegging (AEL)14. Ved å bruke denne teknikken, har vår gruppe grundig undersøkt mange gevinst-av-funksjon/tap-of-funksjon alleler15,16,17. Vi har nylig unraveled den molekylære mekanismer som driver initiering av motor dendrit tilkobling og viste at en Dscam1-Dock-Pak interaksjon definerer stedet for dendrit utvekst i aCC motor Nevron17. Generelt, denne teknikken er tilpasningsdyktig for fenotypiske analyse av eventuelle embryonale motoriske neurons i vill type eller mutant stammer, styrke vår evne til å gi ny innsikt i funksjonell design av Drosophila nervesystemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Vi beskriver en teknikk for retrograd merking av motor neurons i Drosophila. Vi bruker en olje-oppløst lipofile fargestoff og levere en liten dråpe til en embryonale filet forberedelse av en microinjector. Hver motor Nevron som membranen er kontaktet av dråpe kan da være raskt merket. Individuelle motor neurons er kontinuerlig merket, slik at fine strukturelle detaljer å være tydelig visualisere. Gitt at lipofile fargestoffer kommer i ulike farger, gir teknikken også et middel for å få tilstøtende neurons merket i flerfarget. Denne tracing teknikken er derfor nyttig for å studere neuronal morphogenesis og Synaptic tilkobling i motorisk Nevron system av Drosophila.

En representativ bilde av aCC og RP3 motor neurons er vist i Figur 3C for å demonstrere flerfarget merking av motor NEURONS ved 15 h AEL. Deres dendrittiske morfologier er i stor grad invariant mellom embryo. Fargemønsteret som oppnås med anti-HRP antistoff, vises i grått. En liten dråpe av DiO eller DiD ble avsatt på NMJ av muskel 1 eller 6/7, henholdsvis. Figur 4 demonstrerer evnen til å kvantitativt måle fenotype av interesse. Vi telt...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Vi beskriver en metode for retrograd sporing av Drosophila embryonale motor neurons bruker lipofile fluorescerende fargestoffer.

Retrograd tracing av Drosophila embryonale motor neurons bruke lipofile fluorescerende fargestoffer

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Sporingsteknikken som er beskrevet i denne protokollen hjelper oss med å studere nevronal morfogenese og snap tilkoblingen i motorneuronsystemet drosophila. Det lipofile fargestoffet kan raskt spre seg til alle deler av cellulær membran med ekstremt høy tetthet. Dette er grunnen til at vår protokoll effektivt løser å finne strukturer av en merket nevron.Hvis en axonterminal er tilgjengelig med en injeksjonmikropipette, kan denne teknikken påføres enhver nevron i larval- og voksenstadiene av fluer eller i andre organismer. Hvis du ikke har erfaring med å dissekere eller bruke en mikroinjektor nøyaktig, kan operasjonen på prøven være utfordrende. Forstå anatomien til embryoet, vil hjelpe med veiledning til riktig porsjonering av verktøy for å utføre disseksjon eller en dinjection.For å starte, forberede og layout alle embryo samle materialer. Forbered filtreringsapparatet ved å kutte et 50 milliliter rør, og kutte åpne et hull i hetten. Sett deretter inn et nettingfilter med 100 mikrometerporer mellom røret og hetten.Forbered fargestoffinjeksjonen mikropipette og disseksjonsnålen fra samme kapillære slange med en indre diameter på 1,2 millimeter. Trekk slangen med en mikropipette, avtrekker på 7% fra 170 volt maksimal effekt for å skape en skarp nål med en taper på ca 0,4 centimeter i lengde. For å forberede fargestoffinjeksjonen mikropipette, suge jeksel med et fuktmiddel og plassere nålen på mikropipette klemmen på 25 til 30 grader.Senk deretter spissen på to tredjedeler av radiusen ut fra midten av skråoverflaten. Grind nålen mens en sprøyte med rør skyver luft inn i den. Merk mikropipetten med en fin spiss permanent markør for å indikere plasseringen av åpningen på spissen etter skrånende fordi det kan være utfordrende å finne den smale åpningen som dannes i en vinkel.La fluene legge egg over natten ved romtemperatur og samle røret med eggene om morgenen. For å samle embryoene, deklorer eggene på platen med 50% blekemiddel i fem minutter. Når klorene er ryddet, hell innholdet på platen gjennom filtreringsapparatet eller cellesilen for å isolere embryoene.Bruk en klemflaske med vann til å fortynne blekemiddelet som er igjen på platen og samle så mange embryoer som mulig ved å dekantere blandingen inn i filteret. Vask embryoene tre til fire ganger med vann til blekemiddellukten forsvinner. Fjern filteret fra apparatet og vask dem på en annen ren plate med vann.Deretter dekanterer vannet fra den nye platen som embryoene er på. Bruk fine tang til å velge fem til 10 embryoer på 15 timer etter egglegging og plasser dem på dobbeltsidig tape med dorsalsiden vendt opp. Legg insekt ringer saltvann til disseksjon bassenget for å beskytte embryoene mot uticcation.Bruk en glassnål under et disseksjonsmikroskop for å dra embryoet ut fra middlingmembranen fra båndet på glasset, og vær forsiktig så du ikke skader embryoets indre vev. Skjær deretter gjennom midtlinjen av et enkelt embryo på overflaten fra sin bakre til fremre ende. Vend epitelvevet fra midten og fest epidermalkanten på overflaten av glasslysbildet.Bruk en rørtilkoblet nål med en tuppåpning på ca. 300 mikrometer for å aspirere eller blåse luft for å fjerne dorsal langsgående trakeale stammer samt eventuelle gjenværende guts. Bruk 4% PFA og PBS for å fikse embryoene i fem minutter ved romtemperatur på en orbital shaker. Vask dem deretter tre ganger med PBS.Flekk embryoene med en mikroliter anti pepperrot peroksidase antistoff konjugert med Cyanine3 fargestoff og 200 mikroliter PBS i en time på orbital shaker. Og gjenta vaskene i PBS. For å fylle injeksjonmikropipetten, plasser den i kapillærholderen.Deretter plasserer fargestoffet glidd på scenen og bruk mikromanipulatoren til å plassere den over lysbildet. Juster deretter scenen for å plassere mikropipetten på fargestoffet. Samle fargestoffet i mikropipetten ved å sette injeksjonstrykket til mellom 200 og 500 hektoscal, injeksjonstiden mellom 0,1 og 0,5 sekunder og kompensasjonstrykket til null i fem minutter.Når fargestoffet er samlet inn, fjern fargelysbildet og plasser prøven på mikroskopstadiet. Øk deretter kompensasjonstrykket til et område på 30 til 60 hektascal og senk mikropipetten i prøven. Bruk 10 ganger objektiv objektiv for å finne embryoet og justere mikropipetten med embryoet.Endre objektivet til en vannnedsenking 40 ganger linse. Og senk linsen ned i PBS. Bruk fluorescensmikroskopi for å kontrollere den nevronale morfologien merket av anti-HRP Cy3 og bestemme injeksjonsstedet.Når embryoet er i fokus endre plasseringen av mikropipetten for å gjøre mild kontakt med spissen av akson av interesse. Bruk deretter lys feltmikroskopi under injeksjonen for å se fargedråpen. Slipp fargestoffet i høyre abdominal hemisegment ved det nevromuskulære krysset mellom aCC eller RP3 med enten DiD eller DiO.Bruk håndkontrollen til å frigjøre fargestoffet og fjerne mikropipetten. Deretter går du videre til neste injeksjonssted. Inkuber prøven i en time ved romtemperatur på en orbital shaker før avbildning.Bruk fine tang, fjern båndene fra glasslysbildet. For å montere prøven, klargjør en dekselslipp med en liten mengde vakuumfett i de fire hjørnene. Plasser den forsiktig på prøven, og sørg for å unngå luftbobler.Skyv ned dekselseddelen for å justere plassen fra prøven for å tillate arbeidsavstand mellom objektivet og lysbildet. Fjern overflødig PBS med oppgaveservietter. Fullstendig forsegle kantene av dekselet slip med neglelakk.Bilde på 10 ganger og 100 ganger forstørrelse med et konfokal mikroskop og behandle bildene, med imageJ-programvaren. Denne protokollen ble brukt til å retrograd merke aCC motor neuron innervating muskel en og RP3 motor neuron innervating muskler seks og syv. Dendrittiske grener fra ACC og RP3 motornevroner viser omfattende overlapping.Begge nevronene er bipolare, og etablerer to forskjellige populasjoner av dendritter. For å demonstrere de kvantitative egenskapene til denne metoden, ble det totale antallet dendritttips talt i vill type og Dscam1 mutanter. Ipsilaterale dendritter av aCC er vist for vill type, men få ipsilaterale dendritt ble observert for Dscam1 mutant.Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske at størrelsen på fargedråpen er avgjørende, som er ca 10 til 20 mikrometer. Test størrelsen på dobbeltsidig tape og bruk den deretter på injeksjonsstedet. Ved hjelp av denne prosedyren kan vi dra nytte av bildet som kan byttes egenskapen til DiD-sonde for å oppnå superoppløsningsbilder av plasmamembranen.På denne måten kan vi studere den ultra strukturelle karakteriseringen av synaptiske membraner ved det nevromuskulære krysset. Vi klikket. Vi utførte fenotypisk analyse av aCC dendritt i mutant belastning, og oppdage at en Dscam1-Dock-Pak injeksjon definerer stedet for dendritt utvekst i aCC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En metode for Lineage Sporing av Korneale Cells Bruke Multi-farge Fluorescent Reporter Mus

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produserte Bovine Pre-implantasjon Embryoet ved hjelp av to-farge microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

I Vivo Sporing av menneskelig liggende under Adipose-avledet Mesenchymal stamceller i en rotte kneet slitasjegikt modell med fluorescerende lipofile membran fargestoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Sporing genuttrykk gjennom påvisning av β-galactosidase aktivitet i hele Mouse embryoer

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualisere Drosophila etappe Motor Neuron Axons gjennom voksen Cuticle

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk tracing bruke konfetti musen til å studere Mineralisert vev

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...