Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Agradecemos aos membros do Laboratório Kamiyama por comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 NS107558 (para M.I., K.B., e D.K.).

1. Equipamentos e Suprimentos
<ol><li>Materiais para a coleta de embriões e treinamento de adultos para pôr ovos<ol>
<li>Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mL e abrindo um buraco na tampa para definir um filtro de malha com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)entre o tubo e a tampa. NOTA: Alternativamente, filtros celulares com poros de 100 μm(Mesa de Materiais)podem ser usados para a etapa de filtragem da coleta de embriões.</li>
		<li>Faça pratos de ágar c...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

O uso de rotulagem de corante para estudar morfologia neuronal tem várias vantagens sobre as técnicas genéticas de rotulagem de células. A técnica de rotulagem de corante pode minimizar a quantidade de tempo necessário para rotular e imaginar as morfologias dos neurônios motores. O processo de rotulagem de corante é bastante rápido, pois é preciso menos de 2 h e nos permite definir o contorno das projeções neuronais. Como alternativa, pode-se visualizar o neurônio motor aCC escolhendo uma linha GAL4 que expr...

O sistema de neurônio motor embrionário de Drosophila oferece um poderoso modelo experimental para analisar os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC)1,2,3. O sistema de neurônios motores é passível de técnicas bioquímicas, genéticas, de imagem e eletrofisiológicas. Usando as técnicas, manipulações genéticas e análises funcionais podem ser realizadas no nível dos neurônios motores individuais2,4,5,6.
Durante o desenvolvimento inicial do sistema nervoso, neuroblasts dividir e gerar um grande número de glia e neurônios. A relação espaço-temporal entre a delaminação e o perfil de expressão gênica dos neuroblastos já foi investigada em detalhes7,8,9. No caso do sistema de neurôniomotor, a formação da junção neuromuscular embrionária (NMJ) tem sido extensivamente estudada usando o aCC (célula de canto anterior), RP2 (camarão cru 2) e neurônios motores RP52,10. Por exemplo, quando o neurônio motor RP5 forma uma junção sináptica nascente, a filopodia pré-sináptica e pós-sináptica está misturada11,12,13. Essa comunicação celular direta é vital para iniciar a formação nmj. Ao contrário do que sabemos sobre os ramos nervosos periféricos, nosso conhecimento de como os dendritos motores iniciam conectividade sináptica dentro do SNC ainda é primitivo.
Neste relatório, apresentamos uma técnica que permite a rotulagem retrógrada dos neurônios motores em embriões por meio de entrega mediada por micropipette de corantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear os 38 neurônios motores innervating cada um dos 30 músculos da parede do corpo em um hemi-segmento em 15 h após a postura de ovos (AEL)14. Ao utilizar esta técnica, o nosso grupo investigou exaustivamente numerosos alelos de ganho de função/perda de função15,16,17. Recentemente, desvendamos os mecanismos moleculares que impulsionam o início da conectividade de dendrita motoreae e demonstramos que uma interação Dscam1-Dock-Pak define o local de conseqüência dendrita no neurônio motoraCC 17. Em geral, esta técnica é adaptável para a análise fenotípica de quaisquer neurônios motores embrionários em tipo selvagem ou cepas mutantes, aumentando a nossa capacidade de fornecer novos insights sobre o design funcional do sistema nervoso Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Descrevemos uma técnica para rotulagem retrógrada de neurônios motores em Drosophila. Usamos um corante lipofílico dissolvido em óleo e entregamos uma pequena gota para uma preparação de filé embrionário por um microinjetor. Cada neurônio motor cuja membrana é contatada pela gotícula pode então ser rapidamente rotulado. Neurônios motores individuais são continuamente rotulados, permitindo que detalhes estruturais finos sejam claramente visualizados. Dado que os corantes lipofílicos vêm em várias cores, a técnica também fornece um meio para obter neurônios adjacentes rotulados em multicolor. Esta técnica de rastreamento é, portanto, útil para estudar morgênese neuronal e conectividade sináptica no sistema de neurônios motores de Drosophila.

Uma imagem representativa dos neurônios motores aCC e RP3 é mostrada na Figura 3C para demonstrar a rotulagem multicolorida dos neurônios motores a 15 h AEL. Suas morfologias dendríticas são em grande parte invariáveis entre embriões. O padrão de coloração obtido com anticorpo anti-HRP é mostrado em cinza. Uma pequena gota de DiO ou DiD foi depositada no NMJ do músculo 1 ou 6/7, respectivamente. A Figura 4 demonstra a capacidade de m...

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Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Descrevemos um método para rastreamento retrógrado dos neurônios motores embrionários Drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos.

Rastreamento retrógrado de neurônios motores embrionários drosophila usando corantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

A técnica de rastreamento descrita neste protocolo nos ajuda a estudar a morfogênese neuronal e a quebrar a conectividade no sistema de neurônios motores de Drosophila. O corante lipofílico pode difundir rapidamente cada parte da membrana celular com uma densidade extremamente alta. É por isso que nosso protocolo resolve eficientemente encontrar estruturas de um neurônio rotulado.Se um terminal de axônio estiver acessível com uma micropipette de injeção, essa técnica pode ser aplicada a qualquer neurônio nos estágios larval e adulto de moscas ou em outros organismos. Se você não tem experiência em dissecar ou usar um microinjetor precisa da operação no espécime, pode ser desafiador. Entender a anatomia do embrião, ajudará com orientação para a porção adequada de ferramentas para realizar dissecção ou uma dinjeição.Para iniciar, prepare e desemem tudo sobre materiais de coleta de embriões. Prepare o aparelho de filtragem cortando um tubo de 50 mililitros e cortando um orifício na tampa. Em seguida, coloque um filtro de malha com 100 poros de micrômetro entre o tubo e a tampa.Prepare a micropipette de injeção de corante e a agulha de dissecção a partir da mesma tubulação capilar com diâmetro interno de 1,2 milímetros. Puxe a tubulação com uma micropipette, puxe a 7% da saída máxima de 170 volts para criar uma agulha afiada com um afunilamento de cerca de 0,4 centímetros de comprimento. Para preparar a micropipette de injeção de corante, mergulhe o moedor com um agente de molhar e coloque a agulha no grampo de micropipette a 25 a 30 graus.Em seguida, abaixe a ponta em dois terços do raio para fora do centro da superfície de chanfrado. Triture a agulha enquanto uma seringa com tubo empurra ar para dentro. Marque a micropipette com um marcador permanente de ponta fina para indicar a posição da abertura na ponta após o chanfrado, pois pode ser desafiador localizar a abertura estreita que é formada em um ângulo.Deixe as moscas colocarem ovos durante a noite em temperatura ambiente e coletar o tubo com os ovos pela manhã. Para coletar os embriões, descrilorizar os ovos na placa com 50% de alvejante por cinco minutos. Uma vez que os cloros tenham limpado, despeje o conteúdo da placa através do aparelho de filtragem ou coador celular para isolar os embriões.Use uma garrafa de água para diluir o alvejante deixado na placa e reúna o maior número possível de embriões decantando a mistura no filtro. Lave os embriões três a quatro vezes com água até que o odor alvejante se dissipe. Retire o filtro do aparelho e lave-os em outra placa limpa com água.Em seguida, decantar a água da nova placa em que os embriões estão. Use fórceps finos para selecionar de cinco a 10 embriões às 15 horas após a colocação do ovo e coloque-os em fita dupla face com o lado dorsal voltado para cima. Adicione soro fisiológico de insetos à piscina de dissecção para proteger os embriões da proficação.Use uma agulha de vidro sob um microscópio de dissecção para arrastar o embrião da membrana middling da fita para o vidro, tomando cuidado para não danificar os tecidos internos do embrião. Em seguida, corte através da linha média de um único embrião em sua superfície de sua extremidade posterior para anterior. Vire os tecidos epiteliais do centro e conecte a borda epidérmica na superfície do deslizamento de vidro.Use uma agulha conectada com uma abertura de ponta de cerca de 300 micrômetros para aspirar ou soprar ar para remover os troncos traqueais longitudinais dorsais, bem como quaisquer tripas restantes. Use 4% PFA e PBS para fixar os embriões por cinco minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital. Em seguida, lave-os três vezes com PBS.Manche os embriões com um microlitro de anticorpo peroxidase anti rabanete conjugado com corante de cianeina3 e 200 microliters de PBS por uma hora no agitador orbital. E repita as lavagens na PBS. Para preencher a micropipette de injeção, coloque-a no suporte capilar.Em seguida, coloque o slide de corante sobre o palco e use o micromanipulador para posicioná-lo sobre o slide. Em seguida, ajuste o palco para colocar a micropipette no corante. Colete o corante na micropipette definindo a pressão de injeção entre 200 e 500 hectopascal, o tempo de injeção entre 0,1 e 0,5 segundos e a pressão de compensação a zero por cinco minutos.Uma vez coletado o corante, remova o slide de corante e coloque a amostra no estágio do microscópio. Em seguida, aumente a pressão de compensação para uma faixa de 30 a 60 hectopascal e abaixe a micropipette na amostra. Use a lente 10 vezes objetiva para localizar o embrião e alinhar a micropipette com o embrião.Mude a lente objetiva para uma lente de imersão em água 40 vezes. E submergir a lente na PBS. Use microscopia de fluorescência para verificar a morfologia neuronal marcada pelo anti-HRP Cy3 e determinar o local da injeção.Quando o embrião está em foco mude a posição da micropipette para fazer contato suave com a ponta do axônio de interesse. Em seguida, use microscopia de campo brilhante durante a injeção para ver a gota de corante. Solte o corante no hemisegmento abdominal direito na junção neuromuscular de aCC ou RP3 com DiD ou DiO.Use o controle manual para liberar o corante e remova a micropipette. Em seguida, passar para o próximo local de injeção. Incubar a amostra por uma hora à temperatura ambiente em um agitador orbital antes da imagem.Usando fórceps finos, remova as fitas do deslizamento de vidro. Para montar a amostra, prepare um deslizamento de cobertura com uma pequena quantidade de graxa de vácuo nos quatro cantos. Coloque-o cuidadosamente na amostra, certificando-se de evitar bolhas de ar.Empurre para baixo o deslizamento de cobertura para ajustar o espaço da amostra para permitir a distância de trabalho entre a lente objetiva e o slide. Remova qualquer excesso de PBS com lenços de tarefa. Sele completamente as bordas do deslizamento da tampa com esmalte.Imagem em 10 vezes e 100 vezes ampliação com um microscópio confocal e processe as imagens, com o software imageJ. Este protocolo foi usado para rotular retrógrado o neurônio motor aCC inervando o músculo um e o neurônio motor RP3 inervando os músculos seis e sete. Os ramos dendráticos dos neurônios motores ACC e RP3 mostram extensa sobreposição.Ambos os neurônios são bipolares, estabelecendo duas populações diferentes de dendritos. Para demonstrar as capacidades quantitativas deste método, o número total de pontas dendrite foi contado em tipo selvagem e mutantes Dscam1. Os dendritos ipsilaterais de aCC são mostrados para o tipo selvagem, mas poucos dendritos ipsilaterais foram observados para o mutante Dscam1.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que o tamanho da gotícula de corante é crucial, que é de aproximadamente 10 a 20 micrômetros. Teste o tamanho da fita dupla face e, em seguida, aplique-a no local da injeção. Usando este procedimento, podemos aproveitar a propriedade comutação fotográfica da sonda DiD para obter imagens de super resolução da membrana plasmática.Dessa forma, podemos estudar a caracterização ultra estrutural das membranas sinápticas na junção neuromuscular. Fizemos o clique. Realizamos análise fenotípica dos dendritos aCC na cepa mutante, e descobrimos que uma injeção Dscam1-Dock-Pak define o local do crescimento do dendrito no ACC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Biologia do Desenvolvimento

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Transcriptoma Profiling de<em&gt; In-Vivo</em&gt; embriões produzidos pré-implantação dos bovinos por meio de duas cores Plataforma Microarray

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In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Rastreamento de expressão gênica, através da detecção de atividade de β-galactosidase em embriões de rato inteiro

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualizar Drosophila perna neurônio Motor axônios através da cutícula adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Descongelamento, cultivo e Cryopreserving linhas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Rastreamento genético clonal usando o mouse confetti para estudar tecidos mineralizados

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciação neural eficiente usando a cultura unicelular de células-tronco embrionárias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...