Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Мы благодарим членов лаборатории Камиямы за комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана NIH R01 NS107558 (м.и., К.Б. и Д.К.).

1. Оборудование и материалы
<ol><li>Материалы для сбора эмбрионов и обучения взрослых откладывать яйца<ol>
<li>Подготовка фильтрации аппарата, разрывая 50 мл трубки и резки открыть отверстие в крышке установить сетчатый фильтр с порами 100 мкм (Таблица материалов) между трубкой и крыш?...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

Использование маркировки красителей для изучения морфологии нейронов имеет ряд преимуществ по сравнению с методами генетической маркировки клеток. Техника маркировки красителя может свести к минимуму время, необходимое для маркировки и визуализации морфологий моторных нейронов. Пр...

Эмбриональная двигательная нейронная система Дрозофилы предлагает мощную экспериментальную модель для анализа механизмов, лежащих в основе развития центральной нервной системы (ЦНС)1,2,3. Система моторных нейронов поддается биохимическим, генетическим, визуальным и электрофизиологическим методам. Используя методы, генетические манипуляции и функциональные анализы могут быть проведены на уровне одиночных моторных нейронов2,4,5,6.
Во время раннего развития нервной системы нейробласты делятся и генерируют большое количество глии и нейронов. Пространственно-временной связи между delamination и профиль экспрессии генов нейробластов ранее были исследованы в деталях7,8,9. В случае двигательной нейронной системы, формирование эмбрионального нервно-мышечного соединения (NMJ) было широко изучено с помощью aCC (передняя угловая клетка), RP2 (сырые креветки 2), и RP5 моторных нейронов2,10. Например, когда двигательный нейрон RP5 образует зарождающийся синаптический узел, досинаптический и постсинаптический филоподия переплета11,12,13. Такая прямая сотовая связь имеет жизненно важное значение для инициирования формирования NMJ. Вопреки тому, что мы знаем о периферических нервных ветвей, наши знания о том, как моторные дендриты инициировать синаптические связи в ЦНС по-прежнему примитивным.
В этом отчете мы представляем метод, который позволяет ретроградную маркировку моторных нейронов в эмбрионах с помощью микропипети-опосредованного доставки липофильных красителей. Этот метод позволяет нам проследить 38 моторных нейронов, иннервирующих каждый из 30 мышц стенки тела в геми-сегменте на 15 ч после откладки яиц (AEL)14. Используя эту технику, наша группа тщательно исследовала многочисленные выгоды-оф-функции / потери функции аллелей15,16,17. Недавно мы разгадали молекулярные механизмы, которые управляют инициации соединения двигательного дендрита и показали, что взаимодействие Dscam1-Dock-Pak определяет место развития дендрита в моторном нейроне ACC17. В целом, этот метод адаптируется для фенотипического анализа любых эмбриональных моторных нейронов в диком типе или мутантных штаммов, повышая нашу способность предоставлять новые идеи в функциональном дизайне нервной системы Дрозофилы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Мы описываем технику ретроградной маркировки моторных нейронов в Дрозофиле. Мы используем растворенный маслом липофильный краситель и доставляем небольшую капельку в эмбриональную подготовку филе микроинжетором. Каждый моторный нейрон, мембрана которого контактирует с каплей, может быть быстро помечен. Индивидуальные моторные нейроны постоянно маркируются, что позволяет четко визуализировать детали конструкций. Учитывая, что липофильные красители бывают различных цветов, техника также обеспечивает средства, чтобы получить соседние нейроны помечены в многоцветных. Этот метод отслеживания поэтому полезен для изучения нейрональных морфогенеза и синаптической связи в двигательной нейронной системы Drosophila.

Репрезентативное изображение моторных нейронов ACC и RP3 показано на рисунке 3C, чтобы продемонстрировать разноцветную маркировку моторных нейронов на уровне 15 л. Их дендритные морфологии в значительной степени инвариантны между эмбрионами. Шаблон окрашивания, ?...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Мы описываем метод ретроградного отслеживания дрозофилэмбриональных моторных нейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей.

Ретроградная трассировка дрозофилических мотонейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Техника отслеживания, описанная в этом протоколе, помогает нам изучать морфогенез нейронов и оснастки подключения в системе моторных нейронов Drosophila. Липофильные красители могут быстро рассеиваться в каждой части клеточной мембраны с чрезвычайно высокой плотностью. Вот почему наш протокол эффективно решает найти структуры помечены нейрона.Если аксон терминал доступен с инъекцией micropipette, этот метод может быть применен к любому нейрону в личинок и взрослых стадиях мух или в других организмах. Если у вас нет опыта вскрытия или использования микроинъектора точной операции на образце, может быть сложной задачей. Понимание анатомии эмбриона, поможет с руководством к надлежащей порции инструментов для проведения вскрытия или dinjection.Для начала подготовьте и расфасуйте все материалы для сбора эмбрионов. Подготовь фильтрационный аппарат, отрезав 50-миллилитровую трубку и разрезав отверстие в крышке. Затем установите сетчатый фильтр со 100 микрометровых пор между трубкой и крышкой.Приготовьте микропипет для инъекций красителя и иглу для вскрытия из той же капиллярной трубки с внутренним диаметром 1,2 миллиметра. Потяните трубку с микропипетом, шкив на 7% от 170 вольт максимальный выход для создания острой иглы с конусом около 0,4 сантиметров в длину. Чтобы подготовить микропипет для инъекций красителя, замочите мясорубку с смачиванием и поместите иглу на зажим микропипюты при 25-30 градусах.Затем опустите кончик на две трети радиуса из центра скошенной поверхности. Измельчить иглу в то время как шприц с трубкой толкает воздух в него. Отметте микропипет с тонкой наконечником постоянного маркера, чтобы указать положение отверстия на кончике после скошения, потому что это может быть сложной задачей, чтобы найти узкое отверстие, которое формируется под углом.Разрешить мух откладывать яйца на ночь при комнатной температуре и собирать трубку с яйцами в первой половине дня. Для сбора эмбрионов, dechlorinate яйца на тарелке с 50% отбеливателя в течение пяти минут. После того, как хлорионы очистили, залить содержимое пластины через фильтрационный аппарат или клеточный ситечко, чтобы изолировать эмбрионы.Используйте выжать бутылку воды, чтобы разбавить отбеливатель слева на тарелке и собрать как можно больше эмбрионов, как это возможно, декантирование смеси в фильтр. Вымойте эмбрионы три-четыре раза водой, пока запах отбеливателя рассеивается. Снимите фильтр с аппарата и вымойте его на другую чистую тарелку с водой.Затем вы декант воды из новой пластины, что эмбрионы находятся на. Используйте тонкие типсы, чтобы выбрать от пяти до 10 эмбрионов в течение 15 часов после откладки яиц и поместить их на двустороннюю ленту с спинной стороны лицом вверх. Добавьте солевой раствор звона насекомых в бассейн для вскрытия, чтобы защитить эмбрионы от высыхания.Используйте стеклянную иглу под микроскопом вскрытия, чтобы вытащить эмбрион из средней мембраны из ленты на стекло, заботясь, чтобы не повредить внутренние ткани эмбриона. Затем прорезать середину линии одного эмбриона на его поверхности от задней до передней части. Переверните эпителиальные ткани из центра и прикрепите эпидермальный край на поверхность стеклянной горки.Используйте трубку подключен иглы с кончиком открытия около 300 микрометров, чтобы аспирировать или дуть воздух, чтобы удалить спинной продольной трахеи стволов, а также любые оставшиеся кишки. Используйте 4%PFA и PBS, чтобы исправить эмбрионы в течение пяти минут при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Затем мыть их три раза с PBS.Пятно эмбрионов с одним микролитером анти хрена пероксидазы антител, конъюгированных с красителем Cyanine3 и 200 микролитров PBS в течение одного часа на орбитальном шейкере. И повторите моет в PBS. Чтобы заполнить инъекцию micropipette, поместите его в капиллярный держатель.Затем поместите слайд красителя на сцену и используйте микроманипулятор, чтобы распоят его над слайдом. Затем отрегулируйте сцену, чтобы поместить микропипюту на краситель. Соберите краситель в микропипете, установив давление впрыска между 200 и 500 гектопаскаль, время впрыска между 0,1 и 0,5 секунды и компенсационные давления до нуля в течение пяти минут.После того, как краситель был собран, удалите слайд красителя и поместите образец на стадии микроскопа. Затем увеличьте компенсациое давление до диапазона от 30 до 60 гектопаскалей и опустите микропипет в образец. Используйте объектив 10 раз, чтобы найти эмбрион и выровнять микропипюту с эмбрионом.Измените объектив цели на погружение в воду в 40 раз объектив. И погрузи объектив в PBS. Используйте флуоресцентную микроскопию, чтобы проверить нейронную морфологию, отмеченную анти-HRP Cy3, и определить место инъекции.Когда эмбрион находится в фокусе изменить положение микропипета, чтобы сделать нежный контакт с кончиком аксона интереса. Затем используйте яркую микроскопию поля во время инъекции, чтобы увидеть капли красителя. Бросьте краситель в правой брюшной гемисегации на нервно-мышечном стыке ACC или RP3 либо с DiD или DiO.Используйте ручной контроль, чтобы освободить красителя и удалить микропипют. Затем перейти к следующему месту инъекции. Инкубировать образец в течение одного часа при комнатной температуре на орбитальном шейкере перед визуализацией.Используя тонкие типсы, удалите ленты со стеклянной горки. Чтобы смонтировать образец, подготовьте крышку скольжения с небольшим количеством вакуумной смазки на четырех углах. Аккуратно помещайте его на образец, убедившись, что избежать пузырьков воздуха.Нажмите вниз крышку скольжения, чтобы настроить пространство из образца для позволяя рабочее расстояние между объективом цели и слайд. Удалите излишки PBS с помощью салфеток задач. Полностью запечатать края крышки скольжения с лаком для ногтей.Изображение в 10 раз и 100 раз больше с конфокального микроскопа и обрабатывать изображения, с программным обеспечением imageJ. Этот протокол был использован для ретроградной этикетки ACC двигатель нейрона иннерватирования мышцы один и RP3 двигатель нейронов иннерватных мышц шесть и семь. Дендритные ветви моторных нейронов АКК и RP3 имеют обширное перекрытие.Оба нейрона являются биполярными, создание двух различных популяций дендритов. Чтобы продемонстрировать количественные возможности этого метода, общее количество кончиков дендрита было подсчитано в диком типе и мутантах Dscam1. Ипсилатеральные дендриты aCC показаны для дикого типа, но несколько ипсилатеральных дендритов наблюдались для мутанта Dscam1.При попытке этой процедуры, важно помнить, что размер капли красителя имеет решающее значение, которое составляет примерно от 10 до 20 микрометров. Проверьте размер на двухсторонней ленте, а затем применить его к месту инъекции. Используя эту процедуру, мы можем воспользоваться фото переключаемым свойством зонда DiD для получения изображений супер разрешения плазменной мембраны.Таким образом, мы можем изучить ультра структурную характеристику синаптических мембран на нервно-мышечном стыке. Мы сделали щелчок. Мы провели фенотипический анализ дендритов ACC в штамме мутантов, и обнаружили, что инъекция Dscam1-Dock-Pak определяет место наросты дендрита в aCC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Анализ кардиомиоцитов развития с помощью иммунофлюоресценции в эмбриональных мыши Сердце

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Метод Lineage Tracing из клетки роговицы, используя Multi-Color Люминесцентная Reporter Мышей

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Транскриптом профилирование<em&gt; In-Vivo</em&gt; Производимые Бычьи Эмбрионы предимплантационной Использование Двухцветный Microarray платформы

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Трассировка экспрессии генов путем обнаружения активности β-галактозидазы в целом мыши эмбрионов

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Визуализировать дрозофилы ноги мотонейрона аксоны через взрослых кутикулы

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Клональная генетическая трассировка с помощью мыши Confetti для изучения минерализованных тканей

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Эффективная нейронная дифференциация с использованием одноклеточной культуры эмбриональных стволовых клеток человека

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...