Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Agradecemos a los miembros del Laboratorio Kamiyama por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. y D.K.).

1. Equipos y suministros
<ol><li>Materiales para recoger embriones y entrenar a adultos para poner óvulos<ol>
<li>Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa. NOTA: Alternativamente, los coladores celulares con poros de 100 m(Tabla de Materiales)se pueden utilizar para el paso de filtración de la recolección de embriones.</li>
		<li>...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

El uso del etiquetado de tintes para estudiar la morfología neuronal tiene varias ventajas sobre las técnicas genéticas de etiquetado celular. La técnica de etiquetado de tintes puede minimizar la cantidad de tiempo necesario para etiquetar e tomar imágenes de las morfologías de las neuronas motoras. El proceso de etiquetado del tinte es bastante rápido, ya que toma menos de 2 h y nos permite definir el contorno de las proyecciones neuronales. Como alternativa, se puede visualizar la neurona motora aCC eligiendo u...

El sistema de neuronas motoras embrionarias de Drosophila ofrece un potente modelo experimental para analizar los mecanismos subyacentes al desarrollo del sistema nervioso central (SNC)1,2,3. El sistema de neuronas motoras es susceptible de técnicas bioquímicas, genéticas, de imágenes y electrofisiológicas. Utilizando las técnicas, las manipulaciones genéticas y los análisis funcionales se pueden llevar a cabo a nivel de neuronas motoras individuales2,4,5,6.
Durante el desarrollo temprano del sistema nervioso, los neuroblastos se dividen y generan un gran número de glia y neuronas. La relación espaciotemporal entre la delaminación y el perfil de expresión génica de los neuroblastos se ha investigado previamente en detalle7,8,9. En el caso del sistema de neuronas motoras, la formación de unión neuromuscular embrionaria (NMJ) se ha estudiado ampliamente utilizando el aCC (célula de esquina anterior), RP2 (camarón crudo 2), y las neuronas motoras RP52,10. Por ejemplo, cuando la neurona motora RP5 forma una unión sináptica naciente, la filopodia presináptica y postsináptica se entremezclanitora 11,12,13. Dicha comunicación celular directa es vital para iniciar la formación de NMJ. Contrariamente a lo que sabemos sobre las ramas nerviosas periféricas, nuestro conocimiento de cómo las dendritas motoras inician la conectividad sináptica dentro del SNC sigue siendo primitivo.
En este informe, presentamos una técnica que permite el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en embriones mediante la administración mediada por micropipette de colorantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear las 38 neuronas motoras que inertan cada uno de los 30 músculos de la pared corporal en un hemisegmento a las 15 h después de la puesta de huevos (AEL)14. Mediante el uso de esta técnica, nuestro grupo ha investigado a fondo numerosos alelos de ganancia de función/pérdida de función15,16,17. Recientemente hemos desentrañado los mecanismos moleculares que impulsan el inicio de la conectividad de dendrita motora y hemos demostrado que una interacción Dscam1-Dock-Pak define el sitio de crecimiento de dendrita en la neurona motora aCC17. En general, esta técnica es adaptable para el análisis fenotípico de cualquier neurona motora embrionaria en cepas de tipo salvaje o mutantes, mejorando nuestra capacidad de proporcionar nuevos conocimientos sobre el diseño funcional del sistema nervioso Drosophila.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Describimos una técnica para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en Drosophila. Usamos un tinte lipofílico disuelto con aceite y entregamos una pequeña gota a una preparación de filete embrionario por un microinyector. Cada neurona motora cuya membrana es contactada por la gota puede entonces ser etiquetada rápidamente. Las neuronas motoras individuales se etiquetan continuamente, lo que permite visualizar claramente los detalles estructurales finos. Dado que los colorantes lipofílicos vienen en varios colores, la técnica también proporciona un medio para conseguir neuronas adyacentes etiquetadas en multicolor. Esta técnica de rastreo es por lo tanto útil para el estudio de la morfogénesis neuronal y la conectividad sináptica en el sistema de neuronas motoras de Drosophila.

Una imagen representativa de las neuronas motoras aCC y RP3 se muestra en la Figura 3C para demostrar el etiquetado multicolor de las neuronas motoras a 15 h AEL. Sus morfologías dendríticas son en gran medida invariables entre embriones. El patrón de tinción obtenido con anticuerpos anti-HRP se muestra en gris. Una pequeña gota de DiO o DiD fue depositada en el NMJ del músculo 1 o 6/7, respectivamente. La Figura 4 demuestra la capacidad d...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

La técnica de rastreo descrita en este protocolo nos ayuda a estudiar la morfogénesis neuronal y a romper la conectividad en el sistema de neuronas motoras de Drosophila. El tinte lipofílico puede difundirse rápidamente en cada parte de la membrana celular con una densidad extremadamente alta. Esta es la razón por la que nuestro protocolo se resuelve eficientemente para encontrar estructuras de una neurona etiquetada.Si se puede acceder a un terminal de axón con una micropipeta de inyección, esta técnica podría aplicarse a cualquier neurona en las etapas larvarias y adultas de las moscas o en otros organismos. Si no tiene experiencia diseccionando o utilizando un microinyector preciso la operación en la muestra, puede ser difícil. Comprender la anatomía del embrión, ayudará con la orientación a la porción adecuada de herramientas para llevar a cabo la disección o una inyección.Para empezar, preparar y diseñar todos los materiales de recolección de embriones. Prepare el aparato de filtración cortando un tubo de 50 mililitros y abriendo un agujero en la tapa. A continuación, establezca un filtro de malla con poros de 100 micrómetros entre el tubo y la tapa.Prepare la micropipeta de inyección de tinte y la aguja de disección del mismo tubo capilar con un diámetro interior de 1,2 milímetros. Tire del tubo con una micropipeta, tire al 7% de la salida máxima de 170 voltios para crear una aguja afilada con un cónico de aproximadamente 0,4 centímetros de longitud. Para preparar la micropipeta de inyección de tinte, remoje la amoladora con un agente humectante y coloque la aguja en la abrazadera de micropipeta a 25 a 30 grados.A continuación, baje la punta en dos tercios del radio desde el centro de la superficie biselada. Moler la aguja mientras una jeringa con tubo empuja el aire hacia ella. Marque la micropipeta con un marcador permanente de punta fina para indicar la posición de la abertura en la punta después del biselado, ya que puede ser difícil localizar la abertura estrecha que se forma en un ángulo.Deje que las moscas pongan huevos durante la noche a temperatura ambiente y recoja la pipa con los huevos por la mañana. Para recoger los embriones, desclorina los huevos en la placa con 50% de lejía durante cinco minutos. Una vez que los cloriones se hayan despejado, vierta el contenido de la placa a través del aparato de filtración o colador celular para aislar los embriones.Utilice una botella de agua para diluir la lejía que queda en la placa y reunir tantos embriones como sea posible decantando la mezcla en el filtro. Lave los embriones de tres a cuatro veces con agua hasta que el olor a lejía se disipe. Retire el filtro del aparato y lávelo en otra placa limpia con agua.A continuación, decantar el agua de la nueva placa en la que están los embriones. Utilice fórceps finos para seleccionar de cinco a 10 embriones a las 15 horas después de la puesta del óvulo y colóquelos en cinta adhesiva de doble cara con el lado dorsal hacia arriba. Agregue la solución salina del marcador de insectos a la piscina de disección para proteger los embriones de la desceración.Utilice una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección para arrastrar el embrión fuera de la membrana de inclinación media de la cinta al vidrio, teniendo cuidado de no dañar los tejidos interiores del embrión. Luego corta a través de la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior hasta el extremo anterior. Voltee los tejidos epiteliales desde el centro y conecte el borde epidérmico sobre la superficie del portaobjetos de vidrio.Utilice una aguja conectada al tubo con una abertura de punta de unos 300 micrómetros para aspirar o soplar aire para extraer los troncos traqueales longitudinales dorsales, así como los intestinos restantes. Utilice 4%PFA y PBS para fijar los embriones durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador orbital. A continuación, lávelos tres veces con PBS.Mancha los embriones con un microlitro de anticuerpo antirábano peroxidasa conjugado con tinte Cyanine3 y 200 microlitros de PBS durante una hora en el agitador orbital. Y repite los lavados en PBS. Para llenar la micropipeta de inyección, colóquela en el soporte capilar.A continuación, coloque el tinte deslizar en el escenario y utilice el micromaniprógrafo para colocarlo sobre la diapositiva. A continuación, ajuste el escenario para colocar la micropipeta en el tinte. Recoger el tinte en la micropipeta ajustando la presión de inyección a entre 200 y 500 hectopascal, el tiempo de inyección entre 0,1 y 0,5 segundos y la presión de compensación a cero durante cinco minutos.Una vez recogido el tinte, retire el tobogán del tinte y coloque la muestra en la etapa del microscopio. A continuación, aumente la presión de compensación a un rango de 30 a 60 hectopascale y baje la micropipeta en la muestra. Utilice la lente objetivo 10 veces para localizar el embrión y alinear la micropipeta con el embrión.Cambie la lente objetivo a una lente de inmersión en agua 40 veces. Y sumerge la lente en el PBS. Utilice microscopía de fluorescencia para comprobar la morfología neuronal marcada por anti-HRP Cy3 y determinar el lugar de inyección.Cuando el embrión está enfocado, cambie la posición de la micropipeta para hacer contacto suave con la punta del axón de interés. A continuación, utilice una microscopía de campo brillante durante la inyección para ver la gota de tinte. Suelte el tinte en el hemisegmento abdominal derecho en la unión neuromuscular de aCC o RP3 con DiD o DiO.Utilice el control manual para liberar el tinte y retirar la micropipeta. A continuación, pase al siguiente lugar de inyección. Incubar la muestra durante una hora a temperatura ambiente en un agitador orbital antes de la toma de imágenes.Con fórceps finos, retire las cintas de la corredera de vidrio. Para montar la muestra, prepare un resbalón de cubierta con una pequeña cantidad de grasa al vacío en las cuatro esquinas. Lo colocó cuidadosamente en la muestra, asegurándose de evitar las burbujas de aire.Empuje hacia abajo el resbalón de la cubierta para ajustar el espacio de la muestra para permitir la distancia de trabajo entre la lente objetivo y la diapositiva. Elimine cualquier exceso de PBS con toallitas de tareas. Selle completamente los bordes del resbalón de la cubierta con esmalte de uñas.Imagen a 10 veces y 100 veces la ampliación con un microscopio confocal y procesar las imágenes, con el software imageJ. Este protocolo se utilizó para retrógrado etiquetar la neurona motora aCC inervando músculo uno y la neurona motora RP3 inervando los músculos seis y siete. Las ramas dendríticas de las neuronas motoras ACC y RP3 muestran una superposición extensa.Ambas neuronas son bipolares, estableciendo dos poblaciones diferentes de dendritas. Para demostrar las capacidades cuantitativas de este método, el número total de puntas de dendrita se contó en mutantes de tipo salvaje y Dscam1. Las dendritas ipsilaterales de aCC se muestran para el tipo salvaje, pero se observaron pocas dendritas ipsilaterales para el mutante Dscam1.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el tamaño de la gota de tinte es crucial, que es aproximadamente 10 a 20 micrómetros. Pruebe el tamaño en la cinta de doble cara y luego aplíquelo en el lugar de inyección. Usando este procedimiento, podemos aprovechar la propiedad foto conmutable de la sonda DiD para obtener imágenes de súper resolución de la membrana plasmática.De esta manera podemos estudiar la caracterización ultra estructural de las membranas sinápticas en la unión neuromuscular. Hicimos el clic. Realizamos análisis fenotípicos de las dendritas de ACC en cepa mutante, y descubrimos que una inyección Dscam1-Dock-Pak define el sitio del crecimiento de dendrita en aCC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Análisis para el Desarrollo de los cardiomiocitos mediante inmunofluorescencia en el corazón de embriones de ratón

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Investigación

Biología del Desarrollo

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptoma de perfiles de<em&gt; In-Vivo</em&gt; Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Seguimiento de la expresión génica mediante la detección de actividad de β-galactosidasa en embriones de ratón todo

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualizar Drosophila pierna axones de la neurona de Motor a través de la cutícula del adulto

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Descongelación, cultivo y criopreservación de líneas de células de Drosophila

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Rastreo Genético Clonal usando el ratón de confeti para estudiar tejidos mineralizados

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Diferenciación neuronal eficiente utilizando el cultivo monocelular de células madre embrionarias humanas

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...