Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Vi tackar medlemmarna i Kamiyama Lab för kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av en NIH R01 NS107558 (till M.I., K.B. och D.K.).

1. utrustning och förbrukningsmaterial
<ol><li>Material för att samla in embryon och utbilda vuxna att lägga ägg<ol>
<li>Förbered filtrerings anordningen genom att bryta ett 50 mL rör och skära öppna ett hål i locket för att ställa in ett nätfilter med porer på 100 μm (tabell över material) i mellan röret och locket. Anmärkning: Alternativt kan cell silar med porer på 100 μm (tabell över material) användas för filtrering steg embryosamling.</li>
		<li>Gör agar...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

Användningen av färgmärkning för att studera neuronala morfologi har flera fördelar jämfört med genetisk cell-märkning tekniker. Färgämnes märkning teknik kan minimera den tid som behövs för märkning och avbildning av morfologier av motoriska nervceller. Färgämnes märkning processen är ganska snabb eftersom det tar mindre än 2 h och gör det möjligt för oss att definiera konturerna av neuronala projektioner. Som ett alternativ kan man visualisera aCC motor neuron genom att välja en GAL4 linje som ut...

Det embryonala motor neuron systemet i Drosophila erbjuder en kraftfull experimentell modell för att analysera mekanismerna bakom utvecklingen av centralanervsystemet (CNS)1,2,3. Den motoriska neuron systemet är mottaglig för biokemiska, genetiska, avbildning, och elektrofysiologiska tekniker. Med hjälp av teknikerna kan genetiska manipulationer och funktionella analyser utföras på samma nivå som enskilda motoriska neuroner2,4,5,6.
Under tidig utveckling av nervsystemet, neuroblaster dela och generera ett stort antal glia och neuroner. Den spatiotemporal relationen mellan delaminering och gen uttrycks profilen för neuroblaster har tidigare undersökts i detalj7,8,9. När det gäller motor neuron systemet, bildandet av embryonal neuromuskulär korsning (NMJ) har studerats utförligt med hjälp av aCC (främre hörncell), RP2 (rå räka 2), och RP5 motoriska nervceller2,10. Till exempel, när RP5 motor neuron bildar en begynnande synaptisk korsning, den pre Synaptic och efter Synaptic filopodia blandas11,12,13. Sådan direkt cellulär kommunikation är avgörande för att initiera NMJ bildandet. I motsats till vad vi vet om perifera nerv grenar, vår kunskap om hur motor dendriter initiera synaptisk anslutning inom CNS är fortfarande primitiv.
I denna rapport presenterar vi en teknik som möjliggör retrograd märkning av motoriska nervceller i embryon med hjälp av micropipett-medierad leverans av lipofila färgämnen. Denna teknik gör det möjligt för oss att spåra 38 motoriska nervceller innervating var och en av de 30 kroppen väggen muskler i en Hemi-segmentet på 15 h efter äggläggning (AEL)14. Genom att använda denna teknik, vår grupp har grundligt undersökt många vinst-of-funktion/förlust-av-funktion alleler15,16,17. Vi har nyligen avslöjad de molekylära mekanismer som driver initiering av motor Dendrit anslutning och visade att en Dscam1-dock-Pak interaktion definierar platsen för Dendrit utväxt i aCC motor neuron17. I allmänhet, denna teknik är anpassningsbar för fenotypisk analys av alla embryonala motoriska nervceller i vilda typ eller mutant stammar, förbättra vår förmåga att ge nya insikter i funktionell design av Drosophila nervsystemet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Vi beskriver en teknik för retrograd märkning av motoriska nervceller i Drosophila. Vi använder en oljeupplöst lipofila färgämne och leverera en liten droppe till en embryonal filé beredning av en mikroinjektor. Varje motor neuron vars membran kontaktas av DROPP kan sedan snabbt märkas. Enskilda motoriska neuroner är kontinuerligt märkta, vilket gör att fina strukturella Detaljer tydligt visualiseras. Med tanke på att lipofila färgämnen finns i olika färger, tekniken ger också ett sätt att få intilliggande nervceller märkta i Multicolor. Denna spårningsteknik är därför användbar för att studera neuronala morfogenes och synaptisk konnektivitet i motorneuron system av Drosophila.

En representativ bild av aCC och RP3 motoriska nervceller visas i figur 3C för att demonstrera Multicolor märkning av motoriska nervceller vid 15 h AEL. Deras dendritiska morfologier är till stor del invariant mellan embryon. Det infärgnings mönster som erhålls med anti-HRP-antikropp visas i grått. En liten droppe av DiO eller gjorde var deponeras på NMJ av muskel 1 eller 6/7, respektive. Figur 4 visar förmåga att kvantitativt mäta fe...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Vi beskriver en metod för retrograd spårning av Drosophila embryonala motoriska nervceller med lipofila fluorescerande färgämnen.

Retrograd spårning av Drosophila embryonala motoriska nervceller med lipofila fluorescerande färgämnen

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Den spårningsteknik som beskrivs i detta protokoll hjälper oss att studera neuronal morfoges och knäppa anslutningen i motor neuron systemet av Drosophila. Den lipofila färgämnet kan snabbt diffusa till varje del av cellmembranet med en extremt hög densitet. Det är därför vårt protokoll effektivt löser att hitta strukturer av en märkt neuron.Om en axonterminal är tillgänglig med en injektionsmikropipette, kan denna teknik appliceras på vilken neuron som helst i larv- och vuxenstadierna av flugor eller i andra organismer. Om du inte har någon erfarenhet dissekera eller använda en microinjector exakt operationen på provet, kan vara utmanande. Förstå anatomi embryot, kommer att hjälpa till med vägledning till korrekt portionering av verktyg för att utföra dissekering eller en dinjection.För att starta, förbereda och layout alla embryot samla material. Förbered filtreringsapparaturen genom att bryta ett 50 milliliterrör, och klipp upp ett hål i locket. Ställ sedan in ett nätfilter med 100 mikrometerpor mellan röret och locket.Förbered färgämnet injektionsmikropipette och dissektionsnål från samma kapillärslang med en innerdiameter på 1,2 millimeter. Dra slangen med en mikropipette, puller på 7%från 170 volts maximala utgång för att skapa en vass nål med en kona på ca 0,4 centimeter i längd. För att förbereda färgämnesinjektionsmikropipettet, blötlägg kvarnen med ett vätmedel och placera nålen på mikropipetteklämman vid 25 till 30 grader.Sänk sedan spetsen på två tredjedelar av radien ut från mitten av avfasningsytan. Slipa nålen medan en spruta med slangar trycker in luft i den. Märk mikropipettet med en fin spets permanent markör för att ange öppningens läge vid spetsen efter fasningen eftersom det kan vara utmanande att lokalisera den smala öppningen som bildas i vinkel.Låt flugorna lägga ägg över natten i rumstemperatur och samla röret med äggen på morgonen. För att samla embryona, dechlorinate äggen på tallriken med 50%blekmedel i fem minuter. När klorionerna har rensat, häll innehållet i plattan genom filtreringsapparaturen eller cellsilen för att isolera embryona.Använd en squeeze flaska vatten för att späda blekmedel kvar på plattan och samla så många embryon som möjligt genom dekantera blandningen i filtret. Tvätta embryona tre till fyra gånger med vatten tills blekmedel lukt skingras. Ta bort filtret från apparaten och tvätta dem på en annan ren platta med vatten.Sedan dekantera vattnet från den nya plattan som embryona är på. Använd fina tpåtänger för att välja fem till 10 embryon vid 15 timmar efter äggläggning och placera dem på dubbelsidig tejp med ryggsidan uppåt. Lägg insekts ringer saltlösning till dissektion poolen för att skydda embryona från uttorkning.Använd en glasnål under ett dissekeringsmikroskop för att dra ut embryot från mittmembranet från tejpen på glaset, var noga med att inte skada embryots inre vävnader. Skär sedan genom mittlinjen av ett enda embryo på sin yta från sin bakre till främre ände. Vänd epitelvävnaderna från mitten och fäst den epidermala kanten på glasglasets yta.Använd ett rör ansluten nål med en spets öppning på ca 300 mikrometer till aspirera eller blås luft för att ta bort dorsala längsgående trakeal stammar samt eventuella kvarvarande tarmar. Använd 4%PFA och PBS för att fixera embryona i fem minuter vid rumstemperatur på en orbitalskak. Tvätta dem sedan tre gånger med PBS.Fläcka embryona med en mikroliter av anti pepparrot peroxidas antikropp konjugerat med Cyanin3 färgämne och 200 mikroliter pbs i en timme på orbital shaker. Och upprepa tvättarna i PBS. För att fylla injektionsmikropipetten placerar du den i kapillärhållaren.Nästa plats färgämnet glida på scenen och använda micromanipulator för att placera den över bilden. Justera sedan scenen för att placera mikropipettet på färgämnet. Samla in färgämnet i mikropipettet genom att ställa in insprutningstrycket på mellan 200 och 500 hektopascal, injektionstiden mellan 0,1 och 0,5 sekunder och kompensationstrycket till noll i fem minuter.När färgämnet har samlats, ta bort färgämnet glida och placera provet på mikroskopet scenen. Öka sedan kompensationstrycket till ett intervall på 30 till 60 hektopascal och sänk ner mikropipettet i provet. Använd 10 gånger objektivet för att lokalisera embryot och anpassa mikropipettet med embryot.Ändra objektivet lins till en vatten nedsänkning 40 gånger lins. Och dränka linsen i PBS. Använd fluorescensmikroskopi för att kontrollera den neuronala morfologin som kännetecknas av anti-HRP Cy3 och bestämma injektionsstället.När embryot är i fokus ändra placeringen av mikropipettet för att göra skonsam kontakt med spetsen av axon av intresse. Använd sedan ljusfältsmikroskopi under injektionen för att se färgämnesdroplet. Släpp färgämnet i den högra buken hemisegment vid neuromuskulära korsningen av aCC eller RP3 med antingen DiD eller DiO.Använd handkontrollen för att frigöra färgämnet och ta bort mikropipettet. Gå sedan vidare till nästa injektionsställe. Inkubera provet i en timme i rumstemperatur på en orbitalskakvatten före avbildning.Ta bort banden från glasglaset med hjälp av fina tentsp. För att montera provet, preparera en täcksli med en liten mängd vakuumfett vid de fyra hörnen. Försiktigt placeras den på provet, se till att undvika luftbubblor.Tryck ner luckan för att justera utrymmet från provet för att tillåta arbetsavstånd mellan objektivlinsen och bilden. Ta bort eventuellt överskott PBS med uppgift våtservetter. Helt försegla kanterna på locket glida med nagellack.Bild på 10 gånger och 100 gånger förstoring med ett confocal mikroskop och bearbeta bilderna, med imageJ programvara. Detta protokoll användes för att bakåtsträvande etikett aCC motor neuron innervating muskel en och RP3 motor neuron innervating musklerna sex och sju. Dendritic grenar från ACC och RP3 motor nervceller visar omfattande överlappning.Båda nervcellerna är bipolär, upprättande två olika populationer av dendrites. För att demonstrera de kvantitativa funktionerna i denna metod räknades det totala antalet dendrite-tips i vildtyp och Dscam1-mutanter. Ipsilateral dendrites av aCC visas för vild typ, men få ipsilateral dendrites observerades för Dscam1 mutant.Vid försök till detta förfarande är det viktigt att komma ihåg att storleken på färgämnet droppen är avgörande, vilket är ungefär 10 till 20 mikrometer. Testa storleken på det dubbelsidiga bandet och applicera den sedan på injektionsstället. Med hjälp av denna procedur kan vi dra nytta av den foto switchable egenskapen hos DiD-sond för att erhålla superupplösningsbilder av plasmamembranet.På så sätt kan vi studera den ultra strukturella karakterisering av synaptiska membran vid neuromuskulära korsningen. Vi gjorde klicket. Vi utförde fenotypiska analys av aCC dendrites i mutant stam, och upptäcker att en Dscam1-Dock-Pak injektion definierar platsen för dendrite utväxt i aCC.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En metod för Lineage spårning av hornhinnan celler Använda Multi-färg Fluorescerande Reporter Möss

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Producerad Bovina Preimplantatorisk embryon med hjälp av två-färg microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Spårning av mänskliga Adipose-derived mesenkymala stamceller i en råtta knä artros modell med fluorescerande lipofila membran färgämne

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualisera Drosophila ben motorneuronen axoner genom vuxen nagelbanden

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Upptining, odling och bevarandet Drosophila cellinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonala genetiska spårning använda Confetti musen för att studera mineraliserade vävnader

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

Effektiv neurala differentiering med hjälp av Single-cell kultur av mänskliga embryonala stamceller

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...