Name: retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Biz el yazması üzerinde yorum için Kamiyama Lab üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH R01 NS107558 (M.I., K.B., ve D.K.) tarafından desteklenmiştir.

1. Ekipman ve Sarf Malzemeleri
<ol><li>Embriyo toplamak ve yetişkinleri yumurtlamak için eğitmek için malzemeler<ol>
<li>50 mL'lik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtreleme aparatıhazırlayın ve tüp ile kapak arasında 100 μm 'lik(Malzeme Tablosu)gözenekli bir örgü filtre ayarlayın. NOT: Alternatif olarak, embriyo toplamanın filtrasyon basamaşlarında 100 μm(Malzeme Tablosu)gözenekli hücre süzgeci kullanılabilir.</li>
		<li>Listelenen talimatlara ...

<ol>
	<li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axon+guidance+in+Drosophila.">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li><li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila:+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies.">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).</li><li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva.">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li><li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS.">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li><li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures.">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).</li><li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo.">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).</li><li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS.">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li><li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+neuroblasts:+a+model+for+stem+cell+biology.">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li><li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila.">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li><li>Carrero-Mart&#237;nez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Adhesion+Molecules+at+the+Drosophila+Neuromuscular+Junction.">Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction.</a> The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).</li><li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons.">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li><li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2.">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li><li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia:+accumulation+and+function+of+Capricious.">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li><li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin,+location,+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila.">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li><li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos.">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li><li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS.">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li><li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1.">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li><li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Ringer's+solution.">Drosophila Ringer's solution.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).</li><li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster.">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).</li><li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even-skipped,+acting+as+a+repressor,+regulates+axonal+projections+in+Drosophila.">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li><li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila.">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li><li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robo+and+Frazzled/DCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline.">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li><li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+a+motor+system:+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila.">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).</li></ol>

Nöronal morfolojiyi incelemek için boya etiketlemekullanımının genetik hücre etiketleme tekniklerine göre birçok avantajı vardır. Boya etiketleme tekniği, motor nöronların morfolojilerinin etiketlenmesi ve görüntülenmesi için gereken süreyi en aza indirebilir. Boya etiketleme işlemi 2 saatten az sürer ve nöronal projeksiyonların ana hatlarını tanımlamamızı sağladığından oldukça hızlıdır. Alternatif olarak, bir aCC maya GAL4 transkripsiyon faktörü ifade eden bir GAL4 hattı seçerek aC...

Drosophila embriyonik motor nöron sistemi merkezi sinir sisteminin gelişiminin altında yatan mekanizmaları analiz etmek için güçlü bir deneysel model sunuyor (CNS)1,2,3. Motor nöron sistemi biyokimyasal, genetik, görüntüleme ve elektrofizyolojik tekniklere uygundur. Teknikler kullanılarak, genetik manipülasyonlar ve fonksiyonel analizler tek motor nöronlar düzeyinde yapılabilir2,4,5,6.
Sinir sisteminin erken gelişimi sırasında, nöroblastlar bölmek ve glia ve nöronların çok sayıda üretmek. Delaminasyon ve nöroblastların gen ekspresyonu profili arasındaki spatiotemporal ilişki daha önce ayrıntılı olarak araştırılmıştır7,8,9. Motor nöron sistemi durumunda, embriyonik nöromüsküler kavşak oluşumu (NMJ) kapsamlı aCC kullanılarak çalışılmıştır (ön köşe hücresi), RP2 (ham karides 2), ve RP5 motor nöronlar2,10. Örneğin, RP5 motor nöron bir doğmakta olan sinaptik kavşak formları, pre-sinaptik ve post-sinaptik filopodia11,12,13. Bu tür doğrudan hücresel iletişim NMJ oluşumunu başlatmak için hayati önem taşımaktadır. Periferik sinir dalları hakkında bildiklerimizin aksine, motor dendritlerin CNS içinde sinaptik bağlantıyı nasıl başlattığına dair bilgimiz hala ilkeldir.
Bu raporda, lipophilic boyaların mikropipet aracılı teslimatı ile embriyolarda motor nöronların retrograd etiketlemesağlayan bir teknik sokuldu. Bu teknik bize 38 motor nöronlar her 30 vücut duvarı kasları bir hemi segmentinde innerve izlemenizi sağlar 15 saat sonra yumurta yumurtlama (AEL)14. Bu tekniği kullanarak, grubumuz iyice çok sayıda kazanç-of-fonksiyon / fonksiyon kaybı alel15,16,17araştırdı. Biz son zamanlarda motor dendrite bağlantısı nın başlatılması sürücü moleküler mekanizmaları çözdük ve bir Dscam1-Dock-Pak etkileşimi aCC motor nöron dendrite outgrowth site tanımlar gösterdi17. Genel olarak, bu teknik vahşi tip veya mutant suşları herhangi bir embriyonik motor nöronların fenotipik analizi için uyarlanabilir, Drosophila sinir sisteminin fonksiyonel tasarımı içine yeni anlayışlar sağlamak için yeteneğimizi artırarak.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x objective lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Plan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40x water-immersion lens</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>NIR Apo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubing</td>
			<td>Frederick Haer&#38;Co</td>
			<td>27-31-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Andor</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dragonfly Spinning disk confocal unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>22x22 mm Square #1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiD</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DiO</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>V22887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>SMZ-U</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dow Corning High-Vacuum Grease</td>
			<td>Fisher Sci.</td>
			<td>14-635-5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg collection cage</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>59-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 5247</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>MP-225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette beveler</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BV-10-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>PC-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>47-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Net Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Any EM grades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11666789001</td>
			<td>Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo-Flo 200</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>146 4510</td>
			<td>Wetting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright fluorescence microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Eclipse Ci with a LED light source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinyl Electrical Tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Cell Strainers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10199-659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>FlyStuff</td>
			<td>62-103</td>
			<td>Active dry yeast (RED STAR)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retrograde tracing of drosophila embryonic motor neurons using lipophilic fluorescent dyes

Biz Drosophilamotor nöronların retrograd etiketleme için bir teknik açıklar. Yağda çözünmüş lipophilic boya kullanıyoruz ve mikroenjektör tarafından embriyonik fileto hazırlığına küçük bir damlacık sıyoruz. Membranı damlacıkla temas eden her motor nöron daha sonra hızla etiketlenebilir. Bireysel motor nöronlar sürekli olarak etiketlenir ve ince yapısal detayların net bir şekilde görüntülenmesini sağlar. Lipophilic boyalar çeşitli renklerde gelir göz önüne alındığında, teknik de çok renkli etiketli komşu nöronlar almak için bir araç sağlar. Bu izleme tekniği bu nedenle Drosophilamotor nöron sisteminde nöronal morfogenez ve sinaptik bağlantı incelenmesi için yararlıdır.

ACC ve RP3 motor nöronların temsili bir görüntüsü Şekil 3C'de motor nöronların 15 saat AEL'de çok renkli etiketlemesini göstermek için gösterilmiştir. Dendritik morfolojileri embriyolar arasında büyük ölçüde değişmezdir. Anti-HRP antikorile elde edilen boyama deseni gri renkte gösterilmiştir. DiO veya DiD küçük bir damlacık kas NMJ yatırıldı 1 veya 6 /7, sırasıyla. Şekil 4, ilginin fenotipini nicel olarak ölçm...

Watch this Scientific Journal Video about Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes at JoVE.com

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Biz lipophilic floresan boyalar kullanarak Drosophila embriyonik motor nöronların retrograd izleme için bir yöntem açıklar.

Lipophilic Floresan Boyalar Kullanarak Drosophila Embriyonik Motor Nöronların Retrograd İzleme

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

Bu protokolde açıklanan izleme tekniği nöronal morfogenezi çalışmamıza ve Drosophila'nın motor nöron sistemindeki bağlantıyı yakalamamıza yardımcı olur. Lipophilic boya hızla son derece yüksek yoğunluklu hücre zarının her parçasına yayılabilir. Bu nedenle protokolümüz etiketli bir nöronun yapılarını bulmaya etkin bir şekilde karar verir.Bir akson terminali enjeksiyon mikropipeti ile erişilebilir ise, bu teknik sinekler veya diğer organizmaların larva ve yetişkin aşamalarında herhangi bir nörona uygulanabilir. Numune üzerinde mikroenjektör hassas bir işlem izleme veya kullanma konusunda hiç deneyiminiz yoksa, zor layıcı olabilir. Embriyo anatomisi anlamak, diseksiyon veya dinjection yürütmek için araçların uygun porsiyonrehberlik ile yardımcı olacaktır.Başlamak için, hazırlamak ve düzen tüm embriyo toplama malzemeleri. 50 mililitrelik bir tüpü keserek ve kapakta bir delik açarak filtrasyon aparatını hazırlayın. Daha sonra tüp ve kapak arasında 100 mikrometre gözenekile bir örgü filtre ayarlayın.1.2 milimetre iç çapı ile aynı kılcal boru boya enjeksiyon mikropipet ve diseksiyon iğnesi hazırlayın. Bir mikropipet ile tüp çekin, puller 7% 170 volt maksimum çıkış uzunluğu yaklaşık 0,4 santimetre konik ile keskin bir iğne oluşturmak için. Boya enjeksiyonu mikropipetini hazırlamak için öğütücüye Bir ıslatma maddesi ile ıslatın ve iğneyi 25 ila 30 derece mikropipet kelepçesine yerleştirin.Daha sonra ucu yarıçapın üçte ikisine indirin. İğneyi öğütün, tüplü bir şırınga havayı içine iter. Bir açıda oluşan dar açıklığı bulmak zor olabilir, çünkü beveling sonra ucunda ki açılış konumunu belirtmek için ince bir ucu kalıcı marker ile mikropipet işaretleyin.Sinekler oda sıcaklığında bir gecede yumurtlamak ve sabah yumurta ile boru toplamak için izin verin. Embriyoları toplamak için, beş dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile plaka üzerinde yumurta deklorinat. Kloriyonlar temizlendikten sonra, embriyoları izole etmek için plakanın içeriğini filtrasyon aparatı veya hücre süzgecinden geçirin.Plaka üzerinde bırakılan çamaşır suyunu seyreltmek için bir şişe su kullanın ve karışımı filtreye ayırarak mümkün olduğunca çok embriyo toplayın. Çamaşır suyu kokusu dağılına kadar embriyoları 3-4 kez suyla yıkayın. Filtreyi cihazdan çıkarın ve su yla birlikte başka bir temiz tabağa yıkayın.Sonra da embriyoların üzerinde olduğu yeni plakadan suyu çıkar. Yumurtlamadan 15 saat sonra 5-10 embriyo seçmek için ince çökezleçler kullanın ve sırt tarafı yukarı bakacak şekilde çift taraflı bant üzerine yerleştirin. Desiccation gelen embriyoları korumak için diseksiyon havuzuna böcek zil salin ekleyin.Embriyoyu banttan cam üzerine çıkarmak için bir diseksiyon mikroskobu altında cam iğne kullanın, embriyonun iç dokularına zarar vermemeye özen. Sonra tek bir embriyonun orta çizgisini arka yüzeyinden ön uca doğru kesin. Epitel dokuları merkezden çevirin ve epidermal kenarı cam kaydıraktan yüzeye takın.Dorsal uzunlamasına trakeal gövdeleri yanı sıra kalan bağırsakları kaldırmak için hava aspire veya üfleme için yaklaşık 300 mikrometre bir ucu açılış ile bir tüp bağlı iğne kullanın. Bir orbital shaker üzerinde oda sıcaklığında beş dakika embriyoları düzeltmek için% 4 PFA ve PBS kullanın. Sonra PBS ile üç kez yıkayın.Embriyoları bir mikrolitre anti horseradish peroksidaz antikorile lekelayın. PBS'deki yıkıntıları tekrarlayın. Enjeksiyon mikropipetini doldurmak için kılcal damar tutucuya yerleştirin.Sonraki yere sahneye boya slayt ve slayt üzerinde konumlandırmak için mikromanipülatör kullanın. Daha sonra boya üzerine mikropipet yerleştirmek için sahne ayarlayın. Enjeksiyon basıncını 200 ile 500 hektopascal, enjeksiyon süresini 0,1 ile 0,5 saniye arasında ve telafi basıncını beş dakika sıfıra ayarlayarak boyayı mikropipette toplayın.Boya toplandıktan sonra boya kaydırağını çıkarın ve örneği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra kompansasyon basıncını 30 ila 60 hektopascal aralığına yükseltin ve mikropipeti numuneye indirin. Embriyo bulmak ve embriyo ile mikropipet hizalamak için 10 kez objektif lens kullanın.Objektif lensi 40 kez su daldırma lensine çevirin. Ve lensi PBS'ye batırın. Anti-HRP Cy3 ile işaretlenmiş nöronal morfolojiyi kontrol etmek ve enjeksiyon bölgesini belirlemek için floresan mikroskobu kullanın.Embriyo odak olduğunda ilgi akson ucu ile nazik temas yapmak için mikropipet konumunu değiştirmek. Sonra boya damlacık görmek için enjeksiyon sırasında parlak alan mikroskobu kullanın. Ya DiD veya DiO ile ACC veya RP3 nöromüsküler kavşakta sağ karın hemisegmentinde boya bırakın.Boyayı serbest bırakmak ve mikropipeti çıkarmak için el kontrolünü kullanın. Sonra bir sonraki enjeksiyon bölgesine geçin. Görüntülemeden önce bir orbital shaker üzerinde oda sıcaklığında bir saat için örnek kuluçka.İnce çerkesler kullanarak, bantları cam kaydıraktan çıkarın. Numuneyi monte etmek için, dört köşeye az miktarda vakum yağı içeren bir kapak fişi hazırlayın. Dikkatle hava kabarcıkları önlemek için emin olun, örnek üzerine yerleştirilir.Objektif lens ile slayt arasındaki çalışma mesafesini sağlamak için örnekteki boşluğu ayarlamak için kapak fişini aşağı itin. Görev mendilleri ile fazla PBS'yi çıkarın. Tamamen oje ile kapak kayma kenarları mühür.Bir konfokal mikroskop ile 10 kez ve 100 kez büyütme görüntü ve görüntüJ yazılımı ile görüntüleri işlemek. Bu protokol, aCC motor nöron innerve kas bir ve RP3 motor nöron kasları altı ve yedi innerve etiket retrograd kullanılmıştır. ACC ve RP3 motor nöronlardan gelen dendritik dallar geniş bir çakışma gösterir.Her iki nöron da iki farklı dendrit popülasyonu oluşturarak bipolardır. Bu yöntemin kantit yeteneklerini göstermek için, dendrite ipuçlarının toplam sayısı vahşi tip ve Dscam1 mutantlar olarak sayıldı. ACC ipsilateral dendrites yabani tip için gösterilmiştir, ancak birkaç ipsilateral dendritler Dscam1 mutant için gözlendi.Bu prosedürü denerken, boya damlacık boyutunu yaklaşık 10-20 mikrometre olan çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir. Çift taraflı bant boyutunu test edin ve sonra enjeksiyon sitesine uygulayın. Bu prosedürü kullanarak, plazma zarının süper çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için DiD probunun fotoğraf değiştirilebilir özelliğinden yararlanabiliriz.Bu şekilde nöromüsküler kavşakta sinaptik membranların ultra yapısal karakterizasyonu inceleyebilirsiniz. Tıklamayı yaptık. Mutant suşundaki aCC dendritlerinin henotypik analizini yaptık ve Dscam1-Dock-Pak enjeksiyonunun aCC'deki dendrit büyüme alanını tanımladığını keşfettik.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Embriyonik Fare Heart Immunofluorescence kullanarak kardiyomiyosit Geliştirme Analizi

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profil<em&gt; In-vivo</emİki renkli Mikroarray Platformu Kullanma&gt; Üretilen Sığır pre-implantasyon Embriyolar

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tracing Gene Expression Through Detection of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Drosophila bacak Motor Nöron aksonlar yetişkin kütikül aracılığıyla görselleştirmek

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Mineralize Dokuları Incelemek için Konfeti Faresini Kullanarak Klonal Genetik İzleme

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinin Tek Hücre Kültürünü Kullanarak Etkin Nöral Farklılaşma

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...