Name: fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Wij danken Wendy Herbst en Lindsay Schleifer voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van deze protocollen. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 en 1R15HD096415-01) aan MSS.

<ol>
	<li>Humeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+cell+cycle:+Progression+or+death.">Calcium signaling and cell cycle: Progression or death.</a> Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).</li><li>Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+toolkit+reveals+the+role+of+Ca2++sparklets+in+coordinated+cell+migration.">Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration.</a> PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).</li><li>Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+death:+the+calcium-apoptosis+link.">Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).</li><li>Pham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++and+Mg2++module+conformational+dynamics+and+stability+of+downstream+regulatory+element+antagonist+modulator.">Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator.</a> Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).</li><li>Smedler, E., Uhl&#233;n, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+decoding+of+calcium+oscillations.">Frequency decoding of calcium oscillations.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).</li><li>Moreau, M., N&#233;ant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+coding+and+decoding+strategies+for+the+specification+of+neural+and+renal+precursor+cells+during+development.">Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development.</a> Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).</li><li>Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+functions+as+a+working+memory+of+Ca2++signals+in+decoding+Ca2++oscillation.">NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation.</a> EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).</li><li>Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Control+of+Calcium+Oscillation+Waveform+Defines+NFAT+as+an+Integrator+of+Calcium+Load.">Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load.</a> Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).</li><li>Li, L., Stefan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Le+Nov&#232;re+N.+Calcium+input+frequency,+duration+and+amplitude+differentially+module+the+relative+activation+of+calcineurin+and+CaMKII.">Le Nov&#232;re N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII.</a> PLoS One. 7 (9), 43810 (2012).</li><li>Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+tuning:+Competition's+role+in+setting+the+frequency-dependence+of+Ca2+-dependent+proteins.">Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins.</a> PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820 (2017).</li><li>Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Tuning+Among+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Proteins:+Analysis+of+in+silico+Model+Robustness+and+Parameter+Variability.">Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).</li><li>Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+neuronal+calcium+spikes+during+early+differentiation.">Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).</li><li>Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+homeostatic+specification+of+transmitter+expression+in+embryonic+neurons.">Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons.</a> Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).</li><li>Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+Global+Spontaneous+Calcium+Events+Regulate+Neurite+Outgrowth+and+Onset+of+GABAergic+Phenotype+during+Neural+Precursor+Differentiation.">Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).</li><li>Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Waves+Propagate+through+Radial+Glial+Cells+and+Modulate+Proliferation+in+the+Developing+Neocortex.">Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).</li><li>Nieuewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).</li><li>Paudel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Activity+Dynamics+Correlate+with+Neuronal+Phenotype+at+a+Single+Cell+Level+and+in+a+Threshold-Dependent+Manner.">Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880 (2019).</li><li>Marken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Markovian+Entropy+Measure+for+the+Analysis+of+Calcium+Activity+Time+Series.">A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series.</a> PLoS One. 11 (12), 0168342 (2016).</li><li>Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+Correction+with+Asymmetric+Least+Squares+Smoothing.">Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing.</a> Leiden University Medical Centre Report. , (2005).</li><li>Guemez-Gamboa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell-autonomous+mechanism+of+activity-dependent+neurotransmitter+switching.">Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching.</a> Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).</li><li>Paredes, R., Madelaine, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li></ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Karakteristieke patronen van calciumactiviteit zijn waargenomen in de cellen die deel uitmaken van het ontwikkelende zenuwstelsel, met specifieke soorten activiteit geassocieerd met verschillende neuroontwikkelingsprocessen. Een verder begrip van de mechanismen waarmee deze informatiedichte activiteitspatronen worden vertaald in transcriptiereacties vereist echter dat informatie over calciumactiviteit en genexpressie moet worden verzameld met eencellige resolutie. Terwijl systemen die meer stereotiepe calciumactiviteit vertonen, zoals volwassen neuronen, redelijkerwijs kunnen worden geassuieerd op bulkniveau, worden de onregelmatige patronen die het embryonale zenuwstelsel karakteriseren gemakkelijk gemaskeerd door minder nauwkeurige opnames.
Het experimentele kader dat in dit protocol wordt vastgesteld, is gemakkelijk aan te passen aan een breed scala aan celtypen en fluorescerende verslaggevers. Weefsel dat vrijwel elk celtype of een combinatie van celtypen bevat, kan worden ontleed uit een modelorganisme van belang en verguld voor eencellige beeldvorming. Naast het toestaan van celidentificatie en het isoleren van het effect van celautonome processen, stelt een primaire celkweekbenadering de experimentator in staat om mediacomponenten naar wens te definiëren. Zo zijn experimenten met het vergelijken van de activiteit van neuronale precursoren in 2 mM Ca2+ oplossing uitgevoerd om te onderzoeken of de relaties tussen spikefrequentie en neurotransmitterfetype in het embryonale ruggenmerg kunnen worden samengevat zonder de invloed van celcelinteracties13,20.
Hoewel dit protocol de fluorescerende marker Fluo4-AM gebruikt om intracellulaire calciumactiviteit te detecteren, kunnen gebruikers, afhankelijk van de selectiecriteria, andere commercieel beschikbare markers21selecteren, inclusief genetisch gecodeerde calciumindicatoren. Op dezelfde manier kunnen alternatieve markeringen worden gebruikt om dynamische veranderingen in de concentratie van een ion van belang te controleren (waaronder K+, Na+en Zn2+), membraanpotentieel of cellulaire pH. Beeldinstellingen en beeldduur kunnen indien nodig worden gewijzigd.
Hoewel we calciumactiviteit en neuronale fenotype correleerden als een specifieke toepassing, is deze methode ook van toepassing op een verscheidenheid aan andere cellulaire eigenschappen. Bijvoorbeeld, fluorescentie in situ hybridisatie kan worden uitgevoerd met sondes tegen elk gen van belang, met inbegrip van de neuronale marker ChAT of de transcriptie factor Engrailed, waardoor gevoelige detectie van een aanpasbaar paneel van mRNA soorten. Deze sondes kunnen worden ontworpen om isoform-specifieke, ondersteuning van extra doel specificiteit indien gewenst. Dubbele VIS kan worden uitgevoerd met behulp van sondes geconjugeerd tot verschillende twee verschillende fluorophoren, waardoor de gelijktijdige beoordeling van de expressie van meerdere genen. Echter, de extra wasbeurten vereist door dit type experiment worden geassocieerd met een verhoogde kans op celverlies of beweging en vereisen ervaring en delicatesse met succes worden uitgevoerd.
Ongeacht eventuele experiment-specifieke wijzigingen aan dit protocol, zijn er verschillende belangrijke stappen die zorgvuldige aandacht vereisen. Dissecties moeten met zorg worden uitgevoerd om alle verontreinigde weefsels of celpopulaties te verwijderen; omdat ruimtelijke patronen verloren gaan wanneer de explants worden gescheiden, worden de resterende cellen van naburige weefsels afgewisseld met en niet te onderscheiden van de cellen van belang. Nadat cellen zijn verguld, moeten monsters zo voorzichtig mogelijk worden behandeld om te voorkomen dat cellen worden losgemaakt. Het belangrijkste is dat dit betekent dat alle oplossingswijzigingen langzaam en zorgvuldig moeten worden uitgevoerd, waarbij de pipet aan de rand van de plaat wordt geplaatst wanneer de oplossing wordt verwijderd en toegevoegd. Dit zal ervoor zorgen dat cellen met vertrouwen kunnen worden geïdentificeerd in zowel calcium- als FISH-afbeeldingen. Als cellen tijdens de verwerking worden verstoord, kan het onmogelijk zijn om sommige of alle overeenkomstige cellen tussen de twee afbeeldingen te identificeren. Wij adviseren erring aan de kant van voorzichtigheid met deze opdrachten, zodanig dat alleen ondubbelzinnig overeenkomstige cellen worden gebruikt voor verdere analyse.
Afhankelijk van de biologische vraag die wordt behandeld, kunnen verschillende analysebenaderingen passend zijn. Tijdreeksen calciumactiviteit kunnen op verschillende manieren worden verwerkt en gekwantificeerd, met een flexibiliteit van de onderzoeker bij het kiezen van detrendingparameters, analysestatistieken en analyseparameters (bijvoorbeeld het percentage basislijndrempel dat wordt gebruikt om een calciumpiek te definiëren). Correlaties tussen calciumactiviteit en het niveau van genexpressie kunnen worden getrokken door genexpressie te analyseren als een absolute of relatieve fluorescentiewaarde die uit het FISH-beeld wordt gehaald. Als alternatief kunnen correlaties tussen calciumactiviteit en genexpressie (aanwezigheid/afwezigheid) worden getrokken door een fluorescentiedrempel voor positief genexpressiesignaal te definiëren en 'ja' of 'nee'-id'-identificatiemiddelen toe te wijzen aan individuele cellen. Als geheel biedt dit experimentele schema een ongelooflijk flexibele pijplijn voor het verzamelen en voorbereiden van tijdreeksgegevens in combinatie met cel-overeenkomende genexpressiegegevens. Dergelijke experimenten zullen van cruciaal belang zijn voor een beter begrip van de complexe relaties tussen cellulaire dynamiek en transcriptieveranderingen, zoals blijkt uit de identificatie van calciumactiviteitspatronen die kenmerkend zijn voor remmende en excitatorische neuronale precursoren in embryonale Xenopus laevis.

Vrij cytosolisch calcium is van cruciaal belang voor een verscheidenheid aan biologische processen, variërend van celproliferatie en migratie tot apoptose en autofagie1,2,3. Binnen deze trajecten kan calcium downstream-effecten op genexpressie uitoefenen door te interageren met calciumbindende domeinen om conformatieveranderingen te veroorzaken die eiwitactiviteit en interacties moduleren. Bijvoorbeeld, een neuronale calcium sensor bekend als de Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wordt gehouden in een ontvouwde tussenliggende conformatie wanneer gebonden door calcium, waardoor het niet interactie met zijn eiwitten en DNA-doelen4. Naast het dienen als een eenvoudig signaalmolecuul, echter, de dynamische aard van intracellulaire calcium transiënten kan deze activiteit patronen te coderen meer complexe amplitude- of frequentie-gebaseerde signalen5,6. Nucleaire translocatie van de transcriptiefactor nucleaire factor van geactiveerde T-cellen (NFAT) wordt versterkt door hoogfrequente calciumschommelingen, maar geremd door laagfrequente oscillaties7. Overtuigend, recent werk heeft gesuggereerd dat NFAT daadwerkelijk kan reageren op cumulatieve blootstelling aan calcium8. Zowel calcineurine als Ca2+/calmodulin-afhankelijke eiwit kinase II (CaMKII) vertonen ook verschillende reacties op calciumtransiënten van een specifieke frequentie, duur of amplitude9. Om een extra niveau van regelcomplexiteit toe te voegen, suggereren computationele modellen dat veel downstream calciumbindende eiwitten min of meer frequentieafhankelijk worden in reactie op de aanwezigheid of afwezigheid van bindende concurrenten10,11.
Binnen het ontwikkelende zenuwstelsel zijn twee hoofdklassen van calciumactiviteitsgedrag gedefinieerd en geassocieerd met specifieke biologische processen. Calcium instroom worden geclassificeerd als "spikes" als ze zich voordoen binnen individuele cellen, bereiken een piekintensiteit van ~ 400% van de basislijn binnen vijf seconden, en vertonen dubbele exponentiële verval12. Dit type signaal wordt voornamelijk geassocieerd met neurotransmitter fenotype specificatie13. In tegenstelling, "golven" worden gedefinieerd als langzamer, minder extreme calcium transiënten waarin een cel intracellulaire calcium concentratie stijgt tot ~ 200% van de basislijn over een periode van dertig seconden of meer, dan vervalt over enkele minuten12. Deze signalen verspreiden zich vaak over meerdere naburige cellen, en hun aanwezigheid is geassocieerd met neurite uitgroei en celproliferatie14,15. Hoewel deze twee klassen zijn gedefinieerd op basis van karakteristieke kinetische profielen, blijft het onduidelijk welke kenmerken van deze patronen daadwerkelijk door cellen worden gedetecteerd en door downstream-effectoren worden vertaald.
Inzicht in de relatie tussen intracellulaire calciumschommelingen en genexpressie zou cruciaal inzicht geven in een van de regulerende mechanismen die een passende ontwikkeling en patronen van het zenuwstelsel garandeert. Hiertoe hebben studies van het embryonale ruggenmerg aangetoond dat verhoogde calciumpiekactiviteit tijdens de ontwikkeling wordt geassocieerd met hogere niveaus van remmende neuronen, terwijl verminderde calciumpiekactiviteit wordt geassocieerd met hogere niveaus van excitatory neuronen13. Deze tests op populatieniveau zijn echter niet gebruikt om calciumactiviteit te associëren met genexpressie op een eencellige niveau.
Het benaderen van deze vragen op het niveau van de eencellige cel biedt verschillende voordelen ten opzichte van eerder werk. Voor een, de mogelijkheid om calcium activiteit en genexpressie in veel cellen individueel te beoordelen maakt het mogelijk het volledige repertoire van verschillende activiteit patronen worden waargenomen zonder te worden versluierd door een bulk-level meting. Bovendien betekent het bestuderen van deze relaties in eencellige primaire cultuur dat celautonome verbanden tussen calciumactiviteit en genexpressie worden gehandhaafd, terwijl interacties die celcelcommunicatie vereisen, zullen worden ingetrokken. Daarom maakt deze aanpak het mogelijk om deze celautonome mechanismen afzonderlijk te bestuderen. Het maakt het echter ook mogelijk om de rol van niet-celautonome calciumactiviteit op te helderen en te ondervragen. Cellen kunnen bijvoorbeeld worden ontleed uit een embryo in het neurale plaatstadium, gekweekt totdat de controle van het broertje het neurale buisstadium bereikt en vervolgens vergeleken met cellen die vers zijn ontleed uit een embryo in neurale buisfase. Dit maakt directe vergelijking van cellen die celcelcommunicatie over een belangrijke ontwikkelingsperiode behielden mogelijk toe aan cellen waarin celcelcommunicatie werd afgeschaft.
Bij het aanpakken van de beperkingen van eerdere experimentele benaderingen, ontwikkelden we een protocol dat de beoordeling van zowel calciumactiviteit als genexpressie in individuele neurale voorlopercellen mogelijk zou maken, waardoor de correlatie van specifieke activiteitspatronen met daaropvolgende differentiatieprogramma's wordt vergemakkelijkt. Neurale weefsel werd ontleed uit Xenopus laevis in verschillende stadia van neurale ontwikkeling, gescheiden in enkele cellen, en afgebeeld via confocale microscopie in aanwezigheid van een fluorescerende calcium indicator. Na live-celbeeldvorming werden monsters vastgesteld en getest via fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om expressie van een gen of isoforme van belang te detecteren. Belangrijk is dat individuele cellen kunnen worden gevolgd in beide beeldvormingsexperimenten, wat betekent dat het calciumactiviteitsprofiel van een cel en het genexpressieniveau met elkaar kunnen worden geassocieerd(figuur 1). Het hier gerapporteerde protocol is bedoeld om relaties tussen calciumactiviteitspatronen en genexpressie over embryonale neuroontwikkeling in Xenopus laeviste onderzoeken. Echter, de bredere experimentele kader (single-cell time-course imaging gevolgd door FISH en beeld coregistratie) kan worden gewijzigd en toegepast op vrijwel elk celtype, fluorescerende reporter, en gen van belang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Animal Husbandry &#38; Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHORULON (chorionic gonodotropin)</td>
			<td>Merck Animal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3160102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CLS5-25D-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For RNA Probe Generation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3359247910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl Precipitation Solution (7.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fluorescence In Situ Hybridization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GEPA13105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC349610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (Deionized)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC413480050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid, 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ACS125231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 &#956;m pore, 500 mL bottle capacity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis

Spontane intracellulaire calciumactiviteit kan worden waargenomen in een verscheidenheid van celtypes en wordt voorgesteld om een kritische rol te spelen in een verscheidenheid van fysiologische processen. In het bijzonder is passende regulatie van calciumactiviteitspatronen tijdens embryogenese noodzakelijk voor vele aspecten van de neurale ontwikkeling van gewervelde dieren, waaronder een goede neurale buissluiting, synaptogenese en fenotypespecificatie voor neurotransmitters. Hoewel de constatering dat calciumactiviteitspatronen kunnen verschillen in zowel frequentie als amplitude suggereert een dwingend mechanisme waarmee deze fluxen gecodeerde signalen naar downstream-effectoren kunnen overbrengen en genexpressie kunnen reguleren, benaderingen op populatieniveau zijn niet de precisie die nodig is om deze mogelijkheid verder te onderzoeken. Bovendien beperken deze benaderingen studies van de rol van celcelinteracties door het uitsluiten van de mogelijkheid om de toestand van neuronale bepaling te zeggen bij afwezigheid van celcelcontact. Daarom hebben we een experimentele workflow opgezet die time-lapse calciumbeeldvorming van gescheiden neuronale explants koppelt aan een fluorescentie in situ hybridisatietest, waardoor de ondubbelzinnige correlatie van calciumactiviteitspatroon met moleculaire fenotype op een eencellige niveau. We waren met succes in staat om deze aanpak te onderscheiden en te karakteriseren specifieke calcium activiteit patronen geassocieerd met het onderscheiden van neurale cellen en neurale voorlopercellen, respectievelijk; buiten dit, echter, zou het experimentele kader dat in dit artikel wordt beschreven gemakkelijk kunnen worden aangepast om correlaties tussen om het even welke tijd-reeks en uitdrukking van een gen of genen van belang te onderzoeken.

Een succesvol voorbeeld van gescheiden cellen die zijn bereid voor calciumbeeldvorming is te zien in figuur 2A. Cellen zijn dicht verguld, waardoor de maximale hoeveelheid informatie kan worden verzameld van elke afbeelding, maar niet zo dicht verguld dat individuele cellen niet vol vertrouwen kunnen worden onderscheiden vormen elkaar. Fluorescentie wordt gedetecteerd voor elke gedefinieerde cel gedurende de 2 uur imaging periode. Visualisatie van een samengestelde plot met de sporen voor alle cellen die in een experiment zijn opgenomen, onthult in welke mate bulk- of populatiemetingen meer genuanceerde patronen van stekeergedrag kunnen verdoezelen (figuur 2B). Wanneer de geregistreerde profielen van individuele cellen geïsoleerd zijn, kunnen voorbeelden van de onregelmatige stekelige activiteit die kenmerkend is voor neurale voorlopercellen duidelijk worden geïdentificeerd. In tegenstelling tot volwassen neuronen vertonen embryonale neuronale cellen onregelmatige, zeer variabele en complexe aard van calciumactiviteit(figuur 2B). Om deze complexiteit te kwantificeren, zijn verschillende methoden voor gegevensanalyse toegepast17,18, inclusief diverse parameters om een piek te definiëren (figuur 2C).
Succesvolle fluorescentie in situ hybridisatie, met inbegrip van succesvol ontwerp en synthese van een antisense mRNA sonde, kan worden beoordeeld door het vergelijken van de experimentele plaat tegen een achtergrond controle geïncubeerd met een niet-bindende zin RNA controle (Figuur 3A, B). Een positieve sonde controle kan ook worden uitgevoerd door het verwerken van een celtype bekend om het doel mRNA uit te drukken op detecteerbare niveaus.
Identificatie van dezelfde cel voor calcium- en VISbeeldvorming vereist dat cellen ongeveer dezelfde positie behouden tijdens de hybridisatie en verwerking van de sonde. Als platen ruwweg worden behandeld of wasbeurten te krachtig worden uitgevoerd, kunnen cellen van het plaatoppervlak worden losgemaakt en verloren gaan wanneer de oplossing wordt weggegooid of op een andere plaats op de plaat wordt afgezet, waardoor het onmogelijk is om ze over afbeeldingen te matchen(figuur 4A). Als deze verstoring slechts enkele cellen in het gezichtsveld beïnvloedt, kan het nog steeds mogelijk zijn om bepaalde cellen in de afbeelding op te sporen en toe te wijzen (figuur 4B). De maximale hoeveelheid gegevens wordt echter verkregen uit een experiment waarbij FISH zorgvuldig wordt uitgevoerd en er weinig cellen verloren gaan of tussen afbeeldingen worden verplaatst(figuur 4C).
Zodra gegevens zijn verzameld om zowel de calciumactiviteit als de genexpressie van een redelijk aantal cellen in de ontwikkelingsfase(en) van belang te beschrijven, kunnen verdere analyses worden uitgevoerd om correlaties tussen deze twee kenmerken te beoordelen (figuur 1). Een aantal statistieken zijn toegepast om calciumactiviteitspatronen te kwantificeren, waaronder spike counting/frequency, average power, Hurst exponent estimate, en Markovian entropy measurement17,18. Genexpressie kan kwantitatief worden gedefinieerd door absoluut fluorescentieniveau of gesorteerd op een binaire (ja/nee) schaal, afhankelijk van de experimentele vragen die worden aangepakt.
Resultaten van experimenten die calciumactiviteit met de uitdrukking van neurale voorlopergenen samenspannen, toonden talrijke associaties aan tussen specifieke patronen van calciumactiviteit en neurotransmitterfenotypes. In de neurale plaatfase (fase 14) vertonen GABAergic-cellen die de remmende neuronmarker gad1.1 uitdrukken, calciumactiviteit die regelmatiger en hoger is dan die van cellen die geen gad1.1-expressie hebben(figuur 5A). Bovendien, terwijl deze gad1.1-uitdrukkende cellen worden geassocieerd met hogere niveaus van hoge amplitude stekerij, lage amplitude spiking komt vaker voor in glutamatere erecellen uitdrukken van de excitatory neuron marker slc17a7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg"> Figuur 1: Schematisch van experimentele workflow. Schaalbalk = 100 μm. Beelden in panelen 3-5 zijn genomen uit Paudel et al. (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg"> Figuur 2: Calciumbeeldvorming en voorbeeldactiviteitsprofielen. (A) Intracellulaire calciumactiviteit zoals gerapporteerd door Fluo4-AM. Elke 2 uur beeld bestaat uit 901 frames, met een representatief frame hier laten zien. (B) Samengestelde plot van fluorescentieintensiteit in de tijd in alle cellen binnen het beeldveld. De sporen geven duidelijk aan op het fotobleken van indicatorkleurstof (Fluo4) overwerk. Raster plot linksboven toont representatieve sporen van calcium activiteit na toepassing van een de-trending algoritme ontwikkeld door Eilers en Boelen19, waar cellen hier getoond vertonen divers patroon van stekerij gedrag. (C) Toepassing van verschillende drempels (150% en 200% van de basislijn, waarbij de basislijn het gemiddelde is van onttrendte fluorescerende intensiteit) om een piek (groene en blauwe pijlen) te definiëren. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg"> Figuur 3: FISH imaging. (A) FISH uitgevoerd met een niet-bindende zin RNA sonde als een negatieve controle. Beeldvormende instellingen zijn aangepast zodat er geen cellen fluorescerend lijken. Sommige gezichtsvelden kunnen niet-celvuil met enige fluorescentie bevatten, zoals te zien in de rechterbovenhoek en rechterbenedenhoek van (A); deze kunnen worden genegeerd met het oog op achtergrondinstelling. (B) Dezelfde beeldvormingsinstellingen worden vervolgens gebruikt om een experimentele plaat (antisense RNA-sonde) in beeld te brengen. Fluorescentie onder deze omstandigheden komt overeen met genexpressie boven de achtergrond. Schaalbalk = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg"> Figuur 4: Afbeeldingsoverlay en coregistratie. Schematische weergaven van een monster dat wordt weergegeven voor calciumactiviteit (cellen die worden vertegenwoordigd door gevulde groene cirkels) en na FISH (cellen die worden vertegenwoordigd door schaduwrijke rode cirkels). (A) Cellen die aanzienlijk zijn verplaatst tijdens het verwerken en verwerken van monsters, kunnen niet betrouwbaar worden geïdentificeerd in de twee afbeeldingen. (B)Celverstoring kan slechts enkele cellen in het gezichtsveld beïnvloeden. Sommige cellen kunnen duidelijk worden geïdentificeerd in beide beelden, terwijl anderen niet vol vertrouwen kunnen worden geëvenaard. (C) Als monsters zorgvuldig worden behandeld, blijven de meeste cellen ongestoord en kunnen ze in beide afbeeldingen worden geïdentificeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg"> Figuur 5: Een voorbeeld van toepassing van deze methode, boxplots met associaties tussen calciumactiviteit en genexpressie (GABA en Glut voor genen gad1.1 en slc17a7 respectievelijk) in neurale plaatstadium Xenopus laevis. In fase 14 vertonen gad1.1-postive cells (GABA) een hogere amplitude en regelmatigere calciumactiviteit zoals gedefinieerd door (A) Markovian entropie18 en (B) piektellingen met behulp van drempels 125%, 150%, 200% en 300% van het gemiddelde van de gedetrendeerde fluorescerende intensiteit (baseline)17 dan slc17a7 positieve cellen (Glut). Sterren wijzen op statistisch significante verschillen volgens zowel bonferroni-gecorrigeerde twee-steekproef Kolmogorov-Smirnov Test (p < 0,05) en Cohen's d statistieken voor effectgrootte (n = 5 culturen en >100 cellen; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). Het cijfer werd hertekend en aangepast aan de gegevensset van Paudel et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We presenteren een tweedelige protocol dat fluorescerende calciumbeeldvorming combineert met in situ hybridisatie, waardoor de experimentator patronen van calciumactiviteit kan correleren met genexpressieprofielen op een eencellend niveau.

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Dit protocol kan worden gebruikt om calciumactiviteitspatronen te correleren met genexpressie op het niveau van één cel dat onderzoekers in staat stelt nieuwe vragen over de relaties tussen deze twee kenmerken te onderzoeken. In tegenstelling tot eerdere benaderingen, die doorgaans hele weefsels bestuderen, zoomt onze techniek in op het eencellige niveau, waardoor we celautonoome relaties tussen calciumactiviteit en genexpressie kunnen beoordelen. Begin met UV steriliseren twee 35 millimeter plastic petrischaaltjes en een 35 millimeter cel kweekschotel voor ongeveer 30 minuten.Werken in de laminaire stroom kap, voeg 10 milliliter van twee millimolar calcium oplossing om elk van twee 50 milliliter plastic conische buizen, een UV-gesteriliseerde petrischaal, en de UV-gesteriliseerde cel cultuur schotel. Voeg twee milliliter calcium- en magnesiumvrije oplossing toe aan de andere UV-gesteriliseerde petrischaal en vul twee 100 millimeter plastic petrischaaltjes en een 35 millimeter plastic petrischaaltje met 0,1X MMR aangevuld met gentamicine. Vul vervolgens een 60 millimeter plastic petrischaaltje met 70% ethanol.Meng vlak voor de dissectie 0,01 gram collageen B grondig tot één buis calciumoplossing. Voeg de oplossing toe aan een nieuwe 60 millimeter plastic petrischaal en gebruik een ontledende microscoop om embryo's van de gewenste ontwikkelingsfase te identificeren. Gebruik een steriele overdracht pipet om ten minste zes geschikte embryo's te verplaatsen in een 100 millimeter plaat met MMR plus gentamicine.Beweeg vervolgens een embryo van de houdplaat in de tweede 100 millimeter plaat van MMR plus gentamicine en plaats deze dissectieplaat onder de microscoop. Met behulp van een paar stompe tangen om het embryo te stabiliseren, pel voorzichtig het vitelline membraan rond het embryo met een paar fijne tangen. Wanneer alle van het membraan is verwijderd, gebruik maken van de fijne tangen om het embryo knijpen langs de voorste achterste as om de rug en ventrale gebieden te scheiden.Gebruik de nieuwe steriele overdrachtpipet om het dorsale gedeelte gedurende één tot twee minuten over te brengen op de 60 millimeter plaat van collageenoplossing voordat u het monster voorzichtig terugzet naar de dissectieplaat. Om de dissectie te voltooien, verwijder voorzichtig alle resterende endodermale en mesodermale verontreiniging van het vermoedelijke neurale weefsel van het ectoderm en breng voorzichtig de explant over naar de 35 millimeter plaat van calciumoplossing. Wanneer er nog drie explants zijn verzameld, gebruikt u een P1000 micropipet om alle vier de explants over te brengen naar de 35 millimeter plaat van calcium- en magnesiumvrije oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat elk contact tussen de excentrales en de luchtwaterinterface wordt vermeden.Dan voorzichtig wervelen de schotel, zodat alle explants cluster in het midden van de plaat en de monsters incuren gedurende een uur bij kamertemperatuur om de weefsels te scheiden. Breng tijdens deze incubatie de laatste twee embryo's over naar het tweede gerecht van MMR met gentamicine en bedek de schotel zodat deze exemplaren zich ongestoord kunnen ontwikkelen. Gebruik aan het einde van de incubatie superlijm om een micro-geregeerde coverslip aan de onderkant van de 35 millimeter celkweekschotel te bevestigen en gebruik een P100 micropipet om de gescheiden explants te verzamelen.Houd de pipet in een ondiepe hoek dicht bij het oppervlak van de celkweekschotel, plaats de pipetpunt in de hoek van het raster naar binnen gericht en verdrijst de celopening stevig over het gerasterde gebied. Idealiter zullen de cellen zich vestigen in een strakke, dichte cluster. Laat de cellen zich een uur aan de plaat hechten bij kamertemperatuur.Terwijl de cellen zich vestigen, bepalen en registreren van de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo's. Verplaats de monsterschotel aan het einde van de incubatie naar een licht beschermde locatie en 100 microliter oplossing vanaf de rand van de schotel. Meng deze oplossing met zeven microliters van een vers bereide Fluo-4 AM Pluronic F127 zuuroplossing met op en neer pipetting voordat u het volledige volume teruggeeft aan de monsterschotel.Draai voorzichtig om de plaat te mengen en te bedekken met aluminiumfolie. Na een uur bij kamertemperatuur, vervang een milliliter van de explant cultuur schotel supernatant met drie milliliter verse twee millimolar van calcium oplossing. Vervang dan nog twee milliliter supernatant door drie milliliter verse calciumoplossing.Voor de beeldvorming van calciumactiviteit in de explants plaatst u de monsterplaat op het stadium van een omgekeerde confocale microscoop die beschermd is tegen blootstelling aan omgevingslicht en gebruikt u een markering om het voorste punt van de plaat te labelen, zodat hetzelfde gezichtsveld bij volgende beeldvormingssessies kan worden gevonden. Gebruik de 10 en 20 keer doelstellingen om een monster te lokaliseren onder de microscoop en selecteer een geschikt gezichtsveld dat is cel dicht, maar niet zo dicht dat de cellen zijn samengeklonterd of moeilijk individueel te onderscheiden. Pas de focus van de microscoop zo aan dat de rasterregelbare coverslip zichtbaar is, waarbij het oorspronkelijke gezichtsveld wordt gewijzigd totdat een identificeerbaar getal indien nodig in beeld is.Een helder veldafbeelding van het geselecteerde gezichtsveld verkrijgen met de met rasters voor het rechter overheerste coverslip in focus en een helder veldafbeelding van het geselecteerde gezichtsveld met de cellen in focus. Zonder een duidelijk beeld van de rasterded coverslip en het gezichtsveld, zult u niet in staat zijn om mede-registreren van uw cellen met die in de vis beelden die u later zult genereren. Verlicht vervolgens de monsters met een laser van 488 nanometer.Wijzig voor een afbeelding van twee uur de beeldconfiguratie om 901 frames op te nemen met een scantijd van 3,93 seconden in een interval van acht seconden voordat de configuratie wordt uitgevoerd om de afbeelding te verkrijgen. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijder de plaat uit de microscoop fase en vervang de cultuur supernatant met een milliliter van 1X MEMFA voor een twee uur durende incubatie bij kamertemperatuur het verzorgen van de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo's aan het begin van de incubatie te registreren. De visualisatie van een samengesteld plot met sporen voor alle cellen die in een experiment zijn opgenomen, onthult de mate waarin bulk- of bevolkingsmetingen meer genuanceerde patronen van stekelgedrag kunnen verdoezelen.Wanneer de geregistreerde profielen van individuele cel geïsoleerd zijn, kunnen voorbeelden van de onregelmatige stekelactiviteit die kenmerkend is voor neurale voorlopercellen duidelijk worden geïdentificeerd. Om deze complexiteit te kwantificeren, kunnen verschillende gegevensanalysemethoden worden toegepast, waaronder diverse parameters om een piek te definiëren. Als de platen ruwweg worden behandeld of de wasbeurten te krachtig worden uitgevoerd tijdens fluorescerende in situ hybridisatie, kunnen de cellen van de plaatoppervlakken worden losgemaakt, waardoor het onmogelijk is om de cellen over afbeeldingen te matchen.Als deze verstoring slechts enkele cellen in het gezichtsveld beïnvloedt, kan het nog steeds mogelijk zijn om een aantal cellen in de afbeelding te detecteren en toe te wijzen. De maximale hoeveelheid gegevens wordt echter verkregen uit een experiment waarbij de hybridisatie zorgvuldig wordt uitgevoerd en er weinig cellen verloren gaan of tussen afbeeldingen worden verplaatst. Resultaten van experimenten die calciumactiviteit verzamelen met de expressie van neurale voorlopermarkergenen kunnen talrijke associaties onthullen tussen specifieke patronen van calciumactiviteit en neurozenderfenotypen.Met deze gegevens kunnen onderzoekers complexere kenmerken van deze dynamische calciumpatronen en de relaties met genexpressie onderzoeken in plaats van beperkt te zijn tot eenvoudige piektelling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Een optogenetische Aanpak voor het beoordelen van de vorming van neuronale verbindingen in een co-cultuur systeem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulatie en<em&gt; In Vitro</em&gt; Rijping van<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eicellen, Gevolgd door intracytoplasmatische sperma-injectie, om embryonale ontwikkeling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Micro-injectie techniek om Target aan de ontwikkelingslanden<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Beeldvorming Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bij Egg Activering

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...