Name: fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Wir danken Wendy Herbst und Lindsay Schleifer für ihren Beitrag zur Entwicklung dieser Protokolle. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 und 1R15HD096415-01) an MSS unterstützt.

<ol>
	<li>Humeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+cell+cycle:+Progression+or+death.">Calcium signaling and cell cycle: Progression or death.</a> Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).</li><li>Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+toolkit+reveals+the+role+of+Ca2++sparklets+in+coordinated+cell+migration.">Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration.</a> PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).</li><li>Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+death:+the+calcium-apoptosis+link.">Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).</li><li>Pham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++and+Mg2++module+conformational+dynamics+and+stability+of+downstream+regulatory+element+antagonist+modulator.">Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator.</a> Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).</li><li>Smedler, E., Uhl&#233;n, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+decoding+of+calcium+oscillations.">Frequency decoding of calcium oscillations.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).</li><li>Moreau, M., N&#233;ant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+coding+and+decoding+strategies+for+the+specification+of+neural+and+renal+precursor+cells+during+development.">Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development.</a> Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).</li><li>Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+functions+as+a+working+memory+of+Ca2++signals+in+decoding+Ca2++oscillation.">NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation.</a> EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).</li><li>Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Control+of+Calcium+Oscillation+Waveform+Defines+NFAT+as+an+Integrator+of+Calcium+Load.">Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load.</a> Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).</li><li>Li, L., Stefan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Le+Nov&#232;re+N.+Calcium+input+frequency,+duration+and+amplitude+differentially+module+the+relative+activation+of+calcineurin+and+CaMKII.">Le Nov&#232;re N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII.</a> PLoS One. 7 (9), 43810 (2012).</li><li>Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+tuning:+Competition's+role+in+setting+the+frequency-dependence+of+Ca2+-dependent+proteins.">Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins.</a> PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820 (2017).</li><li>Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Tuning+Among+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Proteins:+Analysis+of+in+silico+Model+Robustness+and+Parameter+Variability.">Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).</li><li>Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+neuronal+calcium+spikes+during+early+differentiation.">Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).</li><li>Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+homeostatic+specification+of+transmitter+expression+in+embryonic+neurons.">Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons.</a> Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).</li><li>Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+Global+Spontaneous+Calcium+Events+Regulate+Neurite+Outgrowth+and+Onset+of+GABAergic+Phenotype+during+Neural+Precursor+Differentiation.">Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).</li><li>Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Waves+Propagate+through+Radial+Glial+Cells+and+Modulate+Proliferation+in+the+Developing+Neocortex.">Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).</li><li>Nieuewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).</li><li>Paudel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Activity+Dynamics+Correlate+with+Neuronal+Phenotype+at+a+Single+Cell+Level+and+in+a+Threshold-Dependent+Manner.">Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880 (2019).</li><li>Marken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Markovian+Entropy+Measure+for+the+Analysis+of+Calcium+Activity+Time+Series.">A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series.</a> PLoS One. 11 (12), 0168342 (2016).</li><li>Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+Correction+with+Asymmetric+Least+Squares+Smoothing.">Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing.</a> Leiden University Medical Centre Report. , (2005).</li><li>Guemez-Gamboa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell-autonomous+mechanism+of+activity-dependent+neurotransmitter+switching.">Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching.</a> Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).</li><li>Paredes, R., Madelaine, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li></ol>

Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.

Charakteristische Muster der Kalziumaktivität wurden in den Zellen beobachtet, aus denen das sich entwickelnde Nervensystem besteht, wobei bestimmte Arten von Aktivität mit unterschiedlichen neuroentwicklungsbedingten Prozessen verbunden sind. Ein besseres Verständnis der Mechanismen, mit denen diese informationsdichten Aktivitätsmuster in transkriptionelle Reaktionen übersetzt werden, erfordert jedoch, dass Informationen über die Kalziumaktivität und die Genexpression mit einzelliger Auflösung gesammelt werden. Während Systeme, die eine stereotypere Kalziumaktivität aufweisen, wie reife Neuronen, auf einer Massenebene vernünftigerweise untersucht werden können, werden die unregelmäßigen Muster, die das embryonale Nervensystem charakterisieren, leicht durch weniger präzise Aufnahmen maskiert.
Der in diesem Protokoll festgelegte experimentelle Rahmen kann leicht an eine Vielzahl von Zelltypen und fluoreszierenden Reportern angepasst werden. Gewebe, das praktisch jeden Zelltyp oder jede Kombination von Zelltypen enthält, kann aus einem Modellorganismus von Interesse seziert und für die einzellige Bildgebung plattiert werden. Neben der Zellidentifikation und der Isolierung der Wirkung zellautonomer Prozesse ermöglicht ein Primärzellkulturansatz dem Experimentator, Medienkomponenten nach Belieben zu definieren. Zum Beispiel wurden Experimente durchgeführt, die die Aktivität neuronaler Vorläufer in einer 2 mM Ca2+-Lösung verglichen, um zu untersuchen, ob die Beziehungen zwischen Spikefrequenz und Neurotransmitter-Phänotyp im embryonalen Rückenmark ohne den Einfluss von Zell-Zell-Wechselwirkungen rekapituliert werden können13,20.
Während dieses Protokoll den Fluoreszenzmarker Fluo4-AM nutzt, um intrazelluläre Kalziumaktivität zu erkennen, können Benutzer je nach Selektionskriterien andere kommerziell erhältliche Marker21wählen, einschließlich genetisch kodierter Calciumindikatoren. In ähnlicher Weise könnten alternative Marker verwendet werden, um dynamische Veränderungen der Konzentration eines Ionen von Interesse (einschließlich K+, Na+und Zn2+),Membranpotenzial oder zellulären pH-Wert zu überwachen. Bildeinstellungen und Bilddauer können bei Bedarf geändert werden.
Obwohl wir Kalziumaktivität und neuronalen Phänotyp als spezifische Anwendung korrelierten, ist diese Methode auch für eine Vielzahl anderer zellulärer Eigenschaften anwendbar. Beispielsweise kann die Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Sonden gegen jedes Gen von Interesse durchgeführt werden, einschließlich des neuronalen Markers ChAT oder des Transkriptionsfaktors Engrailed, was den empfindlichen Nachweis eines anpassbaren Panels von mRNA-Arten ermöglicht. Diese Sonden können isoformspezifisch konzipiert werden und unterstützen auf Wunsch zusätzliche Zielspezifität. Double FISH kann mit Sonden durchgeführt werden, die zu mehreren zwei verschiedenen Fluorophoren konjugiert sind, was die gleichzeitige Beurteilung der Expression mehrerer Gene ermöglicht. Die zusätzlichen Washes, die für diese Art von Experiment erforderlich sind, sind jedoch mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit von Zellverlust oder -bewegung verbunden und erfordern Erfahrung und Delikatesse, um erfolgreich durchgeführt zu werden.
Ungeachtet aller experimentierfreudigen Änderungen an diesem Protokoll gibt es mehrere wichtige Schritte, die sorgfältige Aufmerksamkeit erfordern. Die Zerlegungen sollten mit Vorsicht durchgeführt werden, um alle kontaminierenden Gewebe oder Zellpopulationen zu entfernen; Da die räumliche Musterung verloren geht, wenn die Explanten getrennt werden, werden alle verbleibenden Zellen aus benachbarten Geweben mit den von Interesse interessierten Zellen durchsetzt und nicht von ihnen unterschieden. Nach der Plattiertwerden der Zellen sollten Proben so schonend wie möglich behandelt werden, um zu verhindern, dass Zellen sich entfernen. Am wichtigsten ist, dass dies bedeutet, dass alle Lösungsänderungen langsam und sorgfältig durchgeführt werden sollten, wobei die Pipette am Rand der Platte platziert wird, wenn die Lösung entfernt und hinzugefügt wird. Dadurch wird sichergestellt, dass Zellen sowohl in Kalzium- als auch in FISH-Bildern zuverlässig identifiziert werden können. Wenn Zellen während der Verarbeitung gestört werden, kann es unmöglich sein, einige oder alle der entsprechenden Zellen zwischen den beiden Bildern zu identifizieren. Wir raten bei diesen Zuordnungen zu einer Vorsicht, so dass für die weitere Analyse nur eindeutig entsprechende Zellen verwendet werden.
Je nach der angesprochenen biologischen Frage können verschiedene Analyseansätze angebracht sein. Die Calciumaktivität von Zeitreihen kann auf verschiedene Weise verarbeitet und quantifiziert werden, wobei die Experimentierflexibilität bei der Auswahl von De-Trending-Parametern, Analysemetriken und Analyseparametern (z. B. der % des Basisschwellenwerts, der zur Definition einer Kalziumspitze verwendet wird) verwendet wird. Korrelationen zwischen Dercalciumaktivität und dem Grad der Genexpression können durch die Analyse der Genexpression als absoluter oder relativer Fluoreszenzwert aus dem FISH-Bild gezogen werden. Alternativ können Korrelationen zwischen Kalziumaktivität und Genexpression (Präsenz/Abwesenheit) gezogen werden, indem ein Fluoreszenzschwellenwert für das positive Genexpressionssignal definiert und einzelnen Zellen "Ja"- oder "Nein"-Identifikatoren zugewiesen werden. Insgesamt bietet dieses experimentelle Schema eine unglaublich flexible Pipeline für die Erfassung und vorläufige Analyse von Zeitreihendaten in Verbindung mit zellübereinstimmenden Genexpressionsdaten. Solche Experimente werden entscheidend für ein besseres Verständnis der komplexen Beziehungen zwischen zellulärer Dynamik und transkriptionellen Veränderungen sein, wie die Identifizierung von Kalziumaktivitätsmustern zeigt, die für hemmend-fette und exzitatorisch fette neuronale Vorläufer in embryonalen Xenopus laevischarakteristisch sind.

Freies zytosolisches Kalzium ist entscheidend für eine Vielzahl von biologischen Prozessen, von Zellproliferation und Migration bis hin zu Apoptose und Autophagie1,2,3. Innerhalb dieser Bahnen kann Kalzium nachgelagerte Auswirkungen auf die Genexpression ausüben, indem es mit Calcium-bindenden Domänen interagiert, um konformationale Veränderungen zu induzieren, die die Proteinaktivität und -wechselwirkungen modulieren. Zum Beispiel wird ein neuronaler Kalziumsensor, der als Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) bekannt ist, in einer entfalteten Zwischenkonformation gehalten, wenn er durch Kalzium gebunden wird, wodurch er daran gehindert wird, mit seinem Protein und seinenDNA-Zielen4 zu interagieren. Abgesehen davon, dass sie als einfaches Signalmolekül dienen, ermöglicht die dynamische Natur intrazellulärer Calciumtransienten diesen Aktivitätsmustern jedoch, komplexere Amplituden- oder frequenzbasierte Signale5,6zu kodieren. Die kernnukleare Translokation des Transkriptionsfaktors Kernfaktor aktivierter T-Zellen (NFAT) wird durch hochfrequente Calciumschwingungen verstärkt, aber durch niederfrequente Schwingungen gehemmt7. Die jüngsten Arbeiten deuten darauf hin, dass NFAT tatsächlich auf die kumulative Kalziumexposition reagieren könnte8. Sowohl Calcineurin als auch Ca2+/calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) weisen auch unterschiedliche Reaktionen auf Kalziumtransienten einer bestimmten Häufigkeit, Dauer oder Amplitude9auf. Um eine zusätzliche Ebene der regulatorischen Komplexität zu erhöhen, deuten Rechenmodelle darauf hin, dass viele nachgeschaltete Calcium-bindende Proteine mehr oder weniger frequenzabhängig werden, als Reaktion auf das Vorhandensein oder Fehlen verbindlicher Wettbewerber10,11.
Innerhalb des sich entwickelnden Nervensystems wurden zwei Hauptklassen von Calciumaktivitätsverhalten definiert und mit spezifischen biologischen Prozessen in Verbindung gebracht. Kalziumzuflüsse werden als "Spikes" klassifiziert, wenn sie innerhalb einzelner Zellen auftreten, innerhalb von fünf Sekunden eine Spitzenintensität von 400 % der Ausgangswerte erreichen und einen doppelten exponentiellen Zerfall aufweisen12. Diese Art von Signal ist in erster Linie mit Neurotransmitter Phänotyp Spezifikation13verbunden. Im Gegensatz dazu werden "Wellen" als langsamere, weniger extreme Kalziumtransienten definiert, bei denen die intrazelluläre Kalziumkonzentration einer Zelle über einen Zeitraum von dreißig Sekunden oder mehr auf 200 % der Ausgangsbasis ansteigt und dann über mehrere Minuten12zerfällt. Diese Signale verbreiten sich oft über mehrere benachbarte Zellen, und ihre Anwesenheit wurde mit Neuritenwachstum und Zellproliferation14,15in Verbindung gebracht. Obwohl diese beiden Klassen auf der Grundlage charakteristischer kinetischer Profile definiert wurden, bleibt unklar, welche Merkmale dieser Muster tatsächlich von Zellen erkannt und von nachgeschalteten Effektoren übersetzt werden.
Das Verständnis des Zusammenhangs zwischen intrazellulären Kalziumoszillationen und Genexpression würde einen entscheidenden Einblick in einen der Regulierungsmechanismen geben, der eine angemessene Entwicklung und Musterung des Nervensystems sicherstellt. Zu diesem Zweck haben Studien des embryonalen Rückenmarks gezeigt, dass erhöhte Calcium-Spike-Aktivität während der Entwicklung mit höheren Konzentrationen von hemmenden Neuronen verbunden ist, während verminderte Calcium-Spike-Aktivität mit höheren Konzentrationen von erregenden Neuronen verbunden ist13. Diese Assays auf Populationsebene wurden jedoch nicht verwendet, um Kalziumaktivität mit Genexpression auf einer Einzelzellebene zu assoziieren.
Die Annäherung an diese Fragen auf der Ebene der Einzelzelle bietet mehrere deutliche Vorteile gegenüber früheren Arbeiten. Zum einen ermöglicht die Fähigkeit, die Kalziumaktivität und genexpression in vielen Zellen einzeln zu beurteilen, das gesamte Repertoire unterschiedlicher Aktivitätsmuster zu beobachten, ohne durch eine Massenmessung verschleiert zu werden. Darüber hinaus bedeutet das Studium dieser Beziehungen in der einzelzelligen Primärkultur, dass zellautonome Verbindungen zwischen Kalziumaktivität und Genexpression beibehalten werden, während Wechselwirkungen, die eine Zell-Zell-Kommunikation erfordern, aufgehoben werden. Daher ermöglicht dieser Ansatz, diese zellautonomen Mechanismen isoliert zu untersuchen. Es ermöglicht jedoch auch, die Rolle der nicht-zellautonomen Kalziumaktivität aufzuklären und zu verhören. Beispielsweise können Zellen im Stadium der neuralen Platte von einem Embryo seziert, kultiviert werden, bis die Geschwistersteuerung das Neuronröhrenstadium erreicht, und dann mit Zellen verglichen werden, die frisch aus einem Neuronröhren-Stadium-Embryo seziert wurden. Dies ermöglicht einen direkten Vergleich von Zellen, die die Zell-Zell-Kommunikation über einen wichtigen Entwicklungszeitraum hinweg beibehalten, mit denen die Zell-Zell-Kommunikation abgeschafft wurde.
Um die Grenzen früherer experimenteller Ansätze anzugehen, entwickelten wir ein Protokoll, das die Beurteilung sowohl der Kalziumaktivität als auch der Genexpression in einzelnen neuronalen Vorläuferzellen ermöglicht und die Korrelation spezifischer Aktivitätsmuster mit nachfolgenden Differenzierungsprogrammen erleichtert. Neuralgewebe wurde von Xenopus laevis in verschiedenen Stadien der neuronalen Entwicklung seziert, in einzelne Zellen dissoziiert und mittels konfokaler Mikroskopie in Gegenwart eines fluoreszierenden Kalziumindikators abgebildet. Nach der Live-Zell-Bildgebung wurden Proben fixiert und mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) untersucht, um die Expression eines Gens oder einer Isoform von Interesse zu erkennen. Wichtig ist, dass einzelne Zellen in beiden bildgebenden Experimenten nachverfolgt werden können, was bedeutet, dass das Calciumaktivitätsprofil einer Zelle und ihr Genexpressionsniveau miteinander assoziiert werden können (Abbildung 1). Das hier vorgestellte Protokoll soll Die Beziehungen zwischen Kalziumaktivitätsmustern und Genexpression über die embryonale Neuroentwicklung in Xenopus laevisuntersuchen. Der breitere experimentelle Rahmen (Einzelzell-Zeit-Kurs-Bildgebung, gefolgt von FISH und Bild-Coregistration) kann jedoch modifiziert und auf praktisch jeden Zelltyp, fluoreszierenden Reporter und Gen von Interesse angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Animal Husbandry &#38; Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHORULON (chorionic gonodotropin)</td>
			<td>Merck Animal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3160102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CLS5-25D-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For RNA Probe Generation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3359247910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl Precipitation Solution (7.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fluorescence In Situ Hybridization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GEPA13105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC349610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (Deionized)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC413480050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid, 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ACS125231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 &#956;m pore, 500 mL bottle capacity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis

Spontane intrazelluläre Kalziumaktivität kann in einer Vielzahl von Zelltypen beobachtet werden und wird vorgeschlagen, kritische Rollen in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen zu spielen. Insbesondere ist eine angemessene Regulierung der Kalziumaktivitätsmuster während der Embryogenese für viele Aspekte der neuronalen Entwicklung von Wirbeltieren erforderlich, einschließlich des richtigen Neuralrohrverschlusses, der Synaptogenese und der Phänotypspezifikation des Neurotransmitters. Während die Beobachtung, dass sich Kalziumaktivitätsmuster sowohl in Derfrequenz als auch in Amplitude unterscheiden können, einen zwingenden Mechanismus nahelegt, mit dem diese Flussmittel kodierte Signale an nachgeschaltete Effektoren übertragen und die Genexpression regulieren könnten, Ansätze auf Bevölkerungsebene haben nicht die nötige Präzision, um diese Möglichkeit weiter zu erkunden. Darüber hinaus begrenzen diese Ansätze Studien über die Rolle von Zell-Zell-Wechselwirkungen, indem sie die Fähigkeit ausschließt, den Zustand der neuronalen Bestimmung in Abwesenheit von Zell-Zell-Kontakt zu untersuchen. Daher haben wir einen experimentellen Workflow etabliert, der die Zeitraffer-Calcium-Bildgebung dissoziierter neuronaler Explanten mit einem Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungstest kombiniert, der die eindeutige Korrelation von Calciumaktivitätsmuster mit molekularen Phänotyp auf einzelzelligem Niveau. Wir konnten diesen Ansatz erfolgreich nutzen, um spezifische Calciumaktivitätsmuster zu unterscheiden und zu charakterisieren, die mit der Differenzierung von Nervenzellen bzw. neuronalen Vorläuferzellen verbunden sind; Darüber hinaus könnte jedoch der in diesem Artikel beschriebene experimentelle Rahmen leicht angepasst werden, um Korrelationen zwischen jedem Zeitreihenaktivitätsprofil und der Expression eines Gens oder Gens von Interesse zu untersuchen.

Ein erfolgreiches Beispiel für dissoziierte Zellen, die für die Kalzium-Bildgebung vorbereitet wurden, ist in Abbildung 2A zusehen. Die Zellen sind dicht plattiert, so dass die maximale Menge an Informationen aus jedem Bild gesammelt werden kann, aber nicht so dicht plattiert ist, dass einzelne Zellen nicht sicher voneinander unterschieden werden können. Fluoreszenz wird für jede definierte Zelle während des 2-h-Bildgebungszeitraums nachgewiesen. Die Visualisierung eines zusammengesetzten Diagramms, das die Spuren für alle in einem Experiment aufgezeichneten Zellen enthält, zeigt, inwieweit Massen- oder Populationsmessungen differenziertere Muster des Spaltverhaltens verschleiern können (Abbildung 2B). Wenn die aufgezeichneten Profile einzelner Zellen isoliert werden, können Beispiele für die unregelmäßige Spiking-Aktivität, die für neuronale Vorläuferzellen charakteristisch ist, eindeutig identifiziert werden. Im Gegensatz zu reifen Neuronen weisen embryonale neuronale Zellen eine unregelmäßige, hochvariable und komplexe Natur der Kalziumaktivität auf (Abbildung 2B). Um diese Komplexität zu quantifizieren, wurden die Anwendung verschiedener Datenanalysemethodenangewendet 17,18, einschließlich verschiedener Parameter, um eine Spitze zu definieren ( Abbildung2C).
Eine erfolgreiche Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, einschließlich erfolgreicher Konstruktion und Synthese einer Antisense-mRNA-Sonde, kann durch den Vergleich der Versuchsplatte mit einer Hintergrundkontrolle, die mit einer unverbindlichen Sinn-RNA-Kontrolle inkubiert wird, bewertet werden (Abbildung 3A,B). Eine positive Sondenkontrolle kann auch durch Verarbeitung eines Zelltyps durchgeführt werden, von dem bekannt ist, dass er die Ziel-mRNA auf nachweisbaren Ebenen ausdrückt.
Die Identifizierung derselben Zelle über die Kalzium- und FISH-Bildgebung erfordert, dass die Zellen während der Sondenhybridisierung und -verarbeitung in etwa die gleiche Position behalten. Wenn Platten grob behandelt werden oder Washes zu kräftig ausgeführt werden, können Zellen von der Plattenoberfläche entfernt werden und entweder verloren gehen, wenn die Lösung verworfen oder an einer anderen Stelle auf der Platte abgelagert wird, so dass es unmöglich ist, sie bildübergreifend abzugleichen (Abbildung 4A). Wenn diese Unterbrechung nur einige der Zellen im Sichtfeld betrifft, kann es dennoch möglich sein, einige Zellen innerhalb des Bildes zu erkennen und zuzuweisen (Abbildung 4B). Die maximale Datenmenge wird jedoch aus einem Experiment gewonnen, bei dem FISH sorgfältig durchgeführt wird und nur wenige Zellen zwischen Bildern verloren gehen oder neu positioniert werden (Abbildung 4C).
Sobald Daten gesammelt wurden, um sowohl die Kalziumaktivität als auch die Genexpression einer angemessenen Anzahl von Zellen in der Entwicklungsphase(n) von Interesse zu beschreiben, können weitere Analysen durchgeführt werden, um Korrelationen zwischen diesen beiden Merkmalen zu bewerten (Abbildung 1). Eine Reihe von Metriken wurden angewendet, um Kalziumaktivitätsmuster zu quantifizieren, einschließlich Spike-Zählung/Frequenz, Durchschnittsleistung, Hurst-Exponentenschätzung und Markovian-Entropiemessung17,18. Die Genexpression kann quantitativ durch absolute Fluoreszenz definiert oder auf einer binären (Ja/Nein) Skala abgestuft werden, abhängig von den angesprochenen experimentellen Fragen.
Die Ergebnisse von Experimenten, die die Kalziumaktivität mit der Expression neuronaler Vorläufermarkergene zusammenfassten, zeigten zahlreiche Assoziationen zwischen spezifischen Mustern der Kalziumaktivität und Neurotransmitter-Phänotypen. Im Stadium der neuralen Platte (Stufe 14) weisen GABAerge Zellen, die den hemmenden Neuronenmarker gad1.1 exemittieren, eine regelmäßigere und höhere Amplitude auf als Zellen, die keine Gad1.1-Expression aufweisen (Abbildung 5A). Während diese gad1.1-exemittierendenZellen mit höheren Konzentrationen von Hochamplituden-Spiking assoziiert sind, ist das Spiking mit niedriger Amplitude häufiger in glutamatergen Zellen, die den exzitatorischen Neuronenmarker slc17a7exeklaten.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg"> Abbildung 1: Schematic des experimentellen Workflows. Skalenbalken = 100 m. Die Bilder in den Tafeln 3-5 stammen von Paudel et al. (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg"> Abbildung 2: Calcium-Bildgebung und Beispielaktivitätsprofile. (A) Intrazelluläre Calciumaktivität, wie von Fluo4-AM berichtet. Jedes 2-H-Bild besteht aus 901 Bildern, mit einer repräsentativen Rahmenshow hier. (B) Zusammengesetztes Diagramm der Fluoreszenzintensität im Laufe der Zeit in allen Zellen innerhalb des abgebildeten Sichtfeldes. Die Spuren deuten deutlich auf photobleaching von Indikatorfarbstoff (Fluo4) Überstunden. Raster-Plot oben links zeigt repräsentative Spuren der Kalziumaktivität nach Anwendung eines De-Trending-Algorithmus von Eilers und Boelen19entwickelt , wo Zellen hier gezeigt zeigen unterschiedliche Muster der Spiking-Verhalten. (C) Anwendung verschiedener Schwellenwerte (150 % und 200 % des Ausgangswerts, wobei die Basislinie der Durchschnitt der de-trendierten Fluoreszenzintensität ist), um eine Spitze (grüne und blaue Pfeile) zu definieren. Skalenbalken = 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg"> Abbildung 3: FISH-Bildgebung. (A) FISH wurde mit einer unverbindlichen Sense-RNA-Sonde als Negativkontrolle durchgeführt. Die Bildeinstellungen wurden so angepasst, dass keine Zellen fluoreszierend erscheinen. Einige Sichtfelder können nichtzellige Trümmer mit einer bestimmten Fluoreszenz enthalten, wie sie in der oberen rechten und unteren rechten Ecke von (A) zu sehen sind. Diese können aus Gründen der Hintergrundeinstellung ignoriert werden. (B) Die gleichen bildgebenden Einstellungen werden dann verwendet, um eine experimentelle Platte (Antisense-RNA-Sonde) abzubilden. Fluoreszenz unter diesen Bedingungen entspricht der Genexpression über dem Hintergrund. Skalenbalken = 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg"> Abbildung 4: Bild-Overlay und Co-Registrierung. Schematische Darstellungen einer Probe, die für die Kalziumaktivität (Zellen dargestellt durch gefüllte grüne Kreise) und nach FISH (Zellen, die durch schattierte rote Kreise dargestellt werden) abgebildet sind. (A) Zellen, die sich während der Probenhandhabung und -verarbeitung erheblich bewegt haben, können in den beiden Bildern nicht zuverlässig identifiziert werden. (B) Zellunterbrechungen können nur einige Zellen im Sichtfeld betreffen. Einige Zellen können in beiden Bildern eindeutig identifiziert werden, während andere nicht sicher abgeglichen werden können. (C) Wenn Proben sorgfältig behandelt werden, bleiben die meisten Zellen ungestört und können in beiden Bildern identifiziert werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg"> Abbildung 5: Ein Anwendungsbeispiel für diese Methode, Boxplots, die Assoziationen zwischen Kalziumaktivität und Genexpression (GABA und Glut für Gene gad1.1 bzw. slc17a7) im neuralen Plattenstadium Xenopus laevis zeigen. In Stufe 14 weisen gad1.1-postive Zellen (GABA) eine höhere Amplitude und eine regelmäßigere Kalziumaktivität auf, wie sie durch (A) Markovian entropy18 und (B) bezeichnet wird, mit den Schwellenwerten 125%, 150%, 200% und 300% des Durchschnitts der de-trendierten fluoreszierenden Intensität (Baseline)17 als slc17a7 positive Zellen (Glut). Sterne zeigen statistisch signifikante Unterschiede nach Bonferroni-korrigierten Zwei-Stichproben-Kolmogorov-Smirnov-Test (p < 0,05) und Cohens d-Statistiken zur Effektgröße (n = 5 Kulturen und >100 Zellen; * 0,2 x |d| < 0,5). Die Figur wurde neu gezeichnet und an angepasst aus dem Datensatz von Paudel et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Wir präsentieren ein zweiteiliges Protokoll, das fluoreszierende Calcium-Bildgebung mit In-situ-Hybridisierung kombiniert, so dass der Experimentator Muster der Calciumaktivität mit Genexpressionsprofilen auf einzelzelligem Niveau korrelieren kann.

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Kalziumaktivitätsmuster mit der Genexpression auf Einzelzellebene zu korrelieren, was Forscher in die Lage versetzt, neue Fragen über die Beziehungen zwischen diesen beiden Merkmalen zu untersuchen. Im Gegensatz zu früheren Ansätzen, die in der Regel ganze Gewebe untersuchen, zoomt unsere Technik auf die Einzelzellebene, so dass wir zellautonome Beziehungen zwischen Kalziumaktivität und Genexpression bewerten können. Beginnen Sie mit der UV-Sterilisation von zwei 35-Millimeter-Kunststoff-Petrischalen und einer 35-Millimeter-Zellkulturschale für ca. 30 Minuten.In der laminaren Durchflusshaube werden je zwei 50 Milliliter Kunststoffkonische Röhren, eine UV-sterilisierte Petrischale und die UV-sterilisierte Zellkulturschale mit je zwei Millilitern von zwei Millimolaren Calciumlösung geliefert. Fügen Sie der anderen UV-sterilisierten Petrischale zwei Milliliter Kalzium- und Magnesiumfreie Lösung hinzu und füllen Sie zwei 100-Millimeter-Kunststoff-Petrischalen und eine 35-Millimeter-Kunststoff-Petrischale mit 0,1X MMR, ergänzt mit Gentamicin. Dann füllen Sie eine 60 Millimeter Kunststoff Petrischale mit 70% Ethanol.Unmittelbar vor der Zerlegung 0,01 Gramm kollagenes B in eine Röhre Mitkalziumlösung mischen. Fügen Sie die Lösung zu einer neuen 60-Millimeter-Kunststoff-Petrischale hinzu und verwenden Sie ein Sezierenvonmikroskop, um Embryonen des gewünschten Entwicklungsstadiums zu identifizieren. Verwenden Sie eine sterile Transferpipette, um mindestens sechs geeignete Embryonen in eine 100-Millimeter-Platte mit MMR plus Gentamicin zu bewegen.Dann einen Embryo von der Halteplatte in die zweite 100-Millimeter-Platte mMR plus Gentamicin bewegen und diese Sezierplatte unter das Mikroskop stellen. Mit einem Paar stumpfer Zangen, um den Embryo zu stabilisieren, schälen Sie vorsichtig die Vitelline-Membran, die den Embryo umgibt, mit einem Paar feiner Zange ab. Wenn die gesamte Membran entfernt wurde, verwenden Sie die feinen Zangen, um den Embryo entlang der vorderen hinteren Achse zu kneifen, um die dorsalen und ventralen Bereiche zu trennen.Verwenden Sie die neue sterile Transferpipette, um den dorsalen Teil für ein bis zwei Minuten auf die 60-Millimeter-Platte der kollagenen Lösung zu übertragen, bevor Sie die Probe vorsichtig zurück auf die Sezierplatte übertragen. Um die Zerlegung abzuschließen, entfernen Sie sorgfältig alle Reste der endodermalen und mesodermalen Kontamination aus dem mutmaßlichen neuronalen Gewebe des Ektoderms und übertragen Sie das Explant vorsichtig auf die 35-Millimeter-Platte der Calciumlösung. Wenn drei weitere Explanten gesammelt wurden, verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um alle vier Expflanzen auf die 35-Millimeter-Platte mit Kalzium- und Magnesium-freien Lösungen zu übertragen, wobei darauf geachtet wird, dass kein Kontakt zwischen den Explants und der Luftwasserschnittstelle besteht.Dann wirbeln Sie die Schale sanft, so dass sich alle Explanten in der Mitte der Platte bündeln und die Proben für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren, damit sich die Gewebe lösen können. Während dieser Inkubation die letzten beiden Embryonen mit Gentamicin auf die zweite Schale von MMR übertragen und die Schale bedecken, damit sich diese Proben ungestört entwickeln können. Verwenden Sie am Ende der Inkubation Superkleber, um einen mikro-regierten Deckelschlupf an der Unterseite der 35-Millimeter-Zellkulturschale zu befestigen und verwenden Sie eine P100-Mikropipette, um die dissoziierten Explants zu sammeln.Halten Sie die Pipette in einem flachen Winkel nahe an der Oberfläche der Zellkulturschale, positionieren Sie die Pipettenspitze in der Ecke des Gitters nach innen und vertreiben Sie die Zellaufhängung fest über den gerasterten Bereich. Im Idealfall setzen sich die Zellen in einem engen, dichten Cluster ab. Lassen Sie die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur an der Platte haften.Während sich die Zellen absetzen, bestimmen und erfassen Sie das Entwicklungsstadium der Geschwisterkontrollembryonen. Am Ende der Inkubation die Probenschale an einen lichtgeschützten Ort bewegen und 100 Mikroliter Lösung vom Rand der Schale ansaugen. Mischen Sie diese Lösung mit sieben Mikrolitern einer frisch zubereiteten Fluo-4 AM Pluronic F127 Säurelösung mit Auf- und Abpipetten, bevor Sie das volle Volumen in die Probenschale zurückgeben.Wirbeln Sie sanft, um die Platte mit Aluminiumfolie zu mischen und zu bedecken. Nach einer Stunde bei Raumtemperatur einen Milliliter des Explant-Kultur-Überstandes durch drei Milliliter frische zwei Millimolar Kalziumlösung ersetzen. Dann ersetzen Sie drei Milliliter Überstand durch drei Milliliter frische Kalziumlösung zwei weitere Male.Legen Sie die Probenplatte für die Kalziumaktivitäts-Bildgebung innerhalb der Explanten auf die Bühne eines invertierten konfokalen Mikroskops, das vor Umgebungslichteinwirkung geschützt ist, und verwenden Sie einen Marker, um den vorderen Punkt der Platte zu beschriften, so dass das gleiche Sichtfeld bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen gefunden werden kann. Verwenden Sie die 10- und 20-fachen Ziele, um eine Probe unter dem Mikroskop zu lokalisieren und ein geeignetes Sichtfeld auszuwählen, das zelldicht, aber nicht so dicht ist, dass die Zellen verklumpt oder schwer einzeln zu unterscheiden sind. Passen Sie den Mikroskopfokus so an, dass der gittergeregelte Abdeckungsslip sichtbar ist, und ändern Sie das ursprüngliche Sichtfeld, bis sich bei Bedarf eine identifizierbare Zahl im Rahmen befindet.Erhalten Sie ein helles Feldbild des ausgewählten Sichtfeldes mit dem gittergeregelten Deckblatt im Fokus und einem hellen Feldbild des ausgewählten Sichtfeldes mit den Zellen im Fokus. Ohne ein klares Bild des gerasterten Coverslips und des Sichtfeldes können Sie Ihre Zellen nicht mit denen in den Fischbildern registrieren, die Sie später generieren werden. Dann beleuchten Sie die Proben mit einem 488 Nanometer Laser.Ändern Sie für ein zweistündiges Bild die Bildverarbeitungskonfiguration, um 901 Frames mit einer Scanzeit von 3,93 Sekunden in einem Intervall von acht Sekunden aufzuzeichnen, bevor Sie die Konfiguration ausführen, um das Bild zu erfassen. Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Platte aus der Mikroskopstufe und ersetzen Sie den Kulturüberstand durch einen Milliliter 1X MEMFA für eine zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur, wobei Sie darauf achten, die Entwicklungsphase der Geschwisterkontrollembryonen zu Beginn der Inkubation aufzuzeichnen. Die Visualisierung eines zusammengesetzten Diagramms, das Spuren für alle in einem Experiment aufgezeichneten Zellen enthält, zeigt, inwieweit Massen- oder Populationsmessungen nuanciertere Muster des Spiking-Verhaltens verschleiern können.Wenn die aufgezeichneten Profile einzelner Zellen isoliert sind, können Beispiele für die unregelmäßige Spiking-Aktivität, die für neuronale Vorläuferzellen charakteristisch ist, eindeutig identifiziert werden. Um diese Komplexität zu quantifizieren, können verschiedene Datenanalysemethoden angewendet werden, einschließlich verschiedener Parameter, um eine Spitze zu definieren. Wenn die Platten grob gehandhabt werden oder die Wässen während der fluoreszierenden In-situ-Hybridisierung zu stark ausgeführt werden, können die Zellen von den Plattenoberflächen entfernt werden, so dass es unmöglich ist, die Zellen bildübergreifend abzugleichen.Wenn diese Unterbrechung nur einige der Zellen im Sichtfeld betrifft, kann es möglicherweise immer noch möglich sein, einige der Zellen im Bild zu erkennen und zuzuweisen. Die maximale Datenmenge wird jedoch aus einem Experiment gewonnen, bei dem die Hybridisierung sorgfältig durchgeführt wird und nur wenige Zellen zwischen Bildern verloren gehen oder neu positioniert werden. Ergebnisse von Experimenten, die Kalziumaktivität mit der Expression von neuronalen Vorläufermarkergenen zusammenfassten, können zahlreiche Assoziationen zwischen spezifischen Mustern der Kalziumaktivität und Neurotransmitter-Phänotypen aufdecken.Mit diesen Daten können Forscher komplexere Merkmale dieser dynamischen Kalziummuster und der Beziehungen zur Genexpression untersuchen, anstatt sich auf einfache Spike-Zählungen zu beschränken.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Ausbau der<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Eizellen, von Intrazytoplasmatische Spermieninjektion gefolgt, um embryonale Entwicklungsstudie

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subzellulärer Strukturen in der Living Zebrafischembryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technik auf Zielmikroinjektions an die Entwicklungs<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in<em&gt; Drosophila</em&gt; Bei Eiaktivierung

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...