Name: fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Ringraziamo Wendy Herbst e Lindsay Schleifer per il loro contributo allo sviluppo di questi protocolli. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dai National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 e 1R15HD096415-01) a MSS.

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Sono stati osservati modelli caratteristici di attività del calcio nelle cellule che compongono il sistema nervoso in via di sviluppo, con tipi specifici di attività associati a processi di neurosviluppo distinti. Tuttavia, un'ulteriore comprensione dei meccanismi con cui questi modelli di attività ad alta densità di informazioni sono tradotti in risposte trascrizionali richiede che le informazioni sull'attività del calcio e sull'espressione genica vengano raccolte con la risoluzione di una singola cellula. Mentre i sistemi che presentano un'attività di calcio più stereotipata, come i neuroni maturi, possono essere ragionevolmente saggiati a livello di massa, i modelli irregolari che caratterizzano il sistema nervoso embrionale sono facilmente mascherati da registrazioni meno precise.
Il quadro sperimentale stabilito in questo protocollo è facilmente adattabile a un'ampia varietà di tipi di cellule e reporter fluorescenti. I tessuti contenenti praticamente qualsiasi tipo di cellula o combinazione di tipi di cellule possono essere sezionati da un organismo modello di interesse e placcati per l'imaging a singola cellula. Oltre a consentire l'identificazione delle cellule e l'isolamento dell'effetto dei processi cell-autonomi, un approccio primario di coltura cellulare consente allo sperimentatore di definire i componenti multimediali come desiderato. Ad esempio, sono stati effettuati esperimenti che confrontano l'attività dei precursori neuronali nella soluzione 2 mM Ca2 per studiare se le relazioni tra la frequenza dei picchi e il fenotipo del neurotrasmettitore nel midollo spinale embrionale possano essere riassunte senza l'influenza delle interazioni cellula-cellula13,20.
Mentre questo protocollo sfrutta il marcatore fluorescente Fluo4-AM per rilevare l'attività del calcio intracellulare, a seconda dei criteri di selezione, gli utenti possono selezionare altri marcatori disponibili in commercio21, compresi gli indicatori di calcio codificati geneticamente. Allo stesso modo, i marcatori alternativi potrebbero essere utilizzati per monitorare i cambiamenti dinamici alla concentrazione di uno ione di interesse (tra cui K,Na, e n2) , potenziale di membrana, o pH cellulare. Le impostazioni di imaging e la durata dell'immagine possono essere modificate in base alle esigenze.
Anche se abbiamo correlato l'attività del calcio e il fenotipo neuronale come applicazione specifica, questo metodo è applicabile anche per una varietà di altre proprietà cellulari. Ad esempio, la fluorescenza nell'ibridazione situ può essere eseguita con sonde contro qualsiasi gene di interesse, incluso il marcatore neuronale ChAT o il fattore di trascrizione Engrailed, consentendo il rilevamento sensibile di un pannello personalizzabile di specie di mRNA. Queste sonde possono essere progettate per essere specifiche dell'isoformazione, supportando ulteriori specificità di destinazione, se lo si desidera. Double FISH può essere eseguito utilizzando sonde coniugate a diversi due fluorofori diversi, consentendo la valutazione simultanea dell'espressione di più geni. Tuttavia, i fusti aggiuntivi richiesti da questo tipo di esperimento sono associati a una maggiore probabilità di perdita o movimento cellulare e richiedono esperienza e delicatezza per essere eseguite con successo.
Indipendentemente dalle modifiche specifiche dell'esperimento apportate a questo protocollo, esistono diversi passaggi chiave che richiedono un'attenta attenzione. Le dissezioni devono essere eseguite con cura per rimuovere tutti i tessuti contaminanti o le popolazioni cellulari; poiché il patterning spaziale viene perso quando gli espianti sono dissociati, tutte le cellule rimanenti dai tessuti vicini saranno intervallate e indistinguibili dalle cellule di interesse. Dopo che le cellule sono placcate, i campioni devono essere maneggiati nel modo più delicatamente possibile per evitare che le cellule vengano slostate. Ancora più importante, questo significa che tutte le modifiche alla soluzione devono essere eseguite lentamente e con attenzione, con la pipetta posizionata sul bordo della piastra quando la soluzione viene rimossa e aggiunta. Ciò garantirà che le cellule possano essere identificate con sicurezza sia nelle immagini di calcio che in immagini FISH. Se le celle vengono interrotte durante l'elaborazione, potrebbe essere impossibile identificare alcune o tutte le celle corrispondenti tra le due immagini. Consigliamo di escidare sul lato della cautela con queste assegnazioni, in modo che solo le cellule corrispondenti inequivocabilmente vengono utilizzate per ulteriori analisi.
A seconda della questione biologica affrontata, può essere appropriata una varietà di approcci di analisi. L'attività del calcio di serie temporali può essere elaborata e quantificata in diversi modi, con flessibilità di sperimentazione nella scelta dei parametri di de-trending, metriche di analisi e parametri di analisi (ad esempio, la percentuale della soglia di base utilizzata per definire un picco di calcio). Le correlazioni tra l'attività del calcio e il livello di espressione genica possono essere tratte analizzando l'espressione genica come valore di fluorescenza assoluta o relativa estratta dall'immagine FISH. In alternativa, è possibile tracciare correlazioni tra l'attività del calcio e l'espressione genica (presenza/assenza) definendo una soglia di fluorescenza per il segnale positivo di espressione genica e assegnando identificatori "sì" o "no" alle singole cellule. Nel complesso, questo schema sperimentale fornisce una pipeline incredibilmente flessibile per la raccolta e l'analisi preliminare dei dati delle serie temporali in combinazione con i dati dell'espressione genica con corrispondenza cellulare. Tali esperimenti saranno fondamentali per comprendere meglio le complesse relazioni tra la dinamica cellulare e i cambiamenti trascrizionali, come esemplificato dall'identificazione di modelli di attività del calcio caratteristici dei precursori neuronali inibitori ed eccitatori nei precursori neuronali embrionali Xenopus laevis.

Calcio citosolico libero è fondamentale per una varietà di processi biologici, che vanno dalla proliferazione cellulare e la migrazione all'apoptosi e autofagia1,2,3. All'interno di queste vie, il calcio può esercitare effetti a valle sull'espressione genica interagendo con i domini che legano il calcio per indurre cambiamenti conformazionali che modulano l'attività e le interazioni delle proteine. Ad esempio, un sensore di calcio neuronale noto come downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) è tenuto in una conformazione intermedia spiegata quando legato dal calcio, impedendogli di interagire con la sua proteina e DNA bersagli4 . Oltre a fungere da semplice molecola di segnalazione, tuttavia, la natura dinamica dei transitori intracellulari del calcio consente a questi modelli di attività di codificare segnali più complessi basati sull'ampiezza o sulla frequenza5,6. La traslocazione nucleare del fattore di trascrizione del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) è potenziata da oscillazioni di calcio ad alta frequenza, ma inibita da oscillazioni a bassa frequenza7. Convincente, recenti lavori hanno suggerito che NFAT potrebbe effettivamente rispondere all'esposizione cumulativa al calcio8. Anche la calcineurina elaproteina cinziana iI (CaMKII) mostrano risposte distinte ai transitori di calcio di una frequenza, durata o ampiezzaspecifica 9. Per aggiungere un ulteriore livello di complessità normativa, i modelli computazionali suggeriscono che molte proteine leganti il calcio a valle diventano più o meno dipendenti dalla frequenza in risposta alla presenza o all'assenza di concorrenti vincolanti10,11.
All'interno del sistema nervoso in via di sviluppo, due classi principali di comportamenti di attività del calcio sono state definite e associate a processi biologici specifici. L'afflusso di calcio è classificato come "spikes" se si verificano all'interno di singole cellule, raggiungono un'intensità di picco di -400% della linea di base entro cinque secondi e presentano un doppio decadimento esponenziale12. Questo tipo di segnale è associato principalmente con neurotrasmettitore fenotipo specifica13. Al contrario, le "onde" sono definite come transitori di calcio più lento e meno estremo in cui la concentrazione di calcio intracellulare di una cellula sale al 200% della linea di base per un periodo di trenta secondi o più, poi decade per diversi minuti12. Questi segnali spesso si propagano tra più cellule vicine, e la loro presenza è stata associata con escrescenza neurite e proliferazione cellulare14,15. Tuttavia, anche se queste due classi sono state definite sulla base di profili cinetici caratteristici, non è chiaro esattamente quali caratteristiche di questi modelli vengono effettivamente rilevate dalle cellule e tradotte dagli effetti a valle.
Comprendere la relazione tra oscillazioni intracellulari del calcio ed espressione genica fornirebbe una visione cruciale di uno dei meccanismi regolatori che garantisce uno sviluppo e un modello appropriati del sistema nervoso. A tal fine, studi del midollo spinale embrionale hanno dimostrato che l'aumento dell'attività del picco di calcio durante lo sviluppo è associato a livelli più elevati di neuroni inibitori, mentre la diminuzione dell'attività del picco di calcio è associata a livelli più elevati di neuroni eccitatori13. Tuttavia, questi saggi a livello di popolazione non sono stati utilizzati per associare l'attività del calcio all'espressione genica a livello di singola cellula.
L'approccio a queste domande a livello della singola cella offre diversi vantaggi distinti rispetto al lavoro precedente. Per uno, la capacità di valutare l'attività del calcio e l'espressione genica in molte cellule individualmente consente di osservare il repertorio completo di modelli di attività distinti senza essere offuscato da una misurazione a livello di massa. Inoltre, lo studio di queste relazioni nella coltura primaria a cella singola significa mantenere i collegamenti cellulare-autonomi tra l'attività del calcio e l'espressione genica, mentre le interazioni che richiedono la comunicazione cellulare-cellula saranno abrogate. Pertanto, questo approccio consente di studiare questi meccanismi autonomi delle cellule in isolamento. Tuttavia, permette anche di chiarire e interrogare il ruolo dell'attività del calcio non cellulare-autonoma. Ad esempio, le cellule possono essere sezionate da un embrione nella fase della piastra neurale, coltivate fino a raggiungere lo stadio del tubo neurale e quindi confrontate con le cellule che sono state appena sezionate da un embrione di tubo neurale. Ciò consente il confronto diretto delle cellule che mantengono la comunicazione cellulare-cellula attraverso un periodo di sviluppo chiave a quelli in cui la comunicazione cellulare-cellula è stata abolita.
Nel tentativo di affrontare i limiti di precedenti approcci sperimentali, abbiamo sviluppato un protocollo che consentirebbe la valutazione dell'attività del calcio e dell'espressione genica nelle singole cellule progenitrici neurali, facilitando la correlazione di modelli di attività specifici con i successivi programmi di differenziazione. Il tessuto neurale è stato sezionato da Xenopus laevis in varie fasi dello sviluppo neurale, dissociato in singole cellule e immaginato tramite microscopia confocale in presenza di un indicatore di calcio fluorescente. Dopo l'imaging a cellule vive, i campioni sono stati fissati e analizzati tramite l'ibridazione in situ (FISH) di fluorescenza in situ per rilevare l'espressione di un gene o di un'isoforma di interesse. È importante sottolineare che le singole cellule possono essere monitorate attraverso entrambi gli esperimenti di imaging, il che significa che il profilo di attività del calcio di una cellula e il suo livello di espressione genica possono essere associati tra loro (Figura 1). Il protocollo qui riportato è destinato a sondare le relazioni tra i modelli di attività del calcio e l'espressione genica attraverso il neurosviluppo embrionale in Xenopus laevis. Tuttavia, il quadro sperimentale più ampio (imaging a percorso temporale a cella singola seguito da FISH e coregistrazione dell'immagine) può essere modificato e applicato praticamente a qualsiasi tipo di cellula, reporter fluorescente e gene di interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Animal Husbandry &#38; Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHORULON (chorionic gonodotropin)</td>
			<td>Merck Animal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3160102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CLS5-25D-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For RNA Probe Generation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3359247910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl Precipitation Solution (7.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fluorescence In Situ Hybridization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GEPA13105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC349610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (Deionized)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC413480050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid, 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ACS125231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 &#956;m pore, 500 mL bottle capacity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis

L'attività spontanea del calcio intracellulare può essere osservata in una varietà di tipi di cellule e si propone di svolgere ruoli critici in una varietà di processi fisiologici. In particolare, un'adeguata regolazione dei modelli di attività del calcio durante l'embriogenesi è necessaria per molti aspetti dello sviluppo neurale dei vertebrati, tra cui una corretta chiusura del tubo neurale, sinaptogenesi e specifica del fenotipo del neurotrasmettitore. Mentre l'osservazione che i modelli di attività del calcio possono differire sia in frequenza che in ampiezza suggerisce un meccanismo interessante mediante il quale questi flussi potrebbero trasmettere segnali codificati agli effetti a valle e regolare l'espressione genica, gli approcci a livello di popolazione non hanno avuto la precisione necessaria per esplorare ulteriormente questa possibilità. Inoltre, questi approcci limitano gli studi sul ruolo delle interazioni cellula-cellula precludendo la capacità di valutare lo stato della determinazione neuronale in assenza del contatto tra cellule. Pertanto, abbiamo stabilito un flusso di lavoro sperimentale che associa l'imaging di calcio time-lapse di esplants neuronali dissociati con un analisi di ibridazione di situ a fluorescenza, consentendo l'inequivocabile correlazione del modello di attività del calcio con fenotipo a livello di cella singola. Siamo riusciti a utilizzare questo approccio per distinguere e caratterizzare specifici modelli di attività del calcio associati rispettivamente alla differenziazione delle cellule neurali e delle cellule progenitrici neurali; al di là di questo, tuttavia, il quadro sperimentale descritto in questo articolo potrebbe essere facilmente adattato per studiare le correlazioni tra qualsiasi profilo di attività di serie temporali e l'espressione di un gene o geni di interesse.

Un esempio di successo di cellule dissociate preparate per l'imaging del calcio può essere visto nella Figura 2A. Le cellule sono densamente placcate, consentendo la massima quantità di informazioni da raccogliere da ogni immagine, ma non così densamente placcate che le singole cellule non possono essere distinte con sicurezza l'una dall'altra. La fluorescenza viene rilevata per ogni cella definita nel periodo di imaging di 2 h. La visualizzazione di un grafico composito contenente le tracce per tutte le celle registrate in un esperimento rivela il grado in cui le misurazioni sfuse o della popolazione possono oscurare modelli più sfumati di comportamento di chiodare (Figura 2B). Quando i profili registrati delle singole cellule sono isolati, è possibile identificare chiaramente esempi dell'attività irregolare di chiodare caratteristica delle cellule progenitrici neurali. A differenza dei neuroni maturi, le cellule neuronali embrionali presentano natura irregolare, altamente variabile e complessa dell'attività del calcio (Figura 2B). Per quantificare questa complessità, è stata applicata l'applicazione di diversi metodi di analisi dei dati17,18, inclusi diversi parametri per definire un picco (Figura 2C).
La fluorescenza di successo nell'ibridazione situ, compresa laprogettazionee la sintesi di successo di una sonda antisenso mRNA, può essere valutata confrontando la piastra sperimentale con un controllo dello sfondo incubato con un controllo RNA senso non vincolante ( Figura 3A,B). Un controllo positivo della sonda può essere eseguito anche elaborando un tipo di cellula noto per esprimere l'mRNA bersaglio a livelli rilevabili.
L'identificazione della stessa cellula nell'imaging di calcio e FISH richiede che le cellule mantengano all'incirca la stessa posizione durante l'ibridazione e l'elaborazione della sonda. Se le piastre vengono maneggiate grossolanamente o i fusi vengono eseguiti con troppa forza, le celle possono essere spostate dalla superficie della piastra e perse quando la soluzione viene scartata o depositata in una posizione diversa sulla piastra, rendendo impossibile la corrispondenza tra le immagini(Figura 4A). Se questa interruzione interessa solo alcune delle celle nel campo visivo, potrebbe essere comunque possibile rilevare e assegnare alcune celle all'interno dell'immagine (Figura 4B). Tuttavia, la quantità massima di dati viene ottenuta da un esperimento in cui FISH viene eseguita con attenzione e poche celle vengono perse o riposizionate tra le immagini (Figura 4C).
Una volta raccolti i dati per descrivere sia l'attività del calcio che l'espressione genica di un numero ragionevole di cellule nelle fasi di sviluppo di interesse, è possibile eseguire ulteriori analisi per valutare le correlazioni tra queste due caratteristiche (Figura 1). Una serie di metriche sono state applicate per quantificare i modelli di attività del calcio, tra cui il conteggio dei picchi/frequenza, la potenza media, la stima dell'esponente Hurst e la misurazione dell'entropia markoviana17,18. L'espressione genica può essere definita quantitativamente in base al livello di fluorescenza assoluta o classificata su una scala binaria (sì/no), a seconda delle domande sperimentali affrontate.
I risultati degli esperimenti che hanno raccolto l'attività del calcio con l'espressione dei geni marcatori progenitrici neurali hanno rivelato numerose associazioni tra modelli specifici di attività del calcio e fenotipi del neurotrasmettitore. Nella fase della piastra neurale (stadio 14), le cellule GABAergic che esprimono il marcatore del neurone inibitorio gad1.1 presentano un'attività di calcio più regolare e più alta di quella delle cellule che mancano di espressione gad1.1 (Figura 5A). Inoltre, mentre queste cellule che esprimono gad1.1sono associate a livelli più elevati di chiodare ad alta ampiezza, l'agguato a bassa ampiezza è più frequente nelle cellule glutamategiche che esprimono il marcatore del neurone eccitatorio slc17a7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg"> Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale. Barra della scala: 100 m. Le immagini nei pannelli 3-5 sono state scattate da Paudel et al. (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg"> Figura 2: immagini di calcio e profili di attività di esempio. (A) Attività del calcio intracellulare come riportato da Fluo4-AM. Ogni immagine da 2 h è composta da 901 fotogrammi, con una cornice rappresentativa qui. (B) Trama composita dell'intensità della fluorescenza nel tempo in tutte le celle all'interno del campo visivo immagine. Le tracce indicano chiaramente il fotosbiancamento del tintura indicatore (Fluo4) straordinario. La trama raster in alto a sinistra mostra tracce rappresentative dell'attività del calcio dopo l'applicazione di un algoritmo di de-trending sviluppato da Eilers e Boelen19, dove le cellule mostrate qui mostrano diversi modelli di comportamento chiodare. (C) Applicazione di diverse soglie (150% e 200% della linea di base, dove la linea di base è la media dell'intensità fluorescente di tendenza) per definire un picco (frecce verdi e blu). Barra della scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg"> Figura 3: Imaging FISH. (A) FISH eseguita con una sonda RNA senso non vincolante come controllo negativo. Le impostazioni di imaging sono state regolate in modo che nessuna cella appaia fluorescente. Alcuni campi visivi possono includere detriti non cellulari con una certa fluorescenza, come si vede negli angoli in alto a destra e in basso a destra di (A); questi possono essere ignorati ai fini dell'impostazione di sfondo. (B) Le stesse impostazioni di imaging vengono quindi utilizzate per l'immagine di una piastra sperimentale (sonda rna antisense). La fluorescenza in queste condizioni corrisponde all'espressione genica sopra lo sfondo. Barra della scala: 100 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg"> Figura 4: sovrapposizione dell'immagine e coregistrazione. Rappresentazioni schematiche di un campione di immagine per l'attività del calcio (cellule rappresentate da cerchi verdi pieni) e dopo FISH (cellule rappresentate da cerchi rossi ombreggiati). (A) Le celle che si sono spostate in modo significativo durante la gestione e l'elaborazione del campione non possono essere identificate in modo affidabile tra le due immagini. (B) L'interruzione delle celle può interessare solo alcune celle nel campo visivo. Alcune celle possono essere chiaramente identificate in entrambe le immagini, mentre altre non possono essere abbinate con sicurezza. (C) Se i campioni vengono trattati con attenzione, la maggior parte delle cellule rimarrà indisturbata e può essere identificata in entrambe le immagini. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg"> Figura 5: Un esempio di applicazione di questo metodo, boxplot che mostrano associazioni tra l'attività del calcio e l'espressione genica (GABA e Glut per i geni gad1.1 e slc17a7 rispettivamente) nella fase della piastra Xenopus neural laevis. Allo sta1,1-postive cellule (GABA) mostrano maggiore ampiezza e più regolare attività di calcio come definito da (A) entropia markoviaria18 e(B)picco conta utilizzando soglie 125%, 150%, 200% e 300% della media della media di intensità fluorescente fluorescente (linea di base)17 rispetto alle cellule positive slc177a . Le stelle indicano differenze statisticamente significative in base sia al test Kolmogorov-Smirnov a due campioni corretto da Bonferroni (p < 0,05) che alle statistiche d di Cohen per le dimensioni dell'effetto (n : 5 colture e >100 celle; La cifra è stata ridisegnata e adattata dal set di dati ottenuto da Paudel et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Questo protocollo può essere utilizzato per correlare i modelli di attività del calcio con l'espressione genica a livello di singola cellula consentendo ai ricercatori di indagare nuove domande sulle relazioni tra queste due caratteristiche. A differenza degli approcci precedenti, che tipicamente studiano interi tessuti, la nostra tecnica ingrandisce il livello di una singola cellula permettendoci di valutare le relazioni autonome cellulari tra l'attività del calcio e l'espressione genica. Inizia sterilizzando ai raggi UV due piastre petri di plastica da 35 millimetri e una coltura cellulare di 35 millimetri per circa 30 minuti.Lavorando nella cappa a flusso laminare, aggiungere 10 millilitri di due millimolare di soluzione di calcio a ciascuno dei due tubi conici in plastica da 50 millilitri, una piastra di Petri sterilizzata ai raggi UV e la piastra di coltura cellulare sterilizzata uv. Aggiungere due millilitri di soluzione priva di calcio e magnesio all'altra piastra di Petri sterilizzata dai raggi UV e riempire due piastre petri di plastica da 100 millimetri e una piastra di Petri in plastica da 35 millimetri con MMR 0,1X integrata con gentamicina. Quindi riempire una piastra di Petri di plastica da 60 millimetri con il 70% di etanolo.Immediatamente prima della dissezione, mescolare accuratamente 0,01 grammi di B collagene in un unico tubo di soluzione di calcio. Aggiungere la soluzione a una nuova piastra di Petri in plastica da 60 millimetri e utilizzare un microscopio sezionato per identificare gli embrioni dello stadio di sviluppo desiderato. Utilizzare una pipetta di trasferimento sterile per spostare almeno sei embrioni appropriati in una piastra da 100 millimetri contenente MMR più gentamicina.Quindi spostare un embrione dalla piastra di tenuta nella seconda piastra da 100 millimetri di MMR più gentamicina e posizionare questa piastra di dissezione al microscopio. Utilizzando un paio di forcep smussate per stabilizzare l'embrione, rimuovere con cura la membrana vitellina che circonda l'embrione con un paio di forcep fini. Quando tutta la membrana è stata rimossa, utilizzare le forcep fini per pizzicare l'embrione lungo l'asse posteriore anteriore per separare le regioni dorsali e ventrali.Utilizzare la nuova pipetta di trasferimento sterile per trasferire la porzione dorsale nella piastra di 60 millimetri di soluzione collagenosa per uno o due minuti prima di trasferire attentamente il campione nella piastra di dissezione. Per completare la dissezione, rimuovere con cura tutta la contaminazione endodermica e mesodermica residua dal tessuto neurale presuntivo dell'ectoderma e trasferire delicatamente l'espianto nella piastra di 35 millimetri di soluzione di calcio. Una volta raccolte altre tre espianto, utilizzare una micropipetta P1000 per trasferire tutte e quattro le espianto nella piastra di 35 millimetri di soluzione priva di calcio e magnesio, facendo attenzione ad evitare qualsiasi contatto tra gli espianto e l'interfaccia dell'acqua dell'aria.Quindi ruotare delicatamente il piatto in modo che tutte le espianto si raggruppano al centro del piatto e incubare i campioni per un'ora a temperatura ambiente per consentire ai tessuti di dissociarsi. Durante questa incubazione, trasferire gli ultimi due embrioni al secondo piatto di MMR con gentamicina e coprire il piatto per consentire a questi esemplari di svilupparsi indisturbati. Alla fine dell'incubazione, utilizzare la super colla per attaccare una coverslip micro-rigata sul fondo del piatto di coltura cellulare da 35 millimetri e utilizzare una micropipetta P100 per raccogliere le espianto dissociate.Tenendo la pipetta ad un angolo poco profondo vicino alla superficie del piatto di coltura cellulare, posizionare la punta della pipetta nell'angolo della griglia rivolta verso l'interno ed espellere saldamente la sospensione cellulare attraverso l'area a griglia. Idealmente, le cellule si depositeranno in un ammasso stretto e denso. Lasciare che le cellule aderiscano alla piastra per un'ora a temperatura ambiente.Mentre le cellule si stanno depositando, determinano e registrano lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratelli. Al termine dell'incubazione, spostare il piatto campione in una posizione protetta dalla luce e aspirare 100 microlitri di soluzione dal bordo del piatto. Mescolare questa soluzione con sette microlitri di una soluzione acida Fluo-4 AM Pluronic F127 preparata al momento con pipettazione su e giù prima di restituire l'intero volume al piatto campione.Ruotare delicatamente per mescolare e coprire la piastra con un foglio di alluminio. Dopo un'ora a temperatura ambiente, sostituire un millilitro del supernatante piatto di coltura explant con tre millilitri di soluzione di calcio fresca due millimolare. Quindi sostituire tre millilitri di supernatante con tre millilitri di soluzione di calcio fresco altre due volte.Per l'imaging dell'attività del calcio all'interno delle espianto, posizionare la piastra campione sullo stadio di un microscopio confocale invertito protetto dall'esposizione alla luce ambientale e utilizzare un marcatore per etichettare il punto anteriore della piastra in modo che lo stesso campo visivo possa essere trovato nelle sessioni di imaging successive. Utilizzare gli obiettivi 10 e 20 volte per localizzare un campione al microscopio e selezionare un campo visivo appropriato che sia denso di cellule ma non così denso che le cellule siano raggruppate o difficili da distinguere individualmente. Regolare lo stato attivo del microscopio in modo che il coverslip regolato dalla griglia sia visibile, modificando il campo visivo originale fino a quando un numero identificabile non è nel fotogramma in base alle esigenze.Ottenere un'immagine di campo luminoso del campo visivo selezionato con il coverslip regolato dalla griglia a fuoco e un'immagine di campo luminoso del campo visivo selezionato con le celle a fuoco. Senza un'immagine chiara del coverslip a griglia e del campo visivo, non sarai in grado di registrare le tue celle con quelle nelle immagini dei pesci che genererai in seguito. Quindi illuminare i campioni con un laser da 488 nanometri.Per un'immagine di due ore, modificare la configurazione dell'imaging per registrare 901 fotogrammi con un tempo di scansione di 3,93 secondi in un intervallo di otto secondi prima di eseguire la configurazione per acquisire l'immagine. Una volta completata l'imaging, rimuovere la piastra dallo stadio del microscopio e sostituire il supernatante di coltura con un millilitro di 1X MEMFA per un'incubazione di due ore a temperatura ambiente, facendo attenzione a registrare lo stadio di sviluppo degli embrioni di controllo fratelli all'inizio dell'incubazione. La visualizzazione di un grafico composito contenente tracce per tutte le cellule registrate in un esperimento rivela il grado in cui le misurazioni della massa o della popolazione possono oscurare modelli più sfumato di comportamento di spiking.Quando i profili registrati delle singole cellule sono isolati, è possibile identificare chiaramente esempi dell'attività di spiking irregolare caratteristica delle cellule progenitrici neurali. Per quantificare questa complessità, è possibile applicare diversi metodi di analisi dei dati, inclusi diversi parametri per definire un picco. Se le piastre vengono maneggiate approssimativamente o i lavaggi vengono eseguiti troppo forzatamente durante l'ibridazione fluorescente in situ, le cellule possono essere slogate dalle superfici della piastra rendendo impossibile l'abbinamento delle cellule tra le immagini.Se questa interruzione interessa solo alcune delle celle nel campo visivo, potrebbe comunque essere possibile rilevare e assegnare alcune delle celle all'interno dell'immagine. Tuttavia, la quantità massima di dati viene ottenuta da un esperimento in cui l'ibridazione viene eseguita con attenzione e poche celle vengono perse o riposizionate tra le immagini. I risultati di esperimenti che raccoglieno l'attività del calcio con l'espressione di geni marcatori progenitori neurali possono rivelare numerose associazioni tra specifici modelli di attività del calcio e fenotipi neurotrasmettitori.Con questi dati, i ricercatori possono sondare le caratteristiche più complesse di questi modelli dinamici di calcio e le relazioni con l'espressione genica piuttosto che essere limitate al semplice conteggio dei picchi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Capire in anticipo Organogenesis Utilizzando una semplificata<em&gt; In Situ</em&gt; Protocollo di ibridazione in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Un approccio per la valutazione optogenetic Formazione di connessioni neuronali in un sistema di co-coltura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

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Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

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Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

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Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

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Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

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Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

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Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

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Calcio Imaging in<em&gt; Drosophila</em&gt; All&#39;attivazione Egg

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Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

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Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

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Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

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In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...