Name: fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

ウェンディ・ハーブストとリンジー・シュライファーがこれらのプロトコルの開発に貢献してくれたことに感謝します。この作業は、国立衛生研究所(1R15NS067566-01、1R15HD077624-01、および1R15HD096415-01)からMSSへの助成金によってサポートされました。

<ol>
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利益相反は宣言されていません。

カルシウム活性の特徴的なパターンは、発達中の神経系を構成する細胞において観察されており、特定のタイプの活動が明確な神経発達過程に関連している。しかし、これらの情報密度の高い活性パターンが転写応答に変換されるメカニズムをさらに理解するには、カルシウム活性と遺伝子発現に関する情報を単一細胞分解能で収集する必要があります。成熟したニューロンのようなよりステレオタイプなカルシウム活性を示すシステムは、バルクレベルで合理的にアッセイすることができるが、胚性神経系を特徴付ける不規則なパターンは、より正確でない記録によって容易にマスクされる。
このプロトコルで確立された実験フレームワークは、多種多様な細胞タイプおよび蛍光レポーターに容易に適応可能である。事実上あらゆる細胞タイプまたは細胞タイプの組み合わせを含む組織は、目的のモデル生物から解剖され、単一細胞イメージングのためにメッキされ得る。細胞の同定と細胞自律プロセスの効果の分離を可能にすることに加えて、一次細胞培養アプローチは、実験者が望ましい媒体成分を定義することを可能にする。例えば、2mMのCa2+溶液におけるニューロン前駆体の活性を比較した実験は、胚性脊髄におけるスパイク頻度と神経伝達物質表現型との関係が細胞間相互作用13、20の影響を受けずに再現できるかどうかを調べるために行われた。
このプロトコルは蛍光マーカーFluo4-AMを利用して細胞内カルシウム活性を検出するが、選択基準に応じて、ユーザーは、遺伝的にコードされたカルシウム指標を含む他の市販のマーカー21を選択することができる。同様に、代替マーカーは、目的のイオン(K+、Na+、およびZn2+を含む)、膜電位、または細胞pHの濃度に対する動的変化を監視するために使用することができる。画像の設定と画像の継続時間は必要に応じて変更できます。
具体的な用途としてカルシウム活性と神経表現型を相関させたが、この方法は他の様々な細胞特性にも適用可能である。例えば、situハイブリダイゼーション中の蛍光は、ニューロンマーカーChATまたは転写因子Engrailedを含む任意の目的の遺伝子に対するプローブを用いて行うことができるので、mRNA種のカスタマイズ可能なパネルの感度検出を可能にする。これらのプローブは、アイソフォーム特異的になるように設計することができ、必要に応じて追加のターゲット特異性をサポートします。Double FISHは、複数の異なる蛍光異管に共役したプローブを使用して行うことができるので、複数の遺伝子の発現を同時に評価することができます。しかし、この種の実験で必要とされる追加のワッシュは、細胞の喪失や動きの可能性の増加に関連しており、経験と繊細さが正常に実行される必要があります。
このプロトコルに対して行われた実験固有の変更に関係なく、注意が必要ないくつかの重要な手順があります。すべての汚染組織または細胞集団を除去するために注意して、分節を行う必要があります。外植が解離されると空間パターンは失われるため、隣接する組織の残りの細胞は、関心のある細胞と散在し、区別がつかないようになります。細胞がメッキされた後、サンプルは細胞が外れないようにできるだけ穏やかに扱われるべきである。最も重要なことは、これは、溶液が除去され、追加されるときにピペットをプレートの端に置いて、すべての溶液の変更がゆっくりと慎重に行われるべきであることを意味します。これにより、カルシウム画像とFISH画像の両方で細胞が確実に同定できるようになります。処理中に細胞が破壊された場合、2つの画像間の対応する細胞の一部または全部を特定することができない可能性があります。我々は、明確に対応する細胞だけがさらなる分析に使用されるように、これらの割り当てに注意する側に誤りをお勧めします。
対処される生物学的問題に応じて、様々な分析アプローチが適切な場合があります。時系列カルシウム活性は、さまざまな方法で処理および定量することができ、実験者はトレンド除去パラメータ、分析メトリック、分析パラメータ(例えば、カルシウムスパイクを定義するために使用されるベースライン閾値の%)を柔軟に選択できます。カルシウム活性と遺伝子発現レベルとの相関は、FISH画像から抽出された絶対蛍光値または相対蛍光値として遺伝子発現を解析することによって導き出すことができる。また、カルシウム活性と遺伝子発現(存在/不在)との相関は、陽性遺伝子発現シグナルの蛍光閾値を定義し、個々の細胞に「はい」または「いいえ」の識別子を割り当てることによって引き出すことができます。全体として、この実験的なスキーマは、細胞に一致した遺伝子発現データと組み合わせて時系列データの収集と予備分析のための非常に柔軟なパイプラインを提供します。このような実験は、胚性ゼノプス・レエビスにおける抑制性脂肪および興奮性脂肪神経前駆体のカルシウム活性パターンの同定によって例示されるように、細胞動態と転写変化との複雑な関係をよりよく理解するために重要であろう。

遊離細胞質カルシウムは、細胞増殖および移動からアポトーシスおよびオートファジー1、2、3に至るまで、様々な生物学的プロセスに重要である。これらの経路内では、カルシウムは、カルシウム結合ドメインと相互作用してタンパク質の活性および相互作用を調節する立体構造変化を誘導することによって、遺伝子発現に下流の効果を及ぼし得る。例えば、下流制御要素アンタゴニスト変調器(DREAM)として知られる神経カルタカルシウムセンサーは、カルシウムに結合すると展開された中間立体構造に保持され、そのタンパク質およびDNA標的4と相互作用するのを防ぐ。しかし、単純なシグナル伝達分子として機能する以外に、細胞内カルシウム過渡の動的性質により、これらの活性パターンは、より複雑な振幅または周波数ベースの信号5、6をコードすることを可能にする。活性化T細胞の核因子の転写因子の核転位は、高周波カルシウム振動によって増強されるが、低周波振動によって阻害される7。説得力のある, 最近の研究は、NFATが実際に累積カルシウム暴露に応答するかもしれないことを示唆しています 8 .カルシニューリンおよびCa2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)は、また、特定の周波数、持続時間、または振幅9のカルシウム過渡に対して明確な応答を示す。調節の複雑さの追加レベルを追加するために、計算モデルは、多くの下流のカルシウム結合タンパク質が、結合競合者10,11の存在または不在に応じて多かれ少なかれ周波数依存性になることを示唆している。
発達中の神経系の中で、カルシウム活性行動の2つの主要なクラスが定義され、特定の生物学的プロセスに関連付けられている。カルシウム流入は、個々の細胞内で発生した場合に「スパイク」に分類され、5秒以内にベースラインの400%近いピーク強度に達し、二重指数比12を示す。このタイプのシグナルは、主に神経伝達物質の表現型仕様13と関連している。これに対して、「波」は、細胞の細胞内カルシウム濃度が30秒以上の期間にわたってベースラインの〜200%に上昇し、その後、数分間12にわたって減衰する、より遅く、より極端でないカルシウム過渡気として定義される。これらのシグナルは、多くの場合、複数の隣接する細胞に伝播し、その存在は、神経突起の成長と細胞増殖に関連付けられている14,15.しかし、これら2つのクラスは特徴的な運動プロファイルに基づいて定義されていますが、これらのパターンのどの特性が実際に細胞によって検出され、下流のエフェクターによって翻訳されているかは正確には不明です。
細胞内カルシウム振動と遺伝子発現の関係を理解することは、神経系の適切な発達とパターン化を保証する調節メカニズムの1つに重要な洞察を提供するであろう。この終わりのために、胚性脊髄の研究は、発達中のカルシウムスパイク活性の増加がより高いレベルの抑制性ニューロンに関連していることを実証しているが、カルシウムスパイク活性の低下は興奮性ニューロンのより高いレベルに関連している13。しかし、これらの集団レベルのアッセイは、単細胞レベルでの遺伝子発現とカルシウム活性を関連付けるために使用されていません。
単一セルのレベルでこれらの質問に近づくと、前の作業よりもいくつかの明確な利点があります。一つには、多くの細胞におけるカルシウム活性および遺伝子発現を個別に評価する能力により、バルクレベル測定によって難読化されることなく、明確な活性パターンの完全なレパートリーを観察することができます。さらに、単一細胞の初次培養におけるこれらの関係を研究することは、カルシウム活性と遺伝子発現との間の細胞自律的なリンクが維持され、細胞間通信を必要とする相互作用が失われることを意味する。したがって、このアプローチは、これらの細胞自律的なメカニズムを単独で研究することを可能にする。しかし、それはまた、非細胞自律性カルシウム活性の役割を解明し、尋問することを可能にする。例えば、細胞は神経プレート段階で胚から解剖され、兄弟コントロールが神経管段階に達するまで培養され、次に神経管段階の胚から新たに解剖された細胞と比較することができる。これにより、重要な発生期間にわたって細胞間通信を保持していた細胞と、細胞間通信が廃止された細胞とを直接比較することができます。
これまでの実験手法の限界に取り組むため、個々の神経前駆細胞におけるカルシウム活性と遺伝子発現の評価を可能にするプロトコルを開発し、その後の分化プログラムとの特定の活性パターンの相関を促進する。神経組織は、神経発生の様々な段階でゼノプス・レービスから解剖され、単一細胞に解離され、蛍光カルシウム指標の存在下で共焦点顕微鏡を介して画像化された。生細胞イメージングに続いて、サンプルを固定し、蛍光でハイブリダイゼーション(FISH)を介して、目的の遺伝子またはアイソフォームの発現を検出した。重要なことに、個々の細胞は、両方のイメージング実験にわたって追跡することができ、細胞のカルシウム活性プロファイルとその遺伝子発現レベルは互いに関連付けることができることを意味する(図1)。ここで報告されるプロトコルは、Xenopus laevisの胚性神経発達全体におけるカルシウム活性パターンと遺伝子発現の関係を調査することを目的としています。しかし、より広範な実験フレームワーク(単一細胞時間経過イメージングとFISHと画像の共登録)は、事実上任意の細胞タイプ、蛍光レポーター、および目的の遺伝子に改変および適用することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Animal Husbandry &#38; Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHORULON (chorionic gonodotropin)</td>
			<td>Merck Animal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3160102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CLS5-25D-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For RNA Probe Generation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3359247910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl Precipitation Solution (7.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fluorescence In Situ Hybridization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GEPA13105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC349610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (Deionized)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC413480050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid, 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ACS125231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 &#956;m pore, 500 mL bottle capacity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis

自然細胞内カルシウム活性は、様々な細胞型で観察でき、様々な生理学的過程において重要な役割を果たすと提案されている。特に、胚発生時のカルシウム活性パターンの適切な調節は、適切な神経管閉鎖、シナプト形成、神経伝達物質の表現型の仕様を含む脊椎動物の神経発達の多くの側面に必要である。カルシウム活性パターンが周波数と振幅の両方で異なる可能性があるという観察は、これらのフラックスが下流のエフェクターにコードされた信号を伝達し、遺伝子発現を調節する説得力のあるメカニズムを示唆しているが、既存の人口レベルのアプローチは、この可能性をさらに探求するために必要な精度を欠いている。さらに、これらのアプローチは、細胞間接触の非存在下における神経細胞決定の状態をアッセイする能力を排除することによって、細胞間相互作用の役割の研究を制限する。そこで、解解神経系外在物の経時・経過カルシウムイメージングと、その場でのハイブリダイゼーションにおける蛍光を組み合わせ、カルシウム活性パターンと分子の明確な相関を可能にする実験ワークフローを確立しました。単一細胞レベルの表現型。我々は、神経細胞と神経前駆細胞の分化に関連する特定のカルシウム活性パターンをそれぞれ区別し、特徴付けるために、このアプローチを使用することができました。しかし、この記事で説明した実験フレームワークは、時系列の活動プロファイルと、目的の遺伝子または遺伝子の発現との間の相関関係を調査するために容易に適応することができる。

カルシウムイメージングのために調製された解化細胞の成功例を図2Aに示すことができる。細胞は密にメッキされ、各画像から収集される情報の最大量を可能にするが、個々の細胞が互いに自信を持って区別できないほど密にメッキされていない。2hイメージング期間にわたって定義された各細胞について蛍光が検出される。実験で記録されたすべての細胞の痕跡を含む複合プロットの視覚化は、バルクまたは集団の測定がスパイク動作のより微妙なパターンをあいまいにすることができる程度を明らかにします(図2B)。個々の細胞の記録されたプロファイルが単離されると、神経前駆細胞の不規則なスパイク活動特性の例が明確に同定され得る。成熟したニューロンとは異なり、胚性ニューロン細胞は、不規則で、非常に可変的で、カルシウム活性の複雑な性質を示す(図2B)。この複雑さを定量化するために、異なるデータ解析方法の適用は、スパイクを定義する多様なパラメータを含む17,18を適用して適用された(図2C)。
アンチセンスmRNAプローブの設計と合成に成功することを含む、situハイブリダイゼーションにおける蛍光の成功は、非結合感知体RNA制御でインキュベートされたバックグラウンドコントロールに対して実験プレートを比較することによって評価することができる(図3A、B)。陽性プローブ制御は、検出可能なレベルで標的mRNAを発現することが知られている細胞型を処理することによっても行うことができる。
カルシウムとFISHイメージングで同じ細胞を同定するには、プローブのハイブリダイゼーションと処理中に細胞がほぼ同じ位置を保持する必要があります。プレートが大まかに処理されたり、ワッシュが強引に行われたりすると、細胞はプレート表面から外れ、溶液が廃棄されたりプレート上の別の場所に堆積したりすると失われる可能性があり、画像間で一致することが不可能になります(図4A)。この中断が視野の一部のセルにのみ影響する場合でも、画像内の一部のセルを検出して割り当てることはできるかもしれません (図 4B)。しかし、FISHを慎重に行い、画像間で失われたり、位置を変える細胞が少ない実験から得られるデータの最大量(図4C)。
目的の発生段階で妥当な数の細胞のカルシウム活性と遺伝子発現の両方を記述するデータが収集されたら、これらの2つの特徴の相関を評価するためにさらなる分析を行うことができます(図1)。スパイクのカウンティング/周波数、平均パワー、ハースト指数推定、マルコフエントロピー測定17、18など、カルシウム活性パターンを定量化するために、多くの指標が適用されています。遺伝子発現は、絶対蛍光レベルによって定量的に定義するか、または対処されている実験の質問に応じて、バイナリ(はい/いいえ)スケールで等級分けすることができます。
神経前駆マーカー遺伝子の発現とカルシウム活性を照合する実験の結果、カルシウム活性の特定のパターンと神経伝達物質の表現型との間に多数の関連が明らかになった。神経板ステージ(ステージ14)では、阻害性ニューロンマーカー gad1.1を発現するGABAergic細胞は、gad1.1発現を欠いている細胞よりも規則的かつ高振幅のカルシウム活性を示す(図5A)。さらに、これらのgad1.1-発現細胞がより高いレベルの高振幅スパイクに関連しているのに対し、興奮性ニューロンマーカー lclclclclclclclclclc17a7を発現するグルタミン酸細胞では低振幅スパイクがより頻繁に起こる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg"> 図1:実験ワークフローの概略図スケールバー = 100 μmパネル3-5の画像は、パウデルら(2019)17から撮影されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg"> 図2:カルシウムイメージングとアクティビティプロファイルの例(A) Fluo4-AMによって報告された細胞内カルシウム活性。各2時間の画像は901フレームで構成され、1つの代表的なフレームがここに示されています。(B) 画像化視野内のすべての細胞における経時の蛍光強度の複合プロット。痕跡は明らかにインジケータ染料(Fluo4)残業のフォトブリーチを示しています。左上のラスタープロットは、エイラーズとボーレン19によって開発された脱トレンドアルゴリズムの適用後のカルシウム活性の代表的な痕跡を示し、ここで示された細胞は多様なスパイク行動パターンを示す。(C) 異なる閾値(ベースラインの150%および200%、ベースラインはトレンド解除蛍光強度の平均)の適用をスパイク(緑と青の矢印)に定義する。スケールバー = 100 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg"> 図3:魚撮像(A) 負制御として非結合感知体RNAプローブを用いて行ったFISH。蛍光を見ない細胞がないようにイメージング設定が調整されています。一部の視野には、(A)の右上および右下隅に見られるような、ある種の蛍光を伴う非細胞破片が含まれる場合があります。これらは、背景設定のために無視することができます。(B) 実験プレート(アンチセンスRNAプローブ)の画像化には、同じイメージング設定が使用されます。これらの条件下での蛍光は、上記の遺伝子発現に対応するバックグラウンドである。スケールバー = 100 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg"> 図4:画像のオーバーレイと一連の登録カルシウム活性(緑色の丸で満たされたセル)とFISH(赤い赤い円で表されるセル)の後に画像化されたサンプルの概略図。(A) サンプルの処理と処理中に大幅に移動したセルは、2 つの画像で確実に識別できません。(B) 細胞の破壊は、視野の一部のセルにのみ影響を及ぼす可能性があります。両方の画像で明確に識別できるセルもあれば、自信を持って一致させることができないセルもあります。(C) サンプルを慎重に扱う場合、ほとんどのセルは邪魔されず、両方の画像で識別できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg"> 図5:この方法の適用例として、神経板段階ゼノプス・レービスにおけるカルシウム活性と遺伝子発現との関連を示す箱ひげ図(それぞれ遺伝子gad1.1およびslc17a7に対するGABAおよびGlut)ステージ14では、gad1.1-ポスチング細胞(GABA)は、(A)マルコフエントロピー18および(B)スパイク数閾値125%、150%、200%および300%の閾値を使用して定義されるより高い振幅およびより規則的なカルシウム活性を示す(ベースライン177a(slc17a)よりも大きい。星は、ボンフェローニ補正2サンプルコルモゴロフスミルノフ検定(p < 0.05)と効果サイズのコーエンのd統計(n = 5培養および>100セル;* 0.2 ≤ |d| < 0.5)の両方に従って統計的に有意な差を示します。この図は、パウデルら17から得られたデータセットから再描画され、適応された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

蛍光カルシウムイメージングとin situハイブリダイゼーションを組み合わせた2部構成のプロトコルを提示し、実験者がカルシウム活性のパターンを単一細胞レベルの遺伝子発現プロファイルと相関させることが可能です。

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

このプロトコルは、カルシウム活性パターンを単一細胞レベルでの遺伝子発現と相関させるために使用することができ、研究者はこれらの2つの特徴の関係に関する新しい質問を調査する能力を与える。一般的に組織全体を研究する以前のアプローチとは対照的に、私たちの技術は単一細胞レベルにズームインし、カルシウム活性と遺伝子発現との細胞自律的関係を評価することを可能にします。35ミリメートルプラスチックペトリ皿2個と35ミリメートルの細胞培養皿1個を約30分間UV殺菌することから始めます。層流フードで作業し、2つの50ミリリットルプラスチック円錐管、1つのUV滅菌ペトリ皿、およびUV滅菌された細胞培養皿のそれぞれに2ミリモルカルシウム溶液の10ミリリットルを加えます。他のUV殺菌されたペトリ皿にカルシウムとマグネシウムフリー溶液を2ミリリットル加え、100ミリメートルプラスチックペトリ皿2個と35ミリメートルプラスチックペトリ皿1本に0.1X MMRをゲンタマイシンで補います。その後、70%エタノールで60ミリメートルプラスチックペトリ皿を充填します。解剖の直前に、0.01グラムのコラーゲンBをカルシウム溶液の1つのチューブに十分に混ぜます。新しい60ミリメートルプラスチックペトリ皿に溶液を追加し、目的の発達段階の胚を識別するために解剖顕微鏡を使用しています。滅菌移動ピペットを使用して、少なくとも6個の適切な胚をMMRプラスゲンタマイシンを含む1つの100ミリメートルプレートに移動させます。次に、保持プレートから1つの胚をMMRプラスゲンタマイシンの2番目の100ミリメートルプレートに移動させ、この解剖プレートを顕微鏡の下に置きます。胚を安定させるために鈍い鉗子のペアを使用して、慎重に微細な鉗子のペアで胚を囲むビテリン膜を剥がします。すべての膜が取り除かれたら、細かい鉗子を使用して、後側および腹側領域を分離するために、前部後軸に沿って胚をつまむ。新しい滅菌移動ピペットを使用して、背部部分をコラーゲン液の60ミリメートルプレートに1〜2分間転送してから、検体を慎重に解剖プレートに戻します。解剖を完了するには、外胚葉の推定神経組織から残存する内胚葉および中胚葉汚染をすべて慎重に除去し、外植物をカルシウム溶液の35ミリメートルプレートに穏やかに移す。さらに3つの外植植物が採取された場合は、P1000マイクロピペットを使用して、4つの外植物をすべて35ミリメートルのカルシウムおよびマグネシウムフリー溶液に移し、外植と空気水界面との接触を避けるように注意してください。その後、プレートの中央にすべての外植物が集まり、組織が解体できるように室温で1時間サンプルをインキュベートするように皿をそっと渦巻きます。このインキュベーション中に、最後の2つの胚をゲンタマイシンでMMRの2番目の皿に移し、これらの標本が乱れなくなるのを可能にするために皿を覆う。インキュベーションの最後に、スーパー接着剤を使用して、35ミリメートルの細胞培養皿の底にマイクロルールドカバースリップを取り付け、P100マイクロピペットを使用して解約したエクスプラントを収集します。ピペットを細胞培養皿の表面に近い浅い角度で保持し、ピペットチップを内側に向けたグリッドの隅に配置し、グリッド領域全体に細胞懸濁液をしっかりと排出します。理想的には、細胞は密な、密なクラスターに落ち着きます。細胞を室温で1時間プレートに付着させます。細胞が沈降している間、兄弟制御胚の発達段階を決定し、記録する。インキュベーションの最後に、サンプル皿を光保護された場所に移動させ、皿の端から100マイクロリットルの溶液を吸引する。この溶液を、サンプル皿にフルボリュームを戻す前に、新たに調製したFluo-4 AM Pluronic F127酸溶液を上下ピペット処理して7マイクロリットルと混合します。軽く旋回して、プレートをアルミニウムホイルで混ぜて覆います。室温で1時間後、外植培養皿上清の1ミリリットルをカルシウム溶液の新鮮な2ミリモルの3ミリリットルに置き換える。その後、上清の3ミリリットルを3ミリリットルの新鮮なカルシウム溶液でさらに2回交換します。外植内のカルシウム活性イメージングの場合、サンプルプレートを周囲光暴露から保護された反転共焦点顕微鏡のステージに配置し、マーカーを使用してプレートの前点にラベルを付け、その後のイメージングセッションで同じ視野を見つけることができます。目的の 10 倍と 20 倍を使用して、顕微鏡下でサンプルを見つけ、セル密度は高いが、細胞が凝集しているか、個別に区別することが困難な適切な視野を選択します。グリッド罫線のカバースリップが見えるように顕微鏡の焦点を調整し、必要に応じて識別可能な数がフレームに入るまで元の視野を変更します。グリッド罫線のカバースリップにフォーカスを設定し、選択した視野の明るい視野画像をフォーカスのある状態で、選択した視野の明るい視野画像を取得します。グリッド付きカバースリップと視野の明確な画像がないと、後で生成する魚の画像のセルを登録することはできません。その後、488ナノメートルのレーザーでサンプルを照らします。2 時間のイメージの場合、イメージを取得するために構成を実行する前に、スキャン時間が 3.93 秒の 901 フレームを 8 秒の間隔で記録するようにイメージ構成を変更します。イメージングが完了したら、顕微鏡段階からプレートを取り出し、培養の開始時に兄弟対照胚の発達段階を記録するように注意して、室温で2時間培養するために1X MEMFAの1ミリリットルで培養上清を交換します。実験で記録されたすべての細胞の痕跡を含む複合プロットの視覚化により、バルクまたは母集団の測定値がスパイク動作のより微妙なパターンをどの程度隠すことができるかを明らかにします。個々の細胞の記録されたプロファイルが単離されると、神経前駆細胞の不規則なスパイク活性特性の例が明確に同定され得る。この複雑さを定量化するために、さまざまなパラメータを含むさまざまなデータ分析方法を適用して、スパイクを定義できます。プレートが大まかに取り扱われる場合や、その場での蛍光化中に強引に行われる場合、細胞をプレート表面から外して、細胞が画像間で一致することが不可能になります。この中断が視野の一部のセルにのみ影響する場合でも、画像内の一部のセルを検出して割り当てることは可能です。ただし、ハイブリダイゼーションを慎重に行い、画像間で失われたり再配置されたりする細胞が少ない実験から、データの最大量が得られます。神経前駆細胞マーカー遺伝子の発現とカルシウム活性を照合する実験の結果は、カルシウム活性と神経伝達物質表現型の特定のパターンとの間の多数の関連を明らかにすることができる。このデータを使用すると、研究者は単純なスパイクカウントに制限されるのではなく、これらの動的カルシウムパターンのより複雑な特徴と遺伝子発現との関係を調査することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

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