Name: fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Vi takker Wendy Herbst og Lindsay Schleifer for deres bidrag til utviklingen av disse protokollene. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 og 1R15HD096415-01) til MSS.

<ol>
	<li>Humeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+cell+cycle:+Progression+or+death.">Calcium signaling and cell cycle: Progression or death.</a> Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).</li><li>Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+toolkit+reveals+the+role+of+Ca2++sparklets+in+coordinated+cell+migration.">Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration.</a> PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).</li><li>Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+death:+the+calcium-apoptosis+link.">Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).</li><li>Pham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++and+Mg2++module+conformational+dynamics+and+stability+of+downstream+regulatory+element+antagonist+modulator.">Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator.</a> Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).</li><li>Smedler, E., Uhl&#233;n, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+decoding+of+calcium+oscillations.">Frequency decoding of calcium oscillations.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).</li><li>Moreau, M., N&#233;ant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+coding+and+decoding+strategies+for+the+specification+of+neural+and+renal+precursor+cells+during+development.">Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development.</a> Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).</li><li>Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+functions+as+a+working+memory+of+Ca2++signals+in+decoding+Ca2++oscillation.">NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation.</a> EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).</li><li>Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Control+of+Calcium+Oscillation+Waveform+Defines+NFAT+as+an+Integrator+of+Calcium+Load.">Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load.</a> Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).</li><li>Li, L., Stefan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Le+Nov&#232;re+N.+Calcium+input+frequency,+duration+and+amplitude+differentially+module+the+relative+activation+of+calcineurin+and+CaMKII.">Le Nov&#232;re N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII.</a> PLoS One. 7 (9), 43810 (2012).</li><li>Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+tuning:+Competition's+role+in+setting+the+frequency-dependence+of+Ca2+-dependent+proteins.">Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins.</a> PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820 (2017).</li><li>Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Tuning+Among+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Proteins:+Analysis+of+in+silico+Model+Robustness+and+Parameter+Variability.">Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).</li><li>Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+neuronal+calcium+spikes+during+early+differentiation.">Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).</li><li>Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+homeostatic+specification+of+transmitter+expression+in+embryonic+neurons.">Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons.</a> Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).</li><li>Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+Global+Spontaneous+Calcium+Events+Regulate+Neurite+Outgrowth+and+Onset+of+GABAergic+Phenotype+during+Neural+Precursor+Differentiation.">Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).</li><li>Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Waves+Propagate+through+Radial+Glial+Cells+and+Modulate+Proliferation+in+the+Developing+Neocortex.">Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).</li><li>Nieuewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).</li><li>Paudel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Activity+Dynamics+Correlate+with+Neuronal+Phenotype+at+a+Single+Cell+Level+and+in+a+Threshold-Dependent+Manner.">Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880 (2019).</li><li>Marken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Markovian+Entropy+Measure+for+the+Analysis+of+Calcium+Activity+Time+Series.">A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series.</a> PLoS One. 11 (12), 0168342 (2016).</li><li>Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+Correction+with+Asymmetric+Least+Squares+Smoothing.">Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing.</a> Leiden University Medical Centre Report. , (2005).</li><li>Guemez-Gamboa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell-autonomous+mechanism+of+activity-dependent+neurotransmitter+switching.">Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching.</a> Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).</li><li>Paredes, R., Madelaine, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li></ol>

Ingen interessekonflikter erklært.

Karakteristiske mønstre av kalsiumaktivitet har blitt observert i cellene som utgjør det utviklende nervesystemet, med bestemte typer aktivitet forbundet med forskjellige neurodevelopmentale prosesser. Imidlertid krever ytterligere forståelse av mekanismene som disse informasjonstette aktivitetsmønstrene oversettes til transkripsjonelle svar, informasjon om kalsiumaktivitet og genuttrykk som samles inn med encellede oppløsning. Mens systemer som viser mer stereotypisk kalsiumaktivitet, som modne nevroner, med rimelighet kan sammenlignes på et bulknivå, maskeres de uregelmessige mønstrene som karakteriserer det embryonale nervesystemet lett av mindre presise opptak.
Det eksperimentelle rammeverket som er etablert i denne protokollen, kan enkelt tilpasses et bredt utvalg av celletyper og fluorescerende journalister. Vev som inneholder nesten alle celletyper eller kombinasjonav celletyper kan dissekeres fra en modellorganisme av interesse og belagt for encellede avbildning. I tillegg til å tillate celleidentifikasjon og isolere effekten av celleautonome prosesser, gjør en primær cellekulturtilnærming at eksperimentereren kan definere mediekomponenter etter ønske. For eksempel har eksperimenter som sammenligner aktiviteten til nevronale forløpere i 2 mM Ca2 + løsning blitt utført for å undersøke om forholdet mellom spike frekvens og nevrotransmitter fenotype i embryonale ryggmargen kan rekapituleres uten påvirkning av celle-celle interaksjoner13,20.
Mens denne protokollen utnytter fluorescerende markør Fluo4-AM for å oppdage intracellulær kalsiumaktivitet, avhengig av utvalgskriteriene, kan brukerne velge andre kommersielt tilgjengelige markører21, inkludert genetisk kodede kalsiumindikatorer. På samme måte kan alternative markører brukes til å overvåke dynamiske endringer i konsentrasjonen av en ion av interesse (inkludert K+,Na+og Zn2+), membranpotensial eller cellulær pH. Bildeinnstillinger og bildevarighet kan endres etter behov.
Selv om vi korrelerte kalsiumaktivitet og nevronal fenotype som et bestemt program, gjelder denne metoden også for en rekke andre cellulære egenskaper. For eksempel kan fluorescens i situ hybridisering utføres med sonder mot ethvert gen av interesse, inkludert nevronal markør ChAT eller transkripsjonsfaktoren Engrailed, slik at sensitiv påvisning av et passelig panel av mRNA-arter. Disse sondene kan utformes for å være isoform-spesifikke, som støtter ytterligere målspesifisitet hvis ønskelig. Dobbel FISK kan utføres ved hjelp av sonder konjugert til flere to forskjellige fluoropforer, slik at samtidig vurdering av uttrykket av flere gener. Imidlertid er de ekstra vaskene som kreves av denne typen eksperiment forbundet med økt sjanse for celletap eller bevegelse og krever erfaring og delikatesse som skal utføres med hell.
Uavhengig av eventuelle eksperimentspesifikke endringer som er gjort i denne protokollen, er det flere viktige trinn som krever nøye oppmerksomhet. Desseksjoner bør utføres med forsiktighet for å fjerne alt forurensende vev eller cellepopulasjoner; fordi romlig mønster går tapt når eksplantene er dissosiert, vil eventuelle gjenværende celler fra nærliggende vev bli ispedd og umulig å skille fra cellene av interesse. Etter at cellene er belagt, bør prøvene håndteres så forsiktig som mulig for å hindre at celler løsner. Viktigst av alt betyr dette at alle løsningsendringer bør utføres sakte og forsiktig, med pipetten plassert på kanten av platen når oppløsningen fjernes og legges til. Dette vil sikre at cellene trygt kan identifiseres i både kalsium- og FISH-bilder. Hvis celler forstyrres under behandlingen, kan det være umulig å identifisere noen eller alle de tilsvarende cellene mellom de to bildene. Vi anbefaler at du bruker disse oppgavene på siden av forsiktighet med disse oppgavene, slik at bare entydig tilsvarende celler brukes til videre analyse.
Avhengig av det biologiske spørsmålet som tas opp, kan en rekke analysetilnærminger være hensiktsmessige. Kalsiumaktivitet i tidsserien kan behandles og kvantifiseres på en rekke måter, med fleksibilitet i valg av de-trending parametere, analyseberegninger og analyseparametere (for eksempel % av baseline terskelen som brukes til å definere en kalsiumpigg). Sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og nivå av genuttrykk kan trekkes ved å analysere genuttrykk som en absolutt eller relativ fluorescensverdi hentet fra FISH-bildet. Alternativt kan sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk (tilstedeværelse/fravær) trekkes ved å definere en fluorescensterskel for positivt genuttrykkssignal og tildele "ja" eller "nei" identifikatorer til individuelle celler. Som helhet gir dette eksperimentelle skjemaet en utrolig fleksibel rørledning for innsamling og foreløpig analyse av tidsseriedata i forbindelse med cellesamsvarende genuttrykksdata. Slike eksperimenter vil være avgjørende for bedre å forstå de komplekse relasjonene mellom cellulær dynamikk og transkripsjonelle endringer, som eksemplifisert ved identifisering av kalsiumaktivitetsmønstre karakteristisk for hemmende-fated og eksitatorisk-fated nevronale forløpere i embryonale Xenopus laevis.

Gratis cytosolic kalsium er avgjørende for en rekke biologiske prosesser, alt fra cellespredning og migrasjon til apoptose og autofagi1,2,3. Innenfor disse banene kan kalsium utøve nedstrømseffekter på genuttrykk ved å samhandle med kalsiumbindende domener for å indusere konformasjonsendringer som modulerer proteinaktivitet og interaksjoner. For eksempel holdes en nevronal kalsiumsensor kjent som Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) i en utfoldet mellomliggende konformasjon når den er bundet av kalsium, og hindrer det i å samhandle med protein- og DNA-målene4. Utover å tjene som et enkelt signalmolekyl, gjør imidlertid den dynamiske karakteren av intracellulære kalsiumtransienter disse aktivitetsmønstrene å kode mer komplekse amplitude- eller frekvensbaserte signaler5,6. Kjernefysisk overføring av transkripsjonsfaktoren kjernefysisk faktor av aktiverte T-celler (NFAT) forsterkes av høyfrekvente kalsiumsvingninger, men hemmes av lavfrekvente svingninger7. Overbevisende, nyere arbeid har antydet at NFAT kan faktisk lydhør for kumulativ kalsiumeksponering8. Både kalsineurin og Ca2+/calmodulin-avhengig protein kinase II (CaMKII) viser også tydelige svar på kalsiumtransienter av en bestemt frekvens, varighet eller amplitude9. For å legge til et ekstra nivå av regulatorisk kompleksitet, beregningsmodeller tyder på at mange nedstrøms kalsiumbindende proteiner blir mer eller mindre frekvensavhengige som svar på tilstedeværelsen eller fraværet av bindende konkurrenter10,11.
Innenfor det utviklende nervesystemet er to hovedklasser av kalsiumaktivitetsatferd definert og forbundet med spesifikke biologiske prosesser. Kalsiumtilstrømninger klassifiseres som "pigger" hvis de oppstår i individuelle celler, når en toppintensitet på ~ 400% av grunnlinjen innen fem sekunder, og viser dobbel eksponentiell forfall12. Denne typen signal er forbundet primært med nevrotransmitter fenotype spesifikasjon13. I motsetning er "bølger" definert som langsommere, mindre ekstreme kalsiumtransienter der en celles intracellulære kalsiumkonsentrasjon stiger til ~ 200% av baseline over en periode på tretti sekunder eller mer, og forfaller deretter over flere minutter12. Disse signalene ofte forplante seg over flere nærliggende celler, og deres tilstedeværelse har vært forbundet med nøysom mekultur og cellespredning14,15. Men selv om disse to klassene er definert basert på karakteristiske kinetiske profiler, er det fortsatt uklart nøyaktig hvilke egenskaper ved disse mønstrene som faktisk oppdages av celler og oversettes av nedstrøms effektorer.
Å forstå forholdet mellom intracellulære kalsiumsvingninger og genuttrykk ville gi avgjørende innsikt i en av de regulatoriske mekanismene som sikrer riktig utvikling og mønster av nervesystemet. For dette formål har studier av den embryonale ryggmargen vist at økt kalsiumtoppaktivitet under utvikling er forbundet med høyere nivåer av hemmende nevroner, mens redusert kalsiumspikeaktivitet er forbundet med høyere nivåer av eksitatoriske nevroner13. Imidlertid har disse befolkningsnivå analysene ikke blitt brukt til å knytte kalsiumaktivitet med genuttrykk på et enkeltcellenivå.
Nærmer seg disse spørsmålene på nivået av enkeltcellen tilbyr flere forskjellige fordeler fremfor tidligere arbeid. For det første tillater evnen til å vurdere kalsiumaktivitet og genuttrykk i mange celler individuelt at det fulle repertoaret av distinkte aktivitetsmønstre observeres uten å bli obfuscated av en bulk-nivå måling. I tillegg betyr det å studere disse relasjonene i encelles primærkultur at celleautonome koblinger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk vil bli opprettholdt, mens interaksjoner som krever cellecellekommunikasjon vil bli avskaffet. Derfor gjør denne tilnærmingen at disse celle-autonome mekanismene kan studeres isolert. Det gjør det imidlertid også at rollen som ikke-celle-autonom kalsiumaktivitet skal belyses og forhøres. For eksempel kan celler dissekeres fra et embryo på nevrale platestadiet, dyrket til søskenkontroller når nevrale rørstadiet, og deretter sammenlignet med celler som har blitt nydissekert fra et neural-tube-stadium embryo. Dette tillater direkte sammenligning av celler som beholdt celle-celle kommunikasjon over en viktig utviklingsperiode til de der celle-celle kommunikasjon ble avskaffet.
I forsøket på å løse begrensningene i tidligere eksperimentelle tilnærminger, utviklet vi en protokoll som ville muliggjøre vurdering av både kalsiumaktivitet og genuttrykk i individuelle nevrale stamceller, noe som letter korrelasjonen av spesifikke aktivitetsmønstre med påfølgende differensieringsprogrammer. Neuralt vev ble dissekert fra Xenopus laevis på ulike stadier av neural utvikling, dissosiert i enkeltceller, og avbildet via konfokal mikroskopi i nærvær av en fluorescerende kalsiumindikator. Etter live-celle bildebehandling ble prøver løst og sayed via fluorescens in situ hybridization (FISH) for å oppdage uttrykk for et gen eller isoform av interesse. Viktigere, individuelle celler kan spores på tvers av begge bildeforsøk, noe som betyr at en celles kalsiumaktivitetsprofil og genuttrykksnivået kan knyttes til hverandre (Figur 1). Protokollen som rapporteres her er ment å undersøke sammenhenger mellom kalsiumaktivitetsmønstre og genuttrykk på tvers av embryonisk nevroutvikling i Xenopus laevis. Imidlertid kan det bredere eksperimentelle rammeverket (encellede time-course imaging etterfulgt av FISH og bildecoregistration) endres og brukes på nesten alle celletyper, fluorescerende reporter og et gen av interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Animal Husbandry &#38; Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHORULON (chorionic gonodotropin)</td>
			<td>Merck Animal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3160102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CLS5-25D-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For RNA Probe Generation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3359247910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl Precipitation Solution (7.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fluorescence In Situ Hybridization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GEPA13105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC349610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (Deionized)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC413480050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid, 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ACS125231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 &#956;m pore, 500 mL bottle capacity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis

Spontan intracellulær kalsiumaktivitet kan observeres i en rekke celletyper og foreslås å spille kritiske roller i en rekke fysiologiske prosesser. Spesielt er passende regulering av kalsiumaktivitetsmønstre under embryogenese nødvendig for mange aspekter ved virveldyr nevrale utvikling, inkludert riktig neural tube nedleggelse, synaptogenesis, og nevrotransmitter fenotype spesifikasjon. Mens observasjonen om at kalsiumaktivitetsmønstre kan variere i både frekvens og amplitude antyder en overbevisende mekanisme der disse fluksene kan overføre kodede signaler til nedstrøms effektorer og regulere genuttrykk, eksisterende tilnærminger på befolkningsnivå har manglet presisjonen som er nødvendig for å utforske denne muligheten ytterligere. Videre begrenser disse tilnærmingene studier av rollen til cellecelleinteraksjoner ved å utelukke evnen til å analysetilstanden til nevronal bestemmelse i fravær av cellecellekontakt. Derfor har vi etablert en eksperimentell arbeidsflyt som kombinerer tidsforløp kalsiumavbildning av dissosierte nevronale explants med en fluorescens i situ hybridiseringanalyse, slik at entydig korrelasjon av kalsiumaktivitetsmønster med molekylær fenotype på et enkeltcellenivå. Vi var vellykket i stand til å bruke denne tilnærmingen til å skille og karakterisere spesifikke kalsiumaktivitetsmønstre forbundet med å differensiere nevrale celler og nevrale stamceller, henholdsvis; utover dette kan imidlertid det eksperimentelle rammeverket som er beskrevet i denne artikkelen, lett tilpasses for å undersøke sammenhenger mellom enhver aktivitetsprofil i tidsserien og uttrykk for et gen eller gener av interesse.

Et vellykket eksempel på dissosierte celler tilberedt for kalsiumavbildning kan ses i figur 2A. Celler er tett belagt, slik at den maksimale mengden informasjon som skal samles inn fra hvert bilde, men ikke så tett belagt at enkelte celler ikke kan trygt skilles fra hverandre. Fluorescens oppdages for hver definerte celle i løpet av 2 t bildeperioden. Visualisering av et sammensatt plott som inneholder sporene for alle celler registrert i et eksperiment, viser i hvilken grad bulk- eller populasjonsmålinger kan skjule mer nyanserte mønstre av piggatferd (figur 2B). Når de registrerte profilene til individuelle celler er isolert, kan eksempler på uregelmessig spiking aktivitet karakteristisk for nevrale stamceller tydelig identifiseres. I motsetning til modne nevroner viser embryonale nevronale celler uregelmessig, svært variabel og kompleks art av kalsiumaktivitet(figur 2B). For å kvantifisere denne kompleksiteten, er bruk av ulike dataanalysemetoder brukt17,18, inkludert ulike parametere for å definere en topp (figur 2C).
Vellykket fluorescens i situ hybridisering, inkludert vellykket design og syntese av en antisense mRNA-sonde, kan vurderes ved å sammenligne den eksperimentelle platen mot en bakgrunnskontroll inkubert med en ikke-bindende følelse RNA-kontroll (Figur 3A,B). En positiv sondekontroll kan også utføres ved å behandle en celletype som er kjent for å uttrykke målet mRNA på påviselige nivåer.
Identifisering av samme celle på tvers av kalsium- og FISH-avbildning krever at cellene beholder omtrent samme posisjon under sondehybridisering og prosessering. Hvis platene håndteres grovt eller vasker utføres for kraftig, celler kan løsnes fra plateoverflaten og enten tapt når løsningen kastes eller deponeres på et annet sted på platen, noe som gjør det umulig for dem å bli matchet på tvers av bilder (Figur 4A). Hvis denne forstyrrelsen bare påvirker noen av cellene i synsfeltet, kan det fortsatt være mulig å oppdage og tilordne noen celler i bildet (Figur 4B). Imidlertid er den maksimale mengden data hentet fra et eksperiment der FISH utføres nøye og få celler går tapt eller flyttes mellom bilder (Figur 4C).
Når data er samlet inn for å beskrive både kalsiumaktiviteten og genuttrykket til et rimelig antall celler på utviklingsstadiet(e) av interesse, kan ytterligere analyser utføres for å vurdere sammenhenger mellom disse to funksjonene (figur 1). En rekke beregninger har blitt brukt til å kvantifisere kalsiumaktivitetsmønstre, inkludert topptelling/frekvens, gjennomsnittlig effekt, Hurst eksponent estimering og markovisk entropimåling17,18. Genuttrykk kan defineres kvantitativt av absolutt fluorescensnivå eller graderes på en binær (ja/nei) skala, avhengig av de eksperimentelle spørsmålene som tas opp.
Resultater fra eksperimenter som samler kalsiumaktivitet med uttrykk for nevrale stamcellemarkørgener viste mange sammenhenger mellom spesifikke mønstre av kalsiumaktivitet og nevrotransmitterfenotyper. På nevrale platestadiet (trinn 14) viser GABAerge celler som uttrykker den hemmende nevronmarkøren gad1.1 kalsiumaktivitet som er mer vanlig og høyere amplitude enn for celler som mangler gad1.1-uttrykk (figur 5A). Videre, mens disse gad1.1-uttrykke nde celler er forbundet med høyere nivåer av høy amplitude spiking, lav amplitude spiking er hyppigere i glutamatergic celler som uttrykker eksitatoriske nevron markør slc17a7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg"> Figur 1: Skjematisk av eksperimentell arbeidsflyt. Skala bar = 100 μm. Bilder i panel3-5 ble tatt fra Paudel et al. (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg"> Figur 2: Kalsiumbildebehandling og eksempelaktivitetsprofiler. (A) Intracellulær kalsiumaktivitet som rapportert av Fluo4-AM. Hvert 2 h-bilde består av 901 rammer, med ett representativt bilde show her. (B) Sammensatt plott av fluorescens intensitet over tid i alle celler innenfor det avbildede synsfeltet. Sporene indikerer tydelig fotobleking av indikatordye (Fluo4) overtid. Raster plottet øverst til venstre viser representative spor av kalsiumaktivitet etter bruk av en de-trending algoritme utviklet av Eilers og Boelen19, hvor celler vist her viser variert mønster av spiking atferd. (C) Anvendelse av forskjellige terskler (150% og 200% av baseline, hvor grunnlinjen er gjennomsnittet av avtrendede fluorescerende intensitet) for å definere en topp (grønne og blå piler). Skala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg"> Figur 3: FISH-bildebehandling. (A) FISH utført med en ikke-bindende følelse RNA sonde som en negativ kontroll. Bildeinnstillinger er justert slik at ingen celler vises fluorescerende. Noen synsfelt kan omfatte ikke-celleavfall med litt fluorescens, for eksempel sett øverst til høyre og nederst til høyre i (A); disse kan ignoreres med det formål å bakgrunnsinnstilling. (B) De samme bildeinnstillingene brukes deretter til å bilde en eksperimentell plate (antisense RNA-sonde). Fluorescens under disse forholdene tilsvarer genuttrykk over bakgrunnen. Skala bar = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg"> Figur 4: Bildeoverlegg og samtidig registrering. Skjematiske representasjoner av en prøve avbildet for kalsiumaktivitet (celler representert ved fylte grønne sirkler) og etter FISH (celler representert ved skyggefulle røde sirkler). (A) Celler som har beveget seg betydelig under prøvehåndtering og behandling, kan ikke identifiseres på en pålitelig måte på tvers av de to bildene. (B) Celleavbrudd kan bare påvirke noen celler i synsfeltet. Noen celler kan tydelig identifiseres i begge bildene, mens andre ikke kan trygt matches. (C) Hvis prøvene håndteres nøye, vil de fleste celler forbli uforstyrret og kan identifiseres i begge bildene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg"> Figur 5: Et eksempel på anvendelse av denne metoden, boxplots som viser sammenhenger mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk (GABA og Glut for gener gad1.1 og slc17a7 henholdsvis) i neural plate stadium Xenopus laevis. På stadium 14 viser gad1.1-postive celler (GABA) høyere amplitude og mer regelmessig kalsiumaktivitet som definert av (A) Markovian entropy18 og (B)spike teller ved hjelp av terskler 125%, 150%, 200% og 300% av gjennomsnittet av de-trended fluorescerende intensitet (baseline)17 enn slc17a7 positive celler (Glut). Stjerner indikerer statistisk signifikante forskjeller i henhold til både Bonferroni-korrigert to-prøve Kolmogorov-Smirnov Test (p < 0,05) og Cohens d statistikk for effektstørrelse (n = 5 kulturer og > 100 celler; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). Figuren ble trukket tilbake og tilpasset fra datasett hentet fra Paudel et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Vi presenterer en todelt protokoll som kombinerer fluorescerende kalsiumavbildning med in situ hybridisering, slik at eksperimentereren kan korrelere mønstre av kalsiumaktivitet med genuttrykksprofiler på et enkeltcellenivå.

Fluorescerende kalsiumavbildning og påfølgende in Situ hybridisering for nevronal forløper karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Denne protokollen kan brukes til å korrelere kalsiumaktivitetsmønstre med genuttrykk på enkeltcellenivå som gir forskere mulighet til å undersøke nye spørsmål om forholdet mellom disse to funksjonene. I motsetning til tidligere tilnærminger, som vanligvis studerer hele vev, zoomer vår teknikk inn til enkeltcellenivået slik at vi kan vurdere celle autonome relasjoner mellom kalsiumaktivitet og genuttrykk. Begynn med UV sterilisere to 35 millimeter plast Petri retter og en 35 millimeter celle kultur parabolen i ca 30 minutter.Arbeider i laminær strømningshette, tilsett 10 milliliter to millimolar kalsiumløsning til hver av to 50 milliliter plast koniske rør, en UV-sterilisert petriskål og UV-sterilisert cellekulturskål. Tilsett to milliliter kalsium- og magnesiumfri oppløsning til den andre UV-steriliserte petriskålen og fyll to 100 millimeter plast Petri retter og en 35 millimeter plast Petri parabolen med 0,1X MMR supplert med gentamicin. Fyll deretter en 60 millimeter plast petriskål med 70% etanol.Umiddelbart før disseksjonen, bland grundig 0,01 gram kollagen B i ett rør med kalsiumoppløsning. Tilsett løsningen til en ny 60 millimeter plast Petriskål og bruk et dissekeringsmikroskop for å identifisere embryoer i ønsket utviklingsstadium. Bruk en steril overføringspipette til å flytte minst seks passende embryoer til en 100 millimeter plate som inneholder MMR pluss gentamicin.Flytt deretter ett embryo fra holdeplaten til den andre 100 millimeter platen av MMR pluss gentamicin og legg denne disseksjonsplaten under mikroskopet. Bruk et par stumpe tang for å stabilisere embryoet, fjern forsiktig vitellinmembranen rundt embryoet med et par fine tang. Når hele membranen er fjernet, bruk de fine tangene til å klemme embryoet langs den fremre bakre aksen for å skille de dorsale og ventrale områdene.Bruk den nye sterile overføringspipetten til å overføre ryggdelen til 60 millimeterplaten med kollagenøs oppløsning i ett til to minutter før du forsiktig overfører prøven tilbake til disseksjonsplaten. For å fullføre disseksjonen, fjern forsiktig alle de gjenværende endodermale og mesodermiske forurensningene fra det presumptive nevrale vevet i ectoderm og overfør forsiktig explant til 35 millimeterplaten kalsiumoppløsning. Når ytterligere tre utskred er samlet inn, kan du bruke en P1000-mikropipette til å overføre alle fire explants til 35 millimeter plate kalsium og magnesiumfri løsning som tar vare på for å unngå kontakt mellom explants og luftvannsgrensesnittet.Virvle deretter forsiktig parabolen slik at alle explants klyngen i midten av platen og inkubere prøvene i en time ved romtemperatur for å tillate vevene å dissosiere. Under denne inkubasjonen, overfør de to siste embryoene til den andre parabolen av MMR med gentamicin, og dekk parabolen slik at disse prøvene kan utvikle seg uforstyrret. På slutten av inkubasjonen, bruk superlim til å feste en mikrostyrt dekkslip til bunnen av 35 millimeter cellekulturfatet og bruk en P100 mikropipette for å samle de dissosierte explants.Hold pipetten i en grunn vinkel nær overflaten av cellekulturfatet, plasser pipettespissen i hjørnet av gitteret innover og utvis cellefjæringen godt over det gitte området. Ideelt sett vil cellene bosette seg i en stram, tett klynge. La cellene holde seg til platen i en time ved romtemperatur.Mens cellene bosetter seg, bestemmer og registrerer utviklingsstadiet av søskenkontrollembryoene. På slutten av inkubasjonen flytter du prøvefatet til et lett beskyttet sted og aspirerer 100 mikroliter oppløsning fra kanten av parabolen. Bland denne løsningen med syv mikroliter av en nylaget Fluo-4 AM Pluronic F127 syreoppløsning med opp og ned pipettering før du returnerer hele volumet til prøvefatet.Virvle forsiktig for å blande og dekke platen med aluminiumsfolie. Etter en time ved romtemperatur, erstatt en milliliter av den ekspanderende kulturretten supernatant med tre milliliter frisk to millimolar kalsiumløsning. Deretter erstatter du tre milliliter supernatant med tre milliliter frisk kalsiumløsning to ganger til.For avbildning av kalsiumaktivitet innenfor eksplantene plasserer du prøveplaten på scenen i et omvendt konfokalmikroskop beskyttet mot eksponering for omgivelseslys og bruker en markør til å merke frontpunktet på platen slik at det samme synsfeltet finnes ved påfølgende bildeøkter. Bruk målene for 10 og 20 ganger til å finne en prøve under mikroskopet og velg et passende synsfelt som er celletett, men ikke så tett at cellene er klumpete eller vanskelig å skille mellom individer. Juster mikroskopfokuset slik at den rutenettstyrte dekkslippen er synlig, og endre det opprinnelige synsfeltet til et identifiserbart tall er i ramme etter behov.Få et lyst feltbilde av det valgte visningsfeltet med det rutenettstyrte omslagsglasset i fokus og et lyst feltbilde av det valgte visningsfeltet med cellene i fokus. Uten et klart bilde av den gridded coverslip og synsfeltet, vil du ikke kunne samregistrere cellene dine med de i fiskebildene du vil generere senere. Belys deretter prøvene med en 488 nanometer laser.For et to timers bilde endrer du bildekonfigurasjonen for å ta opp 901-bilder med en skannetid på 3,93 sekunder i et intervall på åtte sekunder før du kjører konfigurasjonen for å hente bildet. Når bildet er fullført, fjern platen fra mikroskopstadiet og erstatt kultursupernatanten med en milliliter 1X MEMFA i en to timers inkubasjon ved romtemperatur, og ta vare på å registrere utviklingsstadiet til søskenkontrollembryoene i begynnelsen av inkubasjonen. Visualiseringen av et sammensatt plott som inneholder spor for alle cellene som er registrert i et eksperiment, avslører i hvilken grad bulk- eller befolkningsmålinger kan skjule mer nyanserte mønstre av spiking-atferd.Når de registrerte profilene til individuelle celler er isolert, kan eksempler på den uregelmessige spikingaktiviteten som er karakteristisk for nevrale stamceller, tydelig identifiseres. For å kvantifisere denne kompleksiteten kan ulike dataanalysemetoder brukes, inkludert ulike parametere for å definere en topp. Hvis platene håndteres grovt eller vaskene utføres for kraftig under fluorescerende in situ hybridisering, kan cellene løsnes fra plateflatene, noe som gjør det umulig for cellene å bli matchet på tvers av bilder.Hvis denne forstyrrelsen bare påvirker noen av cellene i synsfeltet, kan det fortsatt være mulig å oppdage og tilordne noen av cellene i bildet. Imidlertid oppnås den maksimale mengden data fra et eksperiment der hybridiseringen utføres nøye og få celler går tapt eller flyttes mellom bilder. Resultater fra eksperimenter som kollerer kalsiumaktivitet med uttrykk for nevrale stamcellemarkørgener kan avsløre mange sammenhenger mellom spesifikke mønstre av kalsiumaktivitet og nevrotransmitterfenotyper.Med disse dataene kan forskere undersøke mer komplekse trekk ved disse dynamiske kalsiummønstrene og relasjonene til genuttrykk i stedet for å være begrenset til enkel topptelling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forstå Tidlig organogenesis hjelp av en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protocol i<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

En optogenetic Approach for Assessing Dannelse av nevronkoblinger i en Co-kultur System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulasjon og<em&gt; In Vitro</em&gt; Modning av<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oocytter, etterfulgt av Intracytoplasmatisk Sperm Injection, for å studere embryoutvikling

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulære strukturer i Living Sebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Teknikken til Target Mikroinjeksjon til utviklings<em&gt; Xenopus</em&gt; Nyre

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering for Sammenligning av genekspresjon domener i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Kalsium i<em&gt; Drosophila</em&gt; På Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i sebrafisk gjennom kombinert protokollen hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount i Situ hybridisering for Astyanax embryo

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping og kvantifisering av In Situ Hybridisering Farging i Sebrafisk

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...