Name: fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Agradecemos wendy Herbst e Lindsay Schleifer por suas contribuições para o desenvolvimento desses protocolos. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 e 1R15HD096415-01) para MSS.

<ol>
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Nenhum conflito de interesses declarado.

Padrões característicos de atividade de cálcio têm sido observados nas células que compõem o sistema nervoso em desenvolvimento, com tipos específicos de atividade associados a processos neurodesenvolvimentísticos distintos. No entanto, uma compreensão adicional dos mecanismos pelos quais esses padrões de atividade densas de informação são traduzidos em respostas transcrições requer informações sobre atividade de cálcio e expressão genética a serem coletadas com resolução unicelular. Embora sistemas que exibem atividade sucrotípica de cálcio, como neurônios maduros, possam ser razoavelmente ensaios em um nível a granel, os padrões irregulares que caracterizam o sistema nervoso embrionário são facilmente mascarados por gravações menos precisas.
A estrutura experimental estabelecida neste protocolo é facilmente adaptável a uma grande variedade de tipos de células e repórteres fluorescentes. Tecido contendo praticamente qualquer tipo celular ou combinação de tipos de células pode ser dissecado a partir de um organismo modelo de interesse e banhado para imagens unicelulares. Além de permitir a identificação celular e isolar o efeito dos processos autônomos de células, uma abordagem primária da cultura celular permite que o experimentador defina componentes de mídia como desejado. Por exemplo, experimentos comparando a atividade de precursores neuronais em solução de 2 mM Ca2+ foram realizados para investigar se as relações entre frequência de espigão e fenótipo neurotransmissor na medula espinhal embrionária podem ser recapituladas sem a influência das interações celular-célula13,20.
Enquanto este protocolo aproveita o marcador fluorescente Fluo4-AM para detectar atividade sucroalcelular, dependendo dos critérios de seleção, os usuários podem selecionar outros marcadores disponíveis comercialmente21,incluindo indicadores de cálcio geneticamente codificados. Da mesma forma, marcadores alternativos poderiam ser usados para monitorar mudanças dinâmicas na concentração de um íon de interesse (incluindo K+, Na+e Zn2+), potencial de membrana ou pH celular. As configurações de imagem e a duração da imagem podem ser modificadas conforme necessário.
Embora correlacionamos a atividade de cálcio e o fenótipo neuronal como uma aplicação específica, este método também é aplicável para uma variedade de outras propriedades celulares. Por exemplo, a fluorescência na hibridização situ pode ser realizada com sondas contra qualquer gene de interesse, incluindo o marcador neuronal ChAT ou o fator de transcrição Engrailed, permitindo a detecção sensível de um painel personalizável de espécies mRNA. Essas sondas podem ser projetadas para serem específicas do isoform, suportando especificidade sumida de alvo adicional, se desejar. Peixe duplo pode ser realizado usando sondas conjugadas a vários dois fluorofóbicos diferentes, permitindo a avaliação simultânea da expressão de múltiplos genes. No entanto, as lavas adicionais exigidas por esse tipo de experimento estão associadas a uma maior chance de perda ou movimento celular e requerem experiência e delicadeza a serem realizadas com sucesso.
Independentemente de quaisquer modificações específicas do experimento feitas neste protocolo, existem vários passos-chave que requerem atenção cuidadosa. As dissecções devem ser realizadas com cuidado para remover todos os tecidos contaminantes ou populações celulares; porque a padronização espacial é perdida quando as explantas são dissociadas, todas as células remanescentes dos tecidos vizinhos ficarão intercaladas e indistinguíveis das células de interesse. Depois que as células são banhadas, as amostras devem ser manuseadas da forma mais suave possível para evitar que as células sejam desalojadas. Mais importante, isso significa que todas as mudanças de solução devem ser realizadas de forma lenta e cuidadosa, com a pipeta colocada na borda da placa quando a solução está sendo removida e adicionada. Isso garantirá que as células possam ser identificadas com confiança em imagens de cálcio e PEIXE. Se as células forem interrompidas durante o processamento, pode ser impossível identificar algumas ou todas as células correspondentes entre as duas imagens. Aconselhamos errar no lado da cautela com essas tarefas, de tal forma que apenas células inequivocamente correspondentes são usadas para análise si só.
Dependendo da questão biológica que está sendo abordada, uma variedade de abordagens de análise podem ser apropriadas. A atividade de cálcio em série de tempo pode ser processada e quantificada de várias maneiras, com flexibilidade experimentadorna na escolha de parâmetros de destendência, métricas de análise e parâmetros de análise (por exemplo, o % do limiar de linha de base usado para definir um pico de cálcio). Correlações entre a atividade de cálcio e o nível de expressão genética podem ser desenhadas analisando a expressão genética como um valor absoluto ou relativo de fluorescência extraído da imagem FISH. Alternativamente, as correlações entre a atividade de cálcio e a expressão genética (presença/ausência) podem ser desenhadas definindo um limiar de fluorescência para sinal de expressão genética positiva e atribuindo identificadores "sim" ou "não" às células individuais. Como um todo, este esquema experimental fornece um pipeline incrivelmente flexível para a coleta e análise preliminar de dados da série de tempo em conjunto com dados de expressão genética compatível com células. Tais experimentos serão fundamentais para entender melhor as complexas relações entre dinâmicacelular e mudanças transcritivas, como exemplificado pela identificação de padrões de atividade de cálcio característicos de precursores neuronais com gordura inibitória e excitatória em laevis xenopus embrionárias.

O cálcio citosólico livre é fundamental para uma variedade de processos biológicos, que vão desde a proliferação celular e migração até apoptose e autofagia1,2,3. Dentro dessas vias, o cálcio pode exercer efeitos a jusante na expressão genética interagindo com domínios de ligação de cálcio para induzir mudanças conformaçãois que modulam a atividade e as interações proteicas. Por exemplo, um sensor neuronal de cálcio conhecido como O Modulador Antagonista do Elemento Regulatório Downstream (DREAM) é mantido em uma conformação intermediária desdobrada quando vinculado ao cálcio, impedindo-o de interagir com suas metas de proteína e DNA4. Além de servir como uma molécula de sinalização simples, no entanto, a natureza dinâmica dos transitórios intracelulares de cálcio permite que esses padrões de atividade codificassem sinais mais complexos baseados em amplitude ou frequência5,6. A translocação nuclear do fator de transcrição fator nuclear fator nuclear das células T ativadas (NFAT) é reforçada por oscilações de cálcio de alta frequência, mas inibida por oscilações de baixa frequência7. Convincentemente, trabalhos recentes sugerem que o NFAT pode realmente responder à exposição cumulativa de cálcio8. Tanto a calcineurina quanto a proteína Ca2+/calmodulin-dependente de proteínas kinase II (CaMKII) também apresentam respostas distintas aos transitórios de cálcio de uma frequência, duração ou amplitudeespecífica 9. Para adicionar um nível adicional de complexidade regulatória, os modelos computacionais sugerem que muitas proteínas de ligação de cálcio a jusante tornam-se mais ou menos dependentes de frequência em resposta à presença ou ausência de concorrentes vinculantes10,11.
Dentro do sistema nervoso em desenvolvimento, duas classes principais de comportamentos de atividade de cálcio foram definidas e associadas a processos biológicos específicos. Os influxos de cálcio são classificados como "picos" se ocorrerem dentro de células individuais, atingem uma intensidade máxima de ~400% da linha de base em cinco segundos, e exibem dupla decadência exponencial12. Este tipo de sinal está associado principalmente à especificação do fenótipo neurotransmissor13. Em contraste, as "ondas" são definidas como transitórios de cálcio mais lentos e menos extremos em que a concentração intracelular de cálcio de uma célula sobe para ~200% da linha de base durante um período de trinta segundos ou mais, depois diminui ao longo de vários minutos12. Esses sinais geralmente se propagam em várias células vizinhas, e sua presença tem sido associada ao crescimento neurite e à proliferação celular14,15. No entanto, embora essas duas classes tenham sido definidas com base em perfis cinéticos característicos, ainda não está claro exatamente quais características desses padrões estão realmente sendo detectadas pelas células e traduzidas por efeitos a jusante.
Entender a relação entre oscilações intracelulares de cálcio e expressão genética forneceria uma visão crucial de um dos mecanismos regulatórios que garante o desenvolvimento adequado e a padronização do sistema nervoso. Para isso, estudos da medula espinhal embrionária demonstraram que o aumento da atividade do pico de cálcio durante o desenvolvimento está associado a níveis mais elevados de neurônios inibidores, enquanto a diminuição da atividade do pico de cálcio está associada a níveis mais elevados de neurônios excitatórios13. No entanto, esses ensaios em nível populacional não foram usados para associar a atividade de cálcio com a expressão genética em um nível unicelular.
Abordar essas questões no nível da única célula oferece várias vantagens distintas em relação ao trabalho anterior. Por um lado, a capacidade de avaliar a atividade de cálcio e a expressão genética em muitas células individualmente permite que o repertório completo de padrões de atividade distintos seja observado sem ser ofuscado por uma medição de nível a granel. Além disso, estudar essas relações na cultura primária unicelular significa que as ligações autônomas entre a atividade de cálcio e a expressão genética serão mantidas, enquanto as interações que requerem comunicação celular-célula serão revogadas. Portanto, essa abordagem permite que esses mecanismos autônomos sejam estudados isoladamente. No entanto, também permite que o papel da atividade de cálcio não-autônomo seja elucidado e interrogado. Por exemplo, as células podem ser dissecadas a partir de um embrião no estágio da placa neural, cultivada até que os controles dos irmãos atinjam o estágio do tubo neural e, em seguida, comparados com células que foram recentemente dissecadas a partir de um embrião em estágio neural-tubo. Isso permite a comparação direta das células que retiveram a comunicação celular-célula em um período de desenvolvimento fundamental para aqueles em que a comunicação celular-célula foi abolida.
Ao buscar abordar as limitações das abordagens experimentais anteriores, desenvolvemos um protocolo que permitiria a avaliação da atividade de cálcio e da expressão genética em células progenitoras neurais individuais, facilitando a correlação de padrões de atividade específicos com programas de diferenciação subsequentes. O tecido neural foi dissecado a partir de laevis xenopus em vários estágios do desenvolvimento neural, dissociado em células únicas, e imageed via microscopia confocal na presença de um indicador de cálcio fluorescente. Após a imagem de células vivas, as amostras foram fixadas e ensaios via fluorescência na hibridização situ (FISH) para detectar a expressão de um gene ou isoforme de interesse. É importante ressaltar que as células individuais podem ser rastreadas em ambos os experimentos de imagem, o que significa que o perfil de atividade de cálcio de uma célula e seu nível de expressão genética podem ser associados entre si(Figura 1). O protocolo relatado aqui tem o objetivo de sondar relações entre padrões de atividade de cálcio e expressão genética em neurodesenvolvimento embrionário em Xenopus laevis. No entanto, a estrutura experimental mais ampla (imagem de curso de tempo unicelular seguida de FISH e coregistro de imagem) pode ser modificada e aplicada a praticamente qualquer tipo de célula, repórter fluorescente e gene de interesse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Animal Husbandry &#38; Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHORULON (chorionic gonodotropin)</td>
			<td>Merck Animal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3160102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CLS5-25D-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For RNA Probe Generation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3359247910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl Precipitation Solution (7.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fluorescence In Situ Hybridization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GEPA13105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC349610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (Deionized)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC413480050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid, 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ACS125231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 &#956;m pore, 500 mL bottle capacity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis

A atividade espontânea de cálcio intracelular pode ser observada em uma variedade de tipos de células e é proposta para desempenhar papéis críticos em uma variedade de processos fisiológicos. Em particular, a regulação adequada dos padrões de atividade de cálcio durante a embriongênese é necessária para muitos aspectos do desenvolvimento neural vertebrado, incluindo fechamento adequado de tubos neurais, sinaptogênese e especificação do fenótipo neurotransmissor. Embora a observação de que os padrões de atividade de cálcio possam diferir tanto na frequência quanto na amplitude sugere um mecanismo convincente pelo qual esses fluxos podem transmitir sinais codificados para os efeitos a jusante e regular a expressão genética, existente abordagens de nível populacional não têm a precisão necessária para explorar ainda mais essa possibilidade. Além disso, essas abordagens limitam os estudos sobre o papel das interações celular-células, impedindo a capacidade de reafirmar o estado de determinação neuronal na ausência de contato celular-célula. Por isso, estabelecemos um fluxo de trabalho experimental que combina imagens de cálcio de lapso de tempo de explantas neuronais dissociadas com uma fluorescência no ensaio de hibridização situ, permitindo a correlação inequívoca do padrão de atividade de cálcio com molecular fenótipo em um nível de célula única. Conseguimos usar essa abordagem com sucesso para distinguir e caracterizar padrões específicos de atividade de cálcio associados a células neurais diferenciais e células progenitoras neurais, respectivamente; além disso, no entanto, a estrutura experimental descrita neste artigo poderia ser prontamente adaptada para investigar correlações entre qualquer perfil de atividade de série temporal e expressão de um gene ou genes de interesse.

Um exemplo bem sucedido de células dissociadas preparadas para imagens de cálcio pode ser visto na Figura 2A. As células são densamente banhadas, permitindo que a quantidade máxima de informações seja coletada de cada imagem, mas não tão densamente banhadas que as células individuais não podem ser confiantemente distintas umas às outras. A fluorescência é detectada para cada célula definida durante o período de imagem de 2h. A visualização de um enredo composto contendo os traços para todas as células registradas em um experimento revela o grau em que as medições a granel ou populacional podem obscurecer padrões mais nuances de comportamento espetado(Figura 2B). Quando os perfis registrados de células individuais são isolados, exemplos da atividade irregular característica das células progenitoras neurais podem ser claramente identificados. Ao contrário dos neurônios maduros, as células neuronais embrionárias apresentam natureza irregular, altamente variável e complexa de atividade de cálcio (Figura 2B). Para quantificar essa complexidade, a aplicação de diferentes métodos de análise de dados foi aplicada17,18, incluindo parâmetros diversos para definir um pico (Figura 2C).
Fluorescência bem-sucedida na hibridização situ, incluindo design bem sucedido e síntese de uma sonda antisense mRNA, pode ser avaliada comparando a placa experimental com um controle de fundo incubado com um controle de RNA de sentido não vinculante(Figura 3A,B). Um controle positivo da sonda também pode ser realizado processando um tipo de célula conhecido por expressar o alvo mRNA em níveis detectáveis.
A identificação da mesma célula através da imagem de cálcio e PEIXE exige que as células mantenham aproximadamente a mesma posição durante a hibridização e processamento da sonda. Se as placas forem manuseadas de forma mais ou as lavas forem executadas com muita força, as células podem ser desalojadas da superfície da placa e perdidas quando a solução é descartada ou depositada em um local diferente na placa, tornando impossível que elas sejam combinadas entre imagens(Figura 4A). Se essa interrupção afetar apenas algumas das células do campo de visão, ainda pode ser possível detectar e atribuir algumas células dentro da imagem (Figura 4B). No entanto, a quantidade máxima de dados é obtida a partir de um experimento no qual o PEIXE é realizado cuidadosamente e poucas células são perdidas ou reposicionadas entre imagens (Figura 4C).
Uma vez coletados dados para descrever tanto a atividade de cálcio quanto a expressão genética de um número razoável de células no estágio de desenvolvimento(s) de interesse, novas análises podem ser realizadas para avaliar correlações entre essas duas características (Figura 1). Várias métricas foram aplicadas para quantificar padrões de atividade de cálcio, incluindo contagem/frequência de pico, potência média, estimativa expoente hurst e medição de entropia markovian17,18. A expressão genética pode ser definida quantitativamente pelo nível absoluto de fluorescência ou classificada em uma escala binária (sim/não), dependendo das questões experimentais que estão sendo abordadas.
Resultados de experimentos que colam atividade de cálcio com a expressão de genes de marcadores progenitores neurais revelaram inúmeras associações entre padrões específicos de atividade de cálcio e fenótipos neurotransmissores. No estágio da placa neural (Estágio 14), as células GABAergicas expressando o marcador de neurônio inibidor gad1.1 exibem atividade de cálcio mais regular e mais alta do que a das células que carecem de expressão gad1.1 (Figura 5A). Além disso, enquanto essas células gad1.1-expressação estão associadas a níveis mais altos de espiagem de alta amplitude, o espiking de baixa amplitude é mais frequente em células glutamatergicas expressando o marcador de neurônio slc17a7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg"> Figura 1: Esquema de fluxo de trabalho experimental. Barra de escala = 100 μm. Imagens em painéis 3-5 foram tiradas de Paudel et al. (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg"> Figura 2: Imagem de cálcio e perfis de atividade de exemplo. (A) Atividade intracelular de cálcio conforme relatado pelo Fluo4-AM. Cada imagem de 2h é composta de 901 quadros, com um quadro representativo aqui. (B)Parcela composta de intensidade de fluorescência ao longo do tempo em todas as células dentro do campo de visão imagemd. Os traços indicam claramente o fotobranqueamento do dique indicador (Fluo4) horas extras. A trama de Raster no canto superior esquerdo mostra traços representativos da atividade de cálcio após a aplicação de um algoritmo de destendência desenvolvido por Eilers e Boelen19, onde as células aqui mostradas exibem um padrão diversificado de comportamento espetado. (C) Aplicação de diferentes limiares (150% e 200% da linha de base, onde a linha de base é a média de intensidade fluorescente destendência) para definir um pico (setas verdes e azuis). Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg"> Figura 3: Imagem de PEIXE. (A)FISH realizado com uma sonda RNA de sentido não vinculante como um controle negativo. As configurações de imagem foram ajustadas para que nenhuma célula pareça fluorescente. Alguns campos de visão podem incluir detritos não celulares com alguma fluorescência, como visto nos cantos superiores direito e inferior direito de (A); estes podem ser ignorados com o propósito de configuração de fundo. (B)As mesmas configurações de imagem são então usadas para visualizar uma placa experimental (sonda Antisense RNA). Fluorescência nessas condições corresponde à expressão genética acima do fundo. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg"> Figura 4: Sobreposição de imagem e co-registro. Representações esquemmáticas de uma amostra imaged para atividade de cálcio (células representadas por círculos verdes preenchidos) e depois de FISH (células representadas por círculos vermelhos sombreados). (A)As células que se moveram significativamente durante o manuseio e processamento de amostras não podem ser identificadas de forma confiável entre as duas imagens. (B)A interrupção celular pode afetar apenas algumas células no campo de visão. Algumas células podem ser claramente identificadas em ambas as imagens, enquanto outras não podem ser combinadas com confiança. (C) Se as amostras forem tratadas cuidadosamente, a maioria das células permanecerá intacta e poderá ser identificada em ambas as imagens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg"> Figura 5: Um exemplo de aplicação deste método, boxplots mostrando associações entre atividade de cálcio e expressão genética (GABA e Glut para genes gad1.1 e slc17a7, respectivamente) em fase de placa neural Xenopus laevis. Na etapa 14, as células gad1.1 postive (GABA) apresentam maior amplitude e atividade de cálcio mais regular definida por (A) entropia18 markoviana e (B) conta com limiares 125%, 150%, 200% e 300% da média da intensidade fluorescente desnatada (linha de base)17 do que as células positivas slc17a7 (Glut). As estrelas indicam diferenças estatisticamente significativas de acordo com tanto o Teste kolmogorov-Smirnov corrigido por Bonferroni (p < 0,05) quanto as estatísticas d de Cohen para o tamanho do efeito (n = 5 culturas e >100 células; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). O número foi redesenhado e adaptado a partir de conjunto de dados obtido sem Paudel et al.17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.</a>

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Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Apresentamos um protocolo de duas partes que combina imagens fluorescentes de cálcio com hibridização in situ, permitindo que o experimentador correlacione padrões de atividade de cálcio com perfis de expressão genética em um nível unicelular.

Imagem fluorescente de cálcio e subsequente hibridização em Situ para caracterização do precursor neuronal em xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Este protocolo pode ser usado para correlacionar padrões de atividade de cálcio com expressão genética no nível único celular capacitando pesquisadores a investigar novas questões sobre as relações entre essas duas características. Em contraste com abordagens anteriores, que normalmente estudam tecidos inteiros, nossa técnica se aproxima do nível celular único, permitindo-nos avaliar as relações autônomas celulares entre a atividade de cálcio e a expressão genética. Comece por UV esterilizando duas placas de Petri de plástico de 35 milímetros e uma placa de cultura celular de 35 milímetros por aproximadamente 30 minutos.Trabalhando na capa de fluxo laminar, adicione 10 mililitros de duas soluçãos de cálcio milimil para cada um dos dois tubos cônicos plásticos de 50 mililitros, uma placa de Petri esterilizada por UV e a placa de cultura celular esterilizada por UV. Adicione dois mililitros de solução livre de cálcio e magnésio à outra placa de Petri esterilizada por UV e encha duas placas de Petri de plástico de 100 milímetros e uma placa de Petri de plástico de 35 milímetros com 0,1X MMR suplementada com gentamicina. Em seguida, encha uma placa de Petri de plástico de 60 milímetros com 70% de etanol.Imediatamente antes da dissecção, misture completamente 0,01 gramas de colágeno B em um tubo de solução de cálcio. Adicione a solução a uma nova placa de Petri de plástico de 60 milímetros e use um microscópio de dissecação para identificar embriões do estágio de desenvolvimento desejado. Use uma pipeta de transferência estéril para mover pelo menos seis embriões apropriados em uma placa de 100 milímetros contendo MMR mais gentamicina.Em seguida, mova um embrião da placa de retenção para a segunda placa de 100 milímetros de MMR mais gentamicina e coloque esta placa de dissecção sob o microscópio. Usando um par de fórceps contundentes para estabilizar o embrião, retire cuidadosamente a membrana vitelline ao redor do embrião com um par de fórceps finos. Quando toda a membrana tiver sido removida, use os fórceps finos para beliscar o embrião ao longo do eixo posterior anterior para separar as regiões dorsal e ventral.Use a nova pipeta de transferência estéril para transferir a porção dorsal para a placa de 60 milímetros de solução colágena por um a dois minutos antes de transferir cuidadosamente o espécime de volta para a placa de dissecção. Para completar a dissecção, remova cuidadosamente toda a contaminação endodérmica e mesodérmica residual do tecido neural presunçoso do ectoderme e transfira suavemente a explanta para a placa de 35 milímetros de solução de cálcio. Quando mais três explantas forem coletadas, use uma micropipette P1000 para transferir todas as quatro explantas para a placa de 35 milímetros de solução livre de cálcio e magnésio, tomando cuidado para evitar qualquer contato entre as explantas e a interface de água do ar.Em seguida, gire suavemente o prato de modo que todas as explantas se aglomeram no centro da placa e incubam os espécimes por uma hora em temperatura ambiente para permitir que os tecidos se dissociem. Durante esta incubação, transfira os dois últimos embriões para o segundo prato de RMM com gentamicina, e cubra o prato para permitir que esses espécimes se desenvolvam sem serem perturbados. No final da incubação, use super cola para anexar um deslizamento de cobertura micro-governado ao fundo do prato de cultura celular de 35 milímetros e use uma micropipette P100 para coletar as explantas dissociadas.Segurando a pipeta em um ângulo raso perto da superfície do prato de cultura celular, posicione a ponta da pipeta no canto da grade voltada para dentro e expulse firmemente a suspensão celular através da área gridded. Idealmente, as células se estabelecerão em um aglomerado apertado e denso. Deixe as células aderirem à placa durante uma hora em temperatura ambiente.Enquanto as células estão se instalando, determine e regise o estágio de desenvolvimento dos embriões de controle de irmãos. No final da incubação, mova o prato de amostra para um local protegido pela luz e aspire 100 microliters de solução a partir da borda do prato. Misture esta solução com sete microlitadores de uma solução de ácido Fluo-4 AM Pluronic F127 recém-preparada com tubos para cima e para baixo antes de devolver o volume total ao prato de amostra.Gire suavemente para misturar e cobrir a placa com papel alumínio. Depois de uma hora em temperatura ambiente, substitua um mililitro do prato de cultura de plantas com três mililitros de dois milimiliar frescos de solução de cálcio. Em seguida, substitua três mililitros de supernascentes por três mililitros de solução de cálcio fresco mais duas vezes.Para a imagem de atividade de cálcio dentro das explantas, coloque a placa de amostra no estágio de um microscópio confocal invertido protegido da exposição à luz ambiente e use um marcador para rotular o ponto frontal da placa para que o mesmo campo de visão possa ser encontrado em sessões de imagem subsequentes. Use os objetivos 10 e 20 vezes para localizar uma amostra sob o microscópio e selecionar um campo de visão apropriado que seja denso celular, mas não tão denso que as células sejam agrupadas ou difíceis de distinguir individualmente. Ajuste o foco do microscópio para que o deslizamento de cobertura regido pela grade seja visível, alterando o campo de visão original até que um número identificável esteja no quadro conforme necessário.Obtenha uma imagem de campo brilhante do campo de visão selecionado com o deslizamento de cobertura regido pela grade em foco e uma imagem de campo brilhante do campo de visão selecionado com as células em foco. Sem uma imagem clara do deslizamento de cobertura gridded e do campo de visão, você não será capaz de co-registrar suas células com aquelas nas imagens de peixe que você vai gerar mais tarde. Em seguida, ilumine as amostras com um laser de 488 nanômetros.Durante uma imagem de duas horas, modifique a configuração de imagem para gravar 901 quadros com um tempo de varredura de 3,93 segundos em um intervalo de oito segundos antes de executar a configuração para adquirir a imagem. Uma vez que a imagem esteja completa, remova a placa do estágio do microscópio e substitua o supernascer de cultura por um mililitro de 1X MEMFA para uma incubação de duas horas à temperatura ambiente, tomando o cuidado de registrar o estágio de desenvolvimento dos embriões de controle de irmãos no início da incubação. A visualização de uma trama composta contendo traços para todas as células registradas em um experimento revela o grau em que as medições em massa ou populacionais podem obscurecer padrões mais nuances de comportamento spiking.Quando os perfis registrados de células individuais são isolados, podem ser claramente identificados exemplos da atividade irregular de espigão característica das células progenitoras neurais. Para quantificar essa complexidade, diferentes métodos de análise de dados podem ser aplicados, incluindo parâmetros diversos para definir um pico. Se as placas forem manuseadas aproximadamente ou as lavagens forem executadas com muita força durante a hibridização fluorescente in situ, as células podem ser desalojadas das superfícies da placa, impossibilitando que as células sejam combinadas através de imagens.Se essa interrupção afetar apenas algumas das células do campo de visão, ainda pode ser possível detectar e atribuir algumas das células dentro da imagem. No entanto, a quantidade máxima de dados é obtida a partir de um experimento no qual a hibridização é realizada cuidadosamente e poucas células são perdidas ou reposicionadas entre imagens. Os resultados de experimentos que colam atividade de cálcio com a expressão de genes marcadores progenitores neurais podem revelar inúmeras associações entre padrões específicos de atividade de cálcio e fenótipos neurotransmissores.Com esses dados, os pesquisadores podem sondar características mais complexas desses padrões dinâmicos de cálcio e as relações com a expressão genética, em vez de ficarem restritos à simples contagem de picos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Compreender Organogenesis precoce Usando um Simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridação em<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Biologia do Desenvolvimento

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulação e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturação<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Oócitos, seguido de injeção intracitoplasmática de espermatozóide, para estudar o desenvolvimento embrionário

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-alvo Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização para Comparando Expressão Gênica em Domínios<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imagens de cálcio na<em&gt; Drosophila</em&gt; At Activation Egg

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualização de células Multiciliated no Zebrafish através de um protocolo combinado de toda montagem fluorescente In Situ da hibridação e imunofluorescência

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipagem e Quantificação da Coloração de Hibridização in Situ em Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...