Name: fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis
Uploaded: 2020-02-18T14:30:00
Duration: 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Wendy Herbst ve Lindsay Schleifer'e bu protokollerin geliştirilmesine olan katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma MsS'e Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R15NS067566-01, 1R15HD07624-01 ve 1R15HD096415-01) tarafından desteklenmiştir.

<ol>
	<li>Humeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+and+cell+cycle:+Progression+or+death.">Calcium signaling and cell cycle: Progression or death.</a> Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).</li><li>Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+toolkit+reveals+the+role+of+Ca2++sparklets+in+coordinated+cell+migration.">Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration.</a> PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).</li><li>Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cell+death:+the+calcium-apoptosis+link.">Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).</li><li>Pham, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++and+Mg2++module+conformational+dynamics+and+stability+of+downstream+regulatory+element+antagonist+modulator.">Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator.</a> Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).</li><li>Smedler, E., Uhl&#233;n, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+decoding+of+calcium+oscillations.">Frequency decoding of calcium oscillations.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).</li><li>Moreau, M., N&#233;ant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+coding+and+decoding+strategies+for+the+specification+of+neural+and+renal+precursor+cells+during+development.">Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development.</a> Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).</li><li>Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NFAT+functions+as+a+working+memory+of+Ca2++signals+in+decoding+Ca2++oscillation.">NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation.</a> EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).</li><li>Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+Control+of+Calcium+Oscillation+Waveform+Defines+NFAT+as+an+Integrator+of+Calcium+Load.">Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load.</a> Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).</li><li>Li, L., Stefan, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Le+Nov&#232;re+N.+Calcium+input+frequency,+duration+and+amplitude+differentially+module+the+relative+activation+of+calcineurin+and+CaMKII.">Le Nov&#232;re N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII.</a> PLoS One. 7 (9), 43810 (2012).</li><li>Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+tuning:+Competition's+role+in+setting+the+frequency-dependence+of+Ca2+-dependent+proteins.">Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins.</a> PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820 (2017).</li><li>Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competitive+Tuning+Among+Ca2+/Calmodulin-Dependent+Proteins:+Analysis+of+in+silico+Model+Robustness+and+Parameter+Variability.">Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).</li><li>Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+neuronal+calcium+spikes+during+early+differentiation.">Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).</li><li>Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+homeostatic+specification+of+transmitter+expression+in+embryonic+neurons.">Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons.</a> Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).</li><li>Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+and+Global+Spontaneous+Calcium+Events+Regulate+Neurite+Outgrowth+and+Onset+of+GABAergic+Phenotype+during+Neural+Precursor+Differentiation.">Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation.</a> Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).</li><li>Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Waves+Propagate+through+Radial+Glial+Cells+and+Modulate+Proliferation+in+the+Developing+Neocortex.">Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex.</a> Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).</li><li>Nieuewkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , (1994).</li><li>Paudel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Activity+Dynamics+Correlate+with+Neuronal+Phenotype+at+a+Single+Cell+Level+and+in+a+Threshold-Dependent+Manner.">Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner.</a> International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880 (2019).</li><li>Marken, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Markovian+Entropy+Measure+for+the+Analysis+of+Calcium+Activity+Time+Series.">A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series.</a> PLoS One. 11 (12), 0168342 (2016).</li><li>Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baseline+Correction+with+Asymmetric+Least+Squares+Smoothing.">Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing.</a> Leiden University Medical Centre Report. , (2005).</li><li>Guemez-Gamboa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-cell-autonomous+mechanism+of+activity-dependent+neurotransmitter+switching.">Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching.</a> Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).</li><li>Paredes, R., Madelaine, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması bildirilmemiş.

Gelişmekte olan sinir sistemini oluşturan hücrelerde karakteristik kalsiyum aktivitesi paternleri gözlenmiştir ve farklı nörogelişimsel süreçlerle ilişkili belirli aktivite türleri vardır. Ancak, bu bilgi yoğun aktivite kalıplarının transkripsiyonel yanıtlara çevrilme mekanizmalarının daha iyi anlaşılması, kalsiyum aktivitesi ve gen ekspresyonu hakkında bilgilerin tek hücreli çözünürlükle toplanmasını gerektirir. Olgun nöronlar gibi daha basmakalıp kalsiyum aktivitesi sergileyen sistemler toplu düzeyde makul bir şekilde tetkik edilebilirken, embriyonik sinir sistemini karakterize eden düzensiz desenler daha az hassas kayıtlarla kolayca maskelenir.
Bu protokolde yer alan deneysel çerçeve, çok çeşitli hücre tiplerine ve floresan muhabirlere kolayca uyarlanabilir. Hemen hemen herhangi bir hücre tipi veya hücre tiplerinin kombinasyonunu içeren doku, ilgi çekici bir organizmadan kesilebilir ve tek hücreli görüntüleme için kaplanabilir. Hücre tanımlamasına izin vermenin ve hücre özerk süreçlerinin etkisini yalıtmaya ek olarak, birincil hücre kültürü yaklaşımı deneycinin ortam bileşenlerini istenilen şekilde tanımlamasına olanak tanır. Örneğin, 2 mM Ca2+ çözeltisindeki nöronal öncüllerin aktivitesini karşılaştıran deneyler, embriyonik omurilikteki ani frekans ve nörotransmitter fenotip arasındaki ilişkilerin hücre-hücre etkileşimlerinin etkisi olmadan tekrar kapılıp yapılamayacağını araştırmak için yapılmıştır13,20.
Bu protokol, hücre içi kalsiyum aktivitesini saptamak için floresan belirteç Fluo4-AM'den yararlanırken, kullanıcılar genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri de dahil olmak üzere diğer ticari olarak kullanılabilen belirteçleri21'iseçebilirler. Benzer şekilde, alternatif belirteçler ilgi bir iyon konsantrasyonu dinamik değişiklikleri izlemek için kullanılabilir (Kdahil +, Na+, ve Zn2 +), membran potansiyeli, veya hücresel pH. Görüntüleme ayarları ve görüntü süresi gerektiğinde değiştirilebilir.
Kalsiyum aktivitesi ve nöronal fenotip ile spesifik bir uygulama olarak ilişkili olmamıza rağmen, bu yöntem çeşitli hücresel özellikler için de geçerlidir. Örneğin, yerinde hibridizasyonda floresan, nöronal marker ChAT veya transkripsiyon faktörü Engrailed dahil olmak üzere herhangi bir gen karşı problar ile yapılabilir, mRNA türlerinin özelleştirilebilir bir panel hassas algılama sağlayan. Bu problar izoforma özgü olacak şekilde tasarlanabilir ve istenirse ek hedef özgüllüğünü destekler. Çift BALIK birkaç farklı florofore konjuge problar kullanılarak yapılabilir, birden fazla genin ekspresyonunun eşzamanlı olarak değerlendirilmesine olanak sağlar. Ancak, bu tür deneylerin gerektirdiği ek yıkıntılar hücre kaybı veya hareket etme şansının artmasıyla ilişkilidir ve deneyim ve incelik gerektirir.
Bu protokolde yapılan deneye özgü değişikliklerden bağımsız olarak, dikkatli dikkat gerektiren birkaç önemli adım vardır. Diseksiyonlar tüm kontamine dokuları veya hücre popülasyonlarını gidermek için özenle yapılmalıdır; uzamsal desenleme ekspertiz dissociated zaman kaybolur çünkü, komşu dokulardan kalan hücreler serpiştirilmiş ve ilgi hücrelerinden ayırt edilemez hale gelecektir. Hücreler kaplandıktan sonra, hücrelerin yerinden olmasını önlemek için numuneler mümkün olduğunca nazik bir şekilde ele alınmalıdır. En önemlisi, bu, çözelti çıkarılırken ve eklenirken pipet plakanın kenarına yerleştirilirken, tüm çözüm değişikliklerinin yavaş ve dikkatli bir şekilde yapılması gerektiği anlamına gelir. Bu, hücrelerin hem kalsiyum hem de FISH görüntülerinde güvenle tanımlanabilmesini sağlayacaktır. İşlem sırasında hücreler bozulursa, iki görüntü arasında karşılık gelen hücrelerin bazılarını veya tümünün tanımlanması imkansız olabilir. Bu atamalarda dikkatli olmanızı öneriyoruz, ancak daha fazla analiz için sadece kesin olarak karşılık gelen hücreler kullanılır.
Ele alınması gereken biyolojik soruya bağlı olarak, çeşitli analiz yaklaşımları uygun olabilir. Zaman serisi kalsiyum aktivitesi çeşitli şekillerde işlenebilir ve ölçülebilir, de-trending parametreleri, analiz ölçümleri ve analiz parametreleri seçiminde deneyci esnekliği ile (örneğin, bir kalsiyum başak tanımlamak için kullanılan temel eşik %). Gen ekspresyonunun FISH görüntüsünden elde edilen mutlak veya bağıl floresan değeri olarak analiz edilerek kalsiyum aktivitesi ile gen ekspresyonu düzeyi arasındaki korelasyonlar çizilebilir. Alternatif olarak, pozitif gen ekspresyonu sinyali için floresan eşiği tanımlayarak ve tek tek hücrelere 'evet' veya 'hayır' tanımlayıcıları atayarak kalsiyum aktivitesi ve gen ekspresyonu (varolma/yokluk) arasındaki korelasyonlar çizilebilir. Bir bütün olarak, bu deneysel şema hücre uyumlu gen ekspresyonu verileri ile birlikte zaman serisi verilerin toplanması ve ön analizi için inanılmaz esnek bir boru hattı sağlar. Bu tür deneyler hücresel dinamikler ve transkripsiyonel değişiklikler arasındaki karmaşık ilişkileri daha iyi anlamak için kritik olacaktır, embriyonik Xenopus laevisinhibitör-fated ve uyarıcı-fated nöronal öncüllerin karakteristik kalsiyum aktivite kalıplarının belirlenmesi ile örneklenmiştir .

Serbest sitozolik kalsiyum, hücre çoğalması ve apoptosis ve otofaji1,2,3arasında değişen biyolojik süreçler çeşitli için önemlidir. Bu yollar içinde, kalsiyum protein aktivitesi ve etkileşimleri modüle konformasyonel değişiklikler eneden kalsiyum bağlayıcı etki alanları ile etkileşim egörebilirsiniz gen ekspresyonu üzerinde downstream etkileri uygulayabilirsiniz. Örneğin, Downstream Düzenleyici Element Antagonist Modulator (DREAM) olarak bilinen bir nöronal kalsiyum sensörü, kalsiyum ile bağlı olduğunda açılmamış bir ara konformasyon tutulur, onun protein ve DNA hedefleri ile etkileşimi engelleyen4. Basit bir sinyal molekülü olarak hizmet ötesinde, ancak, hücre içi kalsiyum geçici dinamik doğası bu aktivite desenleri daha karmaşık genlik kodlamak için izin verir- veya frekans tabanlı sinyalleri5,6. Aktive T-hücrelerinin transkripsiyon faktörü nükleer translokasyon (NFAT) yüksek frekanslı kalsiyum salınımları ile geliştirilmiş ancak düşük frekanslı salınımlar tarafından inhibe7. Zorlayıcı, son çalışma NFAT aslında kümülatif kalsiyum maruziyeti8yanıt verebilir ileri sürmüştür. Hem kalsinurin ve Ca2 +/ calmodulin bağımlı protein kizide II (CaMKII) da belirli bir frekans, süre veya genlik kalsiyum geçici farklı tepkiler sergiler9. Düzenleyici karmaşıklık ek bir düzey eklemek için, hesaplamalı modeller birçok downstream kalsiyum bağlayıcı proteinler inaktif proteinlerin varlığı veya bağlayıcı rakiplerin yokluğuna yanıt olarak daha fazla veya daha az frekansa bağımlı haleöneririz 10,11.
Gelişen sinir sistemi içinde, kalsiyum aktivite davranışlarının iki ana sınıf tanımlanmış ve belirli biyolojik süreçler ile ilişkili. Kalsiyum akınları, tek tek hücreler içinde meydana gelirse , beş saniye içinde bazal ~ % 400 bir pik yoğunluğuna ulaşmak ve çift üstel çürüme12sergileyen "sivri" olarak sınıflandırılır. Sinyal Bu tür öncelikle nörotransmitter fenotip özellikleri ile ilişkilidir13. Buna karşılık, "dalgalar" bir hücre içi kalsiyum konsantrasyonu otuz saniye veya daha fazla bir süre içinde bazal ~ % 200 yükselir, daha sonra birkaç dakika12üzerinde bozunur yavaş, daha az aşırı kalsiyum geçici olarak tanımlanır. Bu sinyaller genellikle birden fazla komşu hücreler arasında yayılır ve onların varlığı nötrit büyüme ve hücre çoğalması ile ilişkili olmuştur14,15. Ancak, bu iki sınıf karakteristik kinetik profillere göre tanımlanmış olsa da, bu desenlerin hangi özelliklerinin aslında hücreler tarafından algılandığı ve aşağı akım efektörleri tarafından tercüme edildiği tam olarak belirsizliğini korumaktadır.
Hücre içi kalsiyum salınımları ile gen ekspresyonu arasındaki ilişkinin anlaşılması, sinir sisteminin uygun gelişimini ve desenlemesini sağlayan düzenleyici mekanizmalardan birine önemli bir bakış açısı sağlayacaktır. Bu amaçla, embriyonik omurilik çalışmaları geliştirme sırasında artan kalsiyum başak aktivitesi inhibitör nöronların daha yüksek seviyeleri ile ilişkili olduğunu göstermiştir, azalmış kalsiyum başak aktivitesi uyarıcı nöronların daha yüksek seviyeleri ile ilişkili iken13. Ancak, bu popülasyon düzeyindeki tahliller kalsiyum aktivitesini tek hücredüzeyinde gen ekspresyonu ile ilişkilendirmek için kullanılmamıştır.
Bu sorulara tek hücre düzeyinde yaklaşmak önceki çalışmalara göre birkaç farklı avantaj sunar. İlk olarak, birçok hücredeki kalsiyum aktivitesini ve gen ekspresyonunu tek tek değerlendirebilme yeteneği, toplu seviye ölçümü ile gizlenmeden farklı aktivite kalıplarının tam repertoiresinin gözlenmesini sağlar. Ayrıca, bu ilişkilerin tek hücreli birincil kültürde incelenmesi, kalsiyum aktivitesi ile gen ekspresyonu arasındaki hücre özerk bağlarının korunacağı, hücre-hücre iletişimini gerektiren etkileşimlerin ortadan başlayacağı anlamına gelir. Bu nedenle, bu yaklaşım bu hücre özerk mekanizmaları izole çalışılmasına olanak sağlar. Ancak, aynı zamanda hücre özerk olmayan kalsiyum aktivitesinin rolünün açıklığa kavuşturulmasını ve sorgulanmasını sağlar. Örneğin, hücreler nöral plaka aşamasında bir embriyo dan kesilebilir, kardeş kontrolleri nöral tüp aşamasına ulaşana kadar kültürlü, ve daha sonra yeni bir nöral tüp aşamasından embriyo dan parçalanmış olan hücrelerle karşılaştırıldığında. Bu, hücre-hücre iletişiminin önemli bir gelişim dönemi boyunca tuttuğu hücrelerin hücre-hücre iletişiminin kaldırıldığı hücrelerle doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır.
Önceki deneysel yaklaşımların sınırlamalarını ele almak amacıyla, bireysel nöral progenitör hücrelerinde hem kalsiyum aktivitesinin hem de gen ekspresyonunun değerlendirilmesini sağlayacak ve belirli aktivite kalıplarının sonraki farklılaşma programları ile korelasyonunu kolaylaştıracak bir protokol geliştirdik. Nöral doku, nöral gelişimin çeşitli aşamalarında Xenopus laevis'ten kesildi, tek hücrelere bölündü ve floresan kalsiyum indikatunun varlığında konfokal mikroskopi ile görüntülendi. Canlı hücre görüntülemesinin ardından, numuneler bir genin veya ilginin izoformunu saptamak için floresan ile yerinde hibridizasyon (FISH) ile tespit edildi. Daha da önemlisi, her iki görüntüleme deneyi boyunca tek tek hücreler izlenebilir, yani bir hücrenin kalsiyum aktivite profili ve gen ekspresyonu düzeyi birbiriyle ilişkilendirilebilir(Şekil 1). Burada bildirilen protokol, Xenopus laevis'teembriyonik nörogelişim boyunca kalsiyum aktivite kalıpları ile gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri araştırmak için tasarlanmıştır. Ancak, daha geniş deneysel çerçeve (FISH ve görüntü ortak kaydı nın ardından tek hücreli zaman-kurs görüntüleme) değiştirilebilir ve hemen hemen her hücre tipine, floresan muhabire ve ilgi genine uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>For Animal Husbandry &#38; Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHORULON (chorionic gonodotropin)</td>
			<td>Merck Animal Health</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamycin sulfate salt</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G1264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dishes, 100 mm x 20 mm</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS3160102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 35mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes, 60mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientifc Nunc Cell Culture / Petri Dishes, 35x10mm Dish, Nunclon Delta</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Standard Disposable Transfer Pipettes, Nongraduated; Length: 5.875 in.; Capacity: 7.7 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase B</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11088807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps, Dumostar</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellattice Micro-Ruled Cell Culture Surface</td>
			<td>Nexcelom Bioscience</td>
			<td>CLS5-25D-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Calcium Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, 0.2 &#181;m filtered (10% Solution in Water)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P6866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For RNA Probe Generation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A1222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rATP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rCTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rGTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rUTP</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digoxigenin-11-UTP</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>3359247910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase Inhibitor</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RQ1 Rnase-Free Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiCl Precipitation Solution (7.5 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Fluorescence In Situ Hybridization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Anhydride</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11096176001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>11207733910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Mono-Reactive NHS Ester</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GEPA13105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solution Components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride, 96% extra pure, powder, anhydrous, ACROS Organixs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC349610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS hydrate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denhardt&#39;s Solution (50X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>750018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide (Deionized)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9342</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Herparin sodium salt from porcine intestinal mucosa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (Ultra Pure)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11344041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H1109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>168149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride, pure, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate, 97% pure, ACROS Organixs, anhydrous</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC413480050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid, 99%, ACROS Organics</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ACS125231000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS (Fine White Crystals/Molecular Biology), Fisher BioReagents</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribonucleic acid from torula yeast, Type IX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>R3629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>90279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE17-1321-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TWEEN 20</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>TE200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Imaging Software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Incubator</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>model of choice</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miscellaneous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning bottle-top vaccum filter system, 0.22 &#956;m pore, 500 mL bottle capacity</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS430769</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent calcium imaging and subsequent in situ hybridization for neuronal precursor characterization in xenopus laevis

Spontan hücre içi kalsiyum aktivitesi çeşitli hücre tiplerinde görülebilir ve çeşitli fizyolojik süreçlerde kritik roller oynaması önerilmektedir. Özellikle, embriyogenez sırasında kalsiyum aktivite kalıplarının uygun düzenlenmesi uygun nöral tüp kapatma, sinaptogenez ve nörotransmitter fenotip özellikleri de dahil olmak üzere omurgalı nöral gelişim, birçok yönü için gereklidir. Kalsiyum aktivite kalıplarının hem frekans hem de genlik açısından farklılık gösterdiği gözlem, bu aksların kodlanmış sinyalleri aşağı akım efektörlerine iletebileceği ve gen ekspresyonunu düzenleyebileceği zorlayıcı bir mekanizmayı işaret etse de, mevcut nüfus düzeyindeki yaklaşımlar bu olasılığı daha fazla araştırmak için gereken hassasiyetten yoksundur. Ayrıca, bu yaklaşımlar hücre-hücre teması yokluğunda nöronal tayini devlet tayini yeteneği engelleyerek hücre-hücre etkileşimlerinin rolü çalışmaları sınırlamak. Bu nedenle, dissociated nöronal eksplorasyonların zaman atlamalı kalsiyum görüntülemesini yerinde hibridizasyon analizinde bir floresan ile eşleştiren deneysel bir iş akışı oluşturduk ve kalsiyum aktivite deseninin moleküler tek hücredüzeyinde fenotip. Bu yaklaşımı, sırasıyla nöral hücreler ve nöral progenitor hücreleri ayırt etmek ve karakterize etmek için başarılı bir şekilde kullanabildik; bunun ötesinde, ancak, bu makalede açıklanan deneysel çerçeve kolayca herhangi bir zaman serisi aktivite profili ve bir gen veya ilgi genlerin ekspresyonu arasındaki korelasyonları araştırmak için uyarlanabilir.

Kalsiyum görüntüleme için hazırlanan ayrışmış hücrelerin başarılı bir örneği Şekil 2A'dagörülebilir. Hücreler yoğun bir şekilde kaplanır, her görüntüden toplanacak maksimum bilgi miktarına izin verilir, ancak tek tek hücrelerin birbirinden emin bir şekilde ayırt edilemeyecek kadar yoğun bir şekilde kaplanmamasını sağlar. Floresan 2 saat görüntüleme süresi boyunca her tanımlanmış hücre için tespit edilir. Bir deneyde kaydedilen tüm hücrelerin izlerini içeren bileşik bir çizimin görselleştirilmesi, toplu veya popülasyon ölçümlerinin daha nüanslı davranış modellerini gizleme derecesini ortaya koymaktadır(Şekil 2B). Tek tek hücrelerin kaydedilmiş profilleri izole edildiğinde, nöral progenitor hücrelerinin düzensiz spiking aktivite karakteristik örnekleri açıkça tespit edilebilir. Olgun nöronların aksine, embriyonik nöronal hücreler kalsiyum aktivitesinin düzensiz, son derece değişken ve karmaşık doğasını sergilerler(Şekil 2B). Bu karmaşıklığı ölçmek için, farklı veri analizi yöntemleri nin uygulanması17,18, bir başak tanımlamak için çeşitli parametreler de dahil olmak üzere uygulanmıştır ( Şekil2C).
Bir antisense mRNA probubaşarılı tasarımı ve sentezi de dahil olmak üzere yerinde hibridizasyonda başarılı floresan, bağlayıcı olmayan bir duyu RNA kontrolü ile inkübe edilmiş bir arka plan kontrolü ile deneysel plaka karşılaştırılarak değerlendirilebilir (Şekil 3A,B). Pozitif sonda kontrolü, hedef mRNA'yı algılanabilir düzeylerde ifade ettiği bilinen bir hücre türünü işleyerek de gerçekleştirilebilir.
Kalsiyum ve FISH görüntüleme genelinde aynı hücrenin tanımlanması, hücrelerin prob hibridizasyonu ve işleme sırasında kabaca aynı pozisyonda tutmalarını gerektirir. Plakalar kabaca işlenirse veya yıkar lar çok güçlü bir şekilde yapılırsa, hücreler plaka yüzeyinden çıkarılabilir ve çözelti atıldığında veya plaka üzerinde farklı bir yere yatırıldığında kaybedilebilir, bu da görüntüler arasında eşleşmelerini imkansız hale getirir(Şekil 4A). Bu bozulma görüş alanındaki hücrelerin yalnızca bazılarını etkiliyorsa, görüntü içindeki bazı hücreleri algılamak ve atamak yine de mümkün olabilir(Şekil 4B). Ancak, FISH'in dikkatle gerçekleştirildiği ve birkaç hücrenin kaybolduğu veya görüntüler arasında yeniden konumlandırıldığı bir deneyden maksimum veri elde edilir(Şekil 4C).
İlgi çekici olan gelişim evresinde makul sayıda hücrenin kalsiyum aktivitesini ve gen ekspresyonunu tanımlamak için veriler toplandıktan sonra, bu iki özellik arasındaki korelasyonları değerlendirmek için daha fazla analiz yapılabilir(Şekil 1). Ani sayım/frekans, ortalama güç, Hurst üs tahmini ve Markovian entropi ölçümü17,18dahil olmak üzere kalsiyum aktivite kalıplarını ölçmek için bir dizi ölçüm uygulanmıştır. Gen ekspresyonu, ele alınmakta olan deneysel sorulara bağlı olarak mutlak floresan düzeyi ile nicel olarak tanımlanabilir veya ikili (evet/hayır) ölçeğinde derecelendirilebilir.
Kalsiyum aktivitesini nöral progenitor marker genlerinin ekspresyonu ile harmanlayan deneylerin sonuçları, kalsiyum aktivitesinin belirli paternleri ile nörotransmitter fenotipler arasında çok sayıda ilişki olduğunu ortaya koymuştur. Nöral plaka evresinde (Evre 14), inhibitör nöron belirteci gad1.1 ifade gabaerjik hücreler gad1.1 ekspresyonu olmayan hücrelerin daha düzenli ve daha yüksek genlikli kalsiyum aktivitesi sergiler (Şekil 5A). Ayrıca, bu gad1.1-ifade hücreleri yüksek genlik spiking yüksek seviyeleri ile ilişkili iken, düşük genlik spiking uyarıcı nöron belirteci slc17a7ifade glutamaterjik hücrelerde daha sıktır .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig1a.jpg"> Şekil 1: Deneysel iş akışının şeması. Ölçek çubuğu = 100 μm. Panellerde 3-5 görüntüler Paudel et al alınmıştır (2019)17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig1alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig2b.jpg"> Şekil 2: Kalsiyum görüntüleme ve örnek aktivite profilleri. (A) Fluo4-AM tarafından bildirilen hücre içi kalsiyum aktivitesi. Her 2 saat görüntü 901 kare, burada bir temsili çerçeve gösterisi ile oluşur. (B) Görüntülenmiş görüş alanı içindeki tüm hücrelerde zaman içinde floresan yoğunluğunun bileşik çizimi. İzler, gösterge boyasının (Fluo4) fazla mesainin fotobeyazlama olduğunu açıkça gösterir. Sol üstteki Raster çizimi, Eilers ve Boelen19tarafından geliştirilen ve burada gösterilen hücrelerin farklı spiking davranışı deseni sergilediği bir de-trending algoritmasının uygulanmasından sonra kalsiyum aktivitesinin temsili izlerini gösterir. (C) Farklı eşiklerin uygulanması (temel in %150 ve %200'ü, taban çizgisi de-trended floresan yoğunluğunun ortalamasıdır) bir başak tanımlamak için (yeşil ve mavi oklar). Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig2blarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig3a.jpg"> Şekil 3: FISH görüntüleme. (A) FISH negatif kontrol olarak bağlayıcı olmayan bir anlamda RNA probu ile yapılır. Görüntüleme ayarları, hiçbir hücrenin floresan görünmeyebilecek şekilde ayarlandı. Bazı görüş alanları, (A)'nın sağ üst ve alt köşelerinde görüldüğü gibi, bazı floresan hücre dışı enkazları içerebilir; bunlar arka plan ayarı amacıyla yoksayılabilir. (B) Aynı görüntüleme ayarları daha sonra deneysel bir plaka (antisense RNA prob) görüntü için kullanılır. Bu koşullar altında floresan arka plan üzerinde gen ekspresyonuna karşılık gelir. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig3alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig4a.jpg"> Şekil 4: Görüntü bindirme ve birlikte kayıt. Kalsiyum aktivitesi (dolgulu yeşil daireler tarafından temsil edilen hücreler) ve FISH'ten sonra (gölgeli kırmızı dairelerle temsil edilen hücreler) için resmedilen bir örneğin şematik gösterimleri. (A) Örnek işleme ve işleme sırasında önemli ölçüde hareket eden hücreler iki görüntü arasında güvenilir bir şekilde tanımlanamaz. (B) Hücre bozulması görüş alanındaki yalnızca bazı hücreleri etkileyebilir. Bazı hücreler her iki görüntüde de açıkça tanımlanabilirken, diğerleri güvenle eşleştirilemez. (C) Örnekler dikkatle ele alınırsa, çoğu hücre rahatsız edilmeden kalır ve her iki görüntüde de tanımlanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig4alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60726/60726fig5b.jpg"> Şekil 5: Bu yöntemin uygulanmasına bir örnek, nöral plaka evresi Xenopus laevis'te kalsiyum aktivitesi ve gen ekspresyonu (sırasıyla gad1.1 ve slc17a7 genleri için GABA ve Glut) arasındaki ilişkileri gösteren kutu çizimleri. Evre 14'te, gad1.1-postif hücreler (GABA) (A) Markovian entropi18 ve (B) eşikleri kullanarak daha yüksek genlik ve daha düzenli kalsiyum aktivitesi sergiler ler 125%, 150%, 200% ve% 300 de-trended floresan yoğunluğu ortalama (bazal)17 slc17a pozitif hücreler (Gluthücreler). Yıldızlar, Bonferroni düzeltilmiş iki örnekli Kolmogorov-Smirnov Testi (p < 0.05) ve Cohen'in etki boyutu (n = 5 kültürler ve >100 hücreleri; * 0.2 ≤ |d| < 0.5) d istatistiklerine göre istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterir. Rakam yeniden çizilmiş ve Paudel ve ark.17elde edilen veri kümesinden uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60726/60726fig5blarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis at JoVE.com

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Floresan kalsiyum görüntülemeile in situ hibridizasyonunu birleştiren ve deneycinin kalsiyum aktivitesi modellerini tek hücreli düzeyde gen ekspresyonu profilleriyle ilişkilendirmesine olanak tanıyan iki parçalı bir protokol salıyoruz.

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Bu protokol, kalsiyum aktivite modellerini tek hücre düzeyindegen ekspresyonu ile ilişkilendirmek için kullanılabilir ve araştırmacıların bu iki özellik arasındaki ilişkiler hakkında yeni soruları araştırmalarını sağlar. Tipik olarak tüm dokuları inceleyen önceki yaklaşımların aksine, tekniğimiz tek hücre seviyesine yakınlayarak kalsiyum aktivitesi ve gen ekspresyonu arasındaki hücre özerk ilişkilerini değerlendirmemizi sağlar. UV yaklaşık 30 dakika boyunca iki 35 milimetrelik plastik Petri yemekleri ve bir 35 milimetre hücre kültür çanak sterilize ile başlayın.Laminar akış kaputunda çalışırken, her iki 50 mililitrelik plastik konik tüpler, bir UV sterilize Petri çanak ve UV steril hücre kültür çanak her biri için iki milimolar kalsiyum çözeltisi 10 mililitre ekleyin. Diğer UV sterilize Petri kabına iki mililitre kalsiyum ve magnezyumsuz çözelti ekleyin ve iki adet 100 milimetrelik plastik Petri kabını ve bir adet 35 milimetrelik plastik Petri kabını gentamisin ile takviye edilmiş 0,1 X MMR ile doldurun. Sonra% 70 etanol ile 60 milimetrelik plastik Petri çanak doldurun.Diseksiyondan hemen önce, 0,01 gram kolaj nöz B'yi bir kalsiyum çözeltisi tüpüne iyice karıştırın. Yeni bir 60 milimetrelik plastik Petri çanak için çözüm ekleyin ve istenilen gelişim aşamasında embriyoları tanımlamak için bir diseksiyon mikroskop kullanın. MMR artı gentamisin içeren bir 100 milimetrelik plaka içine en az altı uygun embriyo taşımak için steril bir transfer pipet kullanın.Daha sonra bir embriyoyu tutma plakasından mmr artı gentamisin'in ikinci 100 milimetrelik plakasına taşıyın ve bu diseksiyon plakasını mikroskop altına yerleştirin. Embriyo stabilize etmek için künt forceps bir çift kullanarak, dikkatle ince forceps bir çift ile embriyo çevreleyen vitellin membran soyma. Tüm membran çıkarıldığında, dorsal ve ventral bölgeleri ayırmak için ön arka eksen boyunca embriyo çimdik ince çaksilikler kullanın.Numuneyi dikkatlice diseksiyon plakasına geri aktarmadan önce, dorsal kısmı 1-2 dakika boyunca 60 milimetrelik kolaj çözeltisine aktarmak için yeni steril transfer pipetini kullanın. Diseksiyonu tamamlamak için, ektodermin nöral dokusundan kalan tüm endodermal ve mezodermal kontaminasyonu dikkatlice çıkarın ve eksplantı 35 milimetrelik kalsiyum çözeltisine nazikçe aktarın. Üç eksper daha toplandığında, ekspertiz ve hava suyu arabirimi arasında herhangi bir temasından kaçınmak için ekspekte olan 4 bitkiyi 35 milimetrelik kalsiyum ve magnezyumiçermeyen çözeltiye aktarmak için bir P1000 mikropipeti kullanın.Daha sonra yavaşça çanak girdap böylece tüm eksteseks plakanın ortasında küme ve dokuların ayrışması için izin oda sıcaklığında bir saat boyunca örnekleri kuluçka. Bu kuluçka sırasında, gentamisin ile MMR ikinci çanak son iki embriyo transferi, ve bu örnekler in rahatsız edilmeden geliştirmek için izin çanak kapağı. Kuluçka sonunda, 35 milimetrelik hücre kültürü çanak altına mikro-kurallı coverslip eklemek için süper tutkal kullanın ve ayrışmış explants toplamak için bir P100 mikropipet kullanın.Pipeti hücre kültürü çanağının yüzeyine yakın sığ bir açıda tutarak, pipet ucunu ızgaranın köşesine içe bakacak şekilde yerleştirin ve hücre süspansiyonunu ızgaralı alan boyunca sıkıca dışarı atlayın. İdeal olarak, hücreler sıkı, yoğun bir kümeye yerleşirler. Hücrelerin oda sıcaklığında bir saat boyunca tabağa yapışmasını bekleyin.Hücreler yerleşirken, kardeş kontrol embriyolarının gelişim evresini belirleyin ve kaydedin. Kuluçka sonunda, numune kabını ışık korumalı bir konuma taşıyın ve yemeğin kenarından 100 mikrolitre çözelti aspire edin. Bu çözeltiyi, numune kabına tam hacmi iade etmeden önce, yeni hazırlanmış fluo-4 Pluronic F127 asit çözeltisinin yedi mikrolitresini yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.Karıştırmak ve alüminyum folyo ile plaka kapsayacak şekilde yavaşça girdap. Oda sıcaklığında bir saat sonra, kalsiyum çözeltisi taze iki milimolar taze üç mililitre ile eksplant kültür çanak supernatant bir mililitre değiştirin. Sonra üç mililitre supernatant'ı üç mililitre taze kalsiyum çözeltisi ile iki kez daha değiştirin.Ekspertiz içinde kalsiyum aktivitesi görüntüleme için, örnek plakayı ortam ışığına maruz kalmaktan korunan ters bir konfokal mikroskobun aşamasına yerleştirin ve sonraki görüntüleme seanslarında aynı görüş alanının bulunabilmesi için plakanın ön noktasını etiketlemek için bir işaret kullanın. Mikroskop altında bir örnek bulmak için 10 ve 20 kez hedefleri kullanın ve hücre yoğun ama hücrelerin kümelenmiş veya tek tek ayırt etmek zor değil uygun bir görüş alanı seçin. Mikroskop odağı, ızgara yönetimindeki kapak kaymasının görünür olması için, tanımlanabilir bir sayı gerektiğinde çerçevede olana kadar orijinal görüş alanını değiştirerek ayarlayın.Odakta ızgara kurallı kapak kayması ve odaktaki hücrelerle seçilen görüş alanının parlak alan görüntüsü ile seçilen görüş alanının parlak bir alan görüntüsünü elde edin. Izgaralı kapak ve görüş alanının net bir görüntüsü olmadan, daha sonra oluşturacağınız balık görüntüleriyle hücrelerinizi birlikte kaydedemezsiniz. Sonra 488 nanometre lazer ile örnekleri aydınlatmak.İki saatlik bir görüntü için, görüntüyü elde etmek için yapılandırmayı çalıştırmadan önce, görüntüleme yapılandırmasını sekiz saniye aralıkla 3,93 saniyelik bir taramayı zaman diliminde 901 kare kaydetmek için değiştirin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, mikroskop aşamasından plakayı çıkarın ve kuluçka başlangıcında kardeş kontrol embriyolarının gelişim evresini kaydetmek için oda sıcaklığında iki saatlik kuluçka için 1X MEMFA bir mililitre ile kültür supernatant değiştirin. Bir deneyde kaydedilen tüm hücrelerin izlerini içeren bileşik bir çizimin görselleştirilmesi, toplu veya popülasyon ölçümlerinin daha nüanslı davranış modellerini gizleme derecesini ortaya koymaktadır.Tek tek hücrenin kaydedilmiş profilleri izole edildiğinde, nöral progenitor hücrelerinin düzensiz spiking aktivite karakteristik örnekleri açıkça tespit edilebilir. Bu karmaşıklığı ölçmek için, bir ani tanımlamak için farklı parametreler de dahil olmak üzere farklı veri analizi yöntemleri uygulanabilir. Eğer plakalar kabaca işlenirse veya yıkarlar floresan sırasında yerinde hibridizasyon sırasında çok güçlü bir şekilde yapılırsa, hücreler plaka yüzeylerinden çıkarılabilir ve bu da hücrelerin görüntüler arasında eşleştirilmesini imkansız hale getirir.Bu bozulma görüş alanındaki hücrelerin yalnızca bazılarını etkiliyorsa, görüntüiçindeki bazı hücreleri algılamak ve atamak yine de mümkün olabilir. Ancak, hibritleştirmenin dikkatle gerçekleştirildiği ve birkaç hücrenin kaybolduğu veya görüntüler arasında yeniden konumlandırıldığı bir deneyden maksimum veri elde edilir. Nöral progenitor marker genlerinin ekspresyonu ile kalsiyum aktivitesini harmanlayan deneylerin sonuçları, belirli kalsiyum aktivitesi kalıpları ile nöro-verici fenotipler arasında çok sayıda ilişki olduğunu ortaya çıkarabilir.Bu verilerle, araştırmacılar bu dinamik kalsiyum desenleri ve gen ekspresyonu ile ilişkileri basit başak sayma ile sınırlı olmak yerine daha karmaşık özellikleri inceleyebilirsiniz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipülasyon ve<em&gt; İn Vitro</emVe&gt; Olgunlaşma<em&gt; Xenopus laevis</emIntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu izledi&gt; oositler, Embriyonik Geliştirme Çalışması

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Gelişmekte olan mikroenjeksiyon Hedef Tekniği<em&gt; Xenopus</em&gt; Böbrek

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Görüntüleme Kalsiyum<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Aktifleştirme de

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...