Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

ونحن ممتنون لمركز فرجينيا للسرطان مرفق التصوير الأساسي، مرفق التحليل الجزيئي الحيوي، مرفق المجهر المتقدم ومرفق فيفاريوم الأساسي للمساعدة. ج. تي-س هو محقق مهني مبكر في أكاديمية سرطان المبيض (OCA-DoD). وقد تم دعم هذا العمل من قبل منحة NCI / المعاهد القومية للصحة (R01CA233752) إلى J. T-S، الولايات المتحدة DoD برنامج أبحاث سرطان الثدي (BCRP) جائزة اختراق المستوى 1 إلى J. T-S (BC17097) والولايات المتحدة DOD برنامج أبحاث سرطان المبيض (OCRP) جائزة التمويل (OC180412) إلى J. T-S

تم استعراض جميع الإجراءات التي تنطوي على التعامل مع الحيوانات ودراسات xenografts الورم والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية (IACUC) هنا في جامعة فرجينيا ومطابقة للمعايير التنظيمية ذات الصلة
1. التعبير وتنقية الأجسام المضادة
<ol><li>صيانة خلايا CHO<ol>
<li>تنمو خلايا CHO في Free...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

انتقائية وأورام تسليم محددة من العلاجية المضادة للسرطان وكيل هو المفتاح لقياس فعالية وسلامة العلاج المستهدف معين13. هنا وصفنا نهجاً سريع وفعالاً للتحقيق في توزيع الأنسجة والورم التفصيلية للجسم المضاد لـ BaCa غير السريرية. النهج الموصوف ينطبق على أي جسم مضاد تم إنشاؤه حديثًا وي...

وافقت ادارة الاغذية والعقاقير أول الأجسام المضادة أحادية النسيلة تستهدف CD3 (OKT3، Muromonab) في عام 19861،2. منذ ذلك الحين على مدى السنوات العشرين القادمة ، كان هناك انفجار سريع في مجال هندسة الأجسام المضادة بسبب النجاح الساحق للأجسام المضادة ضد مثبطات نقاط التفتيشالمناعية 3. بجانب التنشيط غير المباشر للجهاز المناعي ، يتم تهدف الأجسام المضادة إلى الإبلاغ مباشرة عن الخلايا السرطانية لإشراك الخلايا المناعية على وجه التحديد ، وإثارة السمية الخلوية عن طريق ناهض مستقبلات الموت ، وعرقلة إشارات بقاء الخلايا السرطانية ، وعرقلة تولد الأوعية (نمو الأوعية الدموية) ، وتقييد منظمي نقاط التفتيش المناعية ، وتقديم النظائر المشعة ، والعقاقير العلاجية الكيميائية وsrna كعوامل مترافقة2. بالإضافة إلى ذلك ، دراسة شظايا متغير سلسلة واحدة (scFv) من الأجسام المضادة المختلفة على سطح الخلايا التائية المستمدة من المريض وخلايا NK (CAR-T و CAR-NK) هي منطقة سريعة النمو من التحقيقات السريرية للعلاجات القائمة على الخلايا4.
التقارب فائقة عالية من الأدوية القائمة على الأجسام المضادة التي توفر الانتقائية لضداد التعبير عن الخلايا السرطانية يجعلها وكيلا جذابا. وبالمثل، فإن الولادة المستهدفة واستبقاء الورم في الجسم المضاد العلاجي (أو الدواء الكيميائي) هو المفتاح لتحقيق التوازن بين الفعالية على السمية. لذلك ، يتم استغلال عدد كبير من استراتيجيات الهندسة البروتينية التي تشمل ولكن لا تقتصر على5 والأجسام المضادة ثلاثيةالمحددة 6 لتعزيز كبير في الاحتباس الأمثل للورم من خلال الوريد (IV) حقن العلاجات5،7. هنا، نحن وصف طريقة بسيطة القائمة على الفلوريس لمعالجة الورم والأنسجة توزيع الأجسام المضادة المضادة للسرطان المحتملة الفعالية.
لأن الأنسجة الحيوانية تمتلك لصناعة السيارات الفلورية عندما متحمس في الطيف المرئي، وصفت في البداية الأجسام المضادة مع صبغة الأشعة تحت الحمراء القريبة (على سبيل المثال، IRDye 800CW). للحصول على براهين من التحقيقات مفهوم, لقد حققنا استخدام مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) التي تستهدف الأجسام المضادة تسمى farletuzumab ومشتقة لها دعا مرساة Bispecific المنشط Cytotoxicity (BaCa)7 الأجسام المضادة التي تستهدف CO-FOLR1 ومستقبلات الموت-5 (DR5)8 في جسم مضاد واحد المؤتلف. FOLR1 هو مستقبلات مستهدفة واضحة ومحددة في المبيض والخلايا السرطانية TNBC، xenografts الورم وأورام المريض9. وتجدر الإشارة إلى أن هناك جهود متعددة لاستغلال سريريا FOLR1 باستخدام النهج القائمة على الأجسام المضادة لإشراك الخلايا المناعية والمقويات المخدرات المضادة (ADC) لسرطانات المبيض والثدي10،11.
في هذه الورقة الأساليب، ونحن استنساخ، وأعرب عن وتنقية السريرية المضادة لل FOLR1 (فارلتوزوماب) جنبا إلى جنب مع غيرها من الأجسام المضادة للسيطرة باستخدام نظام التعبير CHO. تم استخدام IgG1 isotype والأجسام المضادة للحماقة السريرية mucin-16 تسمى abagovomab12 كضوابط سلبية. بعد تنقية البروتين A، وصفت الأجسام المضادة المشار إليها مع IRDye 800CW وكانت تدار في الوريد الذيل للفئران عارية إما تحمل xenografts أو Xenografts الورم المبيض أو متحولة بشكل ثابت الإنسان FOLR1 التعبير عن سرطان القولون مورين xenografts. تم تتبع توطين الأجسام المضادة عن طريق التصوير الحي باستخدام طيف التصوير الحي في نقاط زمنية مختلفة متعددة7. ولا تتطلب هذه الطريقة أي تعديل وراثي أو حقن للركيزة لتمكين انبعاث الضوء وهي أسرع بكثير، وفعالة من حيث التكلفة والكفاءة. ويمكن تطبيق بروتوكول الاستنساخ والتعبير والتنقية ووضع العلامات العامة الوارد وصفها أدناه على أي جسم مضاد سريري وغير سريري إذا توفرت تسلسلات سلسلة ثقيلة وخفيفة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

الأجسام المضادة أحادية النسيلة هي الأدوية متعددة الوظائف ذات الصلة العالية التي تعمل من خلال آليات مستقلة متغيرة للقضاء على الخلايا السرطانية. على مدى العقود القليلة الماضية، برز مجال conjugates المضادة للأدوية، والأجسام المضادة للبيض، مستقبلات مستضدات الشيميك (CAR) والعلاج المناعي للسرطان كمنطقة واعدة للغاية من التحقيقات الأساسية والعلاجية. مع العديد من التجارب البشرية الناجحة التي تستهدف مستقبلات نقاط التفتيش المناعية وخلايا CAR-T في سرطان الدم وسرطان الجلد بوتيرة اختراقية ، فهي أوقات مثيرة للغاية للعلاجات الأورام المستمدة من الاختلافات في هندسة الأجسام المضادة. للأسف, وقد ثبت أيضا أن أعدادا كبيرة من الأجسام المضادة والعلاجات CAR على أساس مخيبة للآمال في التجارب البشرية من السرطانات الصلبة بسبب محدودية توافر الخلايا المناعية في السرير الورم. الأهم من ذلك، التوزيع غير محدد للأجسام المضادة العلاجية في الأنسجة غير الأورام تسهم أيضا في عدم وجود فعالية سريرية، والسمية المرتبطة بها والفشل السريري. كما تعتمد الترجمة المؤمنة للدراسات قبل السريرية في مسارات السريرية البشرية للغاية على الفئران الورم xenograft فعالية ودراسات السلامة، وهنا نسلط الضوء على طريقة لاختبار الورم وتوزيع الأنسجة العامة للأجسام المضادة العلاجية. ويتحقق ذلك عن طريق وضع العلامات على الأجسام المضادة المنقاة البروتين A مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء بالقرب تليها التصوير الحي للفئران الحاملة للورم.

في المنهجية الموصوفة، أولاً قمنا باستنساخ الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات الفولات ألفا-1 (FOLR1) المسماة فارلتوزوماب، وأضداد من نوعها يسمى BaCa تتكون من فارلتوزوماب و lexatumumab جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة للسيطرة مثل abagovomab (تسلسل المقدمة في ملف التكميلية 1). وترد تفاصيل المتغير ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

هنا نقدم بروتوكول لدراسة في توطين الجسم الحي للأجسام المضادة في الفئران نماذج xenograft الورم.

تحليل الورم وتوزيع الأنسجة من مستضد الهدف الأجسام المضادة العلاجية محددة

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

يوضح هذا البروتوكول التعبير عن الأجسام المضادة وتنقيتها ومراقبة الوقت الحقيقي لتوزيع الأجسام المضادة في الورم والأنسجة. سوف تساعد الأجسام المضادة فحص مع بروتوكول وصفها تحديد الأجسام المضادة التي لديها محدودة توزيع الأنسجة غير محددة، وإثراء توطين الورم. التقنية الموصوفة سريعة وفعالة من حيث التكلفة.وهناك تقنيات أخرى، مثل التصوير المقطعي المحوسب أحادي الضوئي والتصوير المقطعي للانبعاثات البوزيترونية، باهظة التكلفة وتتطلب أجهزة تعقب مشعة وغيرها من أجهزة التتبع المتطورة. لا تقتصر هذه التقنية على الأجسام المضادة التي تستهدف السرطان. يمكن تطبيقه على أي مرض آخر ، مثل أمراض الرئة أو القلب ، لتحليل توزيع الأجسام المضادة في الجسم.إظهار الإجراء، سيكون جيريمي غيتسمان، فني بيطري من جامعتي. خلايا CHO الخام في 200 ملليلتر من وسائل الإعلام، في ديلونج، Erlenmeyer حيرت قارورة. الجمع بين خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام الحرة CHO مع 50 ميكروغرام من الحمض النووي استنساخ الثقيلة المتغير، و 75 ميكروغرام الحمض النووي استنساخ ضوء متغير في أنبوب 15 ملليلتر.ثم، دوامة الأنبوب. اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إضافة 750 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر بوليتيلينمين الأسهم إلى حل الحمض النووي, ودوامة بقوة لمدة 30 ثانية.اترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق إضافية. إضافة الخليط بأكمله إلى خلايا CHO في حين يهز يدويا قارورة. احتضان الخلايا على الفور في 37 درجة مئوية في حين تهتز في 130 لفة في الدقيقة.في اليوم التالي، إضافة ملليلترين من 100 X عامل مضاد للتكتل، واثنين من ملليلتر من 100 X المضادة للبكتيريا حل للخلايا. احتضان القارورة في 32 إلى 34 درجة مئوية، مع اهتزاز في 130 دورة في الدقيقة. مواصلة زراعة الخلايا لمدة 10 إلى 11 يوما, إضافة 10 ملليلتر من تغذية Tryptone N1, واثنين من ملليلتر من 100 X الجلوتامين الملحق في كل يوم الخامس.عد الخلايا في كل يوم ثالث لضمان أن بقاء الخلية لا تزال فوق 80٪ في اليوم 10 أو 11، حصاد المتوسطة لتنقية الأجسام المضادة عن طريق الطرد المركزي للثقافة في 3000 مرات G، وأربع درجات مئوية لمدة 40 إلى 60 دقيقة. ثم، تصفية وسائل الإعلام واضحة مع مرشح زجاجة ميكرومتر 0.22. لتنقية الأجسام المضادة، توازن البروتين A العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من العازلة ملزمة.تمرير الوسائط المصفاة من خلال العمود بمعدل تدفق ميليلتر واحد في الدقيقة. ثم غسل العمود مع اثنين من وحدات التخزين العمود من المخزن المؤقت الربط. استخدام خمسة ملليلترات من عازلة elution لerute الأجسام المضادة في 500 ميكرولتر الكسور.وتحييد الحموضة من الأجسام المضادة ألمح بإضافة 10 ميكرولترات من عازلة تحييد للكسر. قياس تركيز الأجسام المضادة النقية مع مقياس الطيف باستخدام البروتوكول الافتراضي لIgG. Dialyze 0.5 ملليلتر من الأجسام المضادة باستخدام كاسيت غسيل الكلى في لتر واحد من العازلة اقتران.بعد أربع ساعات، قم بنقل كاسيت غسيل الكلى إلى المخزن المؤقت الطازج و دياليزي بين عشية وضحاها. لإعداد تفاعل اقتران، إضافة 0.03 ميكروغرام من صبغة IRR 800 CWU لكل ملليغرام واحد من الأجسام المضادة في حجم إجمالي 500 ميكرولترات. احتضان الخليط لمدة ساعتين في 20 درجة مئوية، ثم تنقية conjugates المسمى عن طريق غسيل الكلى واسعة النطاق ضد برنامج تلفزيوني.تقدير درجة وضع العلامات عن طريق قياس امتصاص صبغة 780 نانومتر، وامتصاص البروتين في 280 نانومتر. لتطوير الماوس xenographs، ورفع بلطف الجلد من الحيوان وفصله عن طبقة العضلات الكامنة. حقن ببطء 100 ميكرولترات من تعليق الخلية تحت الجلد مع إبرة قياس 26.انتظر لبضع ثوان قبل أخذ الإبرة بحيث مصفوفة الطابق السفلي المتوسطة إبلاغ شبه صلبة هلام مثل هيكل جنبا إلى جنب مع الخلايا تحت الجلد، والتي سوف تمنع الخليط من الخروج من موقع الحقن. لأداء في التصوير الجسم الحي، حقن الأجسام المضادة المسمى صبغة عبر الوريد الذيل. بعد تخدير الماوس ، تحقق من عدم وجود استجابة لردود الفعل دواسة ، وتمدد الوريد عن طريق تطبيق الماء الدافئ.استخدم حقنة الأنسولين 1cc مع إبرة قياس 26 لحقن 25 ميكروغرام من الأجسام المضادة المسماة في حجم 100 ميكرولترات. كتحكم سلبي، تسمية وحقن الأجسام المضادة IgG غير محددة التي لا تستهدف الخلايا السرطانية. أداء في التصوير في الجسم الحي ثماني ساعات، 24 و 48 ساعة بعد حقن الأجسام المضادة.في برنامج التصوير، انقر فوق تهيئة. تأكد من أن درجة حرارة المرحلة هي 37 درجة مئوية. في لوحة التحكم، قم بإعداد التصوير بالفلور من خلال معالج التصوير، وقم بتعيين الإثارة إلى 773 نانومتر، والانبعاثات إلى 792 نانومتر.نقل الماوس المُجَدَّد إلى غرفة التصوير. ضعه في مجال التصوير باستخدام مخروط الأنف. عندما تكون جاهزة، انقر فوق الحصول على لوحة التحكم للحصول على الصورة، وانقر فوق عرض تلقائي.الصورة التي تم إنشاؤها هي تراكب الفلوريسنس على الصورة الفوتوغرافية مع الفلوريسينت البصرية والكثافة المعروضة في وحدات من العد أو الفوتونات. تم تأكيد استنساخ cDNA إيجابية مع مجالات الضوء الثقيل المتغير ومتغير مع مستعمرة PCR. تظهر هنا النتائج التمثيلية لـ farletuzumab المنقى تشغيل على صفحة SDS غير الخفض والحد.أنتجت السلاسل الثقيلة والخفيفة 50 و 25 كيلودالون بعد تخفيض. كما تم تأكيد ربط الأجسام المضادة بالبروتينات المحلية في سطح الخلية. تم حقن الأجسام المضادة المسماة بفلورسنت بشكل والأجسام المضادة، في الفئران المطعمة بـ R1 الكامل الذي يعبر عن الأورام.الحيوانات كانت تعيش صورة في نقاط زمنية متعددة باستخدام IVIS. البيانات confirs الإثراء الانتقائي للأجسام المضادة R1 و BaCa الكامل في الأورام. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن صيانة خلايا CHO التي تحتفظ بها أمر بالغ الأهمية بالنسبة لـ العائد من الأجسام المضادة.ومن المهم أن يكون درجة مماثلة من صبغة الفلورسنت لتدريج الورم التنافسية. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل كيمياء الأنسجة المناعية والأنسجة أو الورم المحدد ELISA لدعم بيانات التصوير للفئران الحية.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

نظام ثقافة ثيميك ثلاثي الأبعاد لتوليد المهاجرين الثيمة المضادة للخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القوى

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

في ريتشالينجي خلية الورم المختبر للتقييم التنبؤي من مستضد تشيميريك مستقبلات خلية تي انتيتومور الدالة

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

تحليل الأورام الجينية عوامل التعبير مع البوابة الكترونيه CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

قياس الاستجابة للمخدرات في الوقت الحقيقي في شرائح أنسجة الورم Organotypic

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...