Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
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我们感谢弗吉尼亚大学癌症中心核心成像设施、生物分子分析设施、高级显微镜设施和核心维瓦里姆援助设施。J. T-S 是卵巢癌学院 （OCA-DoD） 的早期职业调查员。这项工作得到了NCI/NIH赠款（R01CA233752）对J.T-S，美国DD乳腺癌研究计划（BCRP）突破1级奖J.T-S（BC17097）和美国多德卵巢研究计划（OCRP）资助奖（OC180412）J.T-S

弗吉尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查和批准了所有涉及动物处理和肿瘤异种移植研究的程序，并符合相关监管标准
1. 抗体的表达和纯化
<ol><li>CHO细胞的维护<ol>
<li>在 FreeStyle CHO Media 中生长 CHO 细胞，在 37 °C 时以 130 rpm 摇动时补充市售 1x 谷氨酰胺补充剂，使用 delong Erlenmeyer 烧瓶或一次性玻璃或一次性玻璃，使用 5% CO2。 注：强烈建议使用带通风盖...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

选择性和肿瘤组织特异性传递抗癌治疗剂是衡量特定靶向治疗疗效和安全性的关键。在这里，我们描述了一个快速和有效的方法，以调查临床，farletuzumab和非临床BaCa抗体的详细组织和肿瘤分布。所述方法适用于任何新生成的抗体，可与临床有效抗体（具有所需质量）一起用于其肿瘤/器官分布特性。考虑到大多数抗体靶点受体（如乳腺癌中的 HER2）在肿瘤细胞（组织）中表达过度...

FDA于1986年批准了第一个单克隆抗体靶向CD3（OKT3，Muromonab），1，2。此后的二十年里，由于抗体对免疫检查点抑制剂3的压倒性成功，抗体工程领域迅速爆炸。除了间接激活免疫系统外，抗体还旨在直接标记癌细胞，以精确接触免疫效应细胞，通过死亡受体激动剂触发细胞毒性，阻断肿瘤细胞生存信号，阻断血管生成（血管生长），约束免疫检查点调节器，提供放射性同位素，化疗药物和siRNA作为结合剂2。此外，研究患者衍生T细胞和NK细胞（CAR-T和K-NK）表面各种抗体的单链可变片段（scFv）是细胞疗法4的临床研究快速增长的领域。
抗体药物的超高亲和力，提供选择性抗原表达肿瘤细胞，使它成为一个有吸引力的剂。同样，靶向分娩和肿瘤保留治疗抗体（或化学药物）是平衡疗效与毒性的关键。因此，大量的蛋白质工程为基础的策略，包括但不限于双特异性5和三特异性抗体6正在被利用，以显著增强狂热的优化肿瘤保留静脉注射（IV）注射治疗5，7。在这里，我们描述了一个简单的荧光为基础的方法来解决肿瘤和组织分布的潜在有效的抗癌抗体。
由于动物组织在可见光谱中兴奋时具有自动荧光，因此抗体最初被标记为近红外染料（例如，IRDye 800CW）。对于概念调查的证据，我们利用叶酸受体α-1（FOLR1）靶向抗体称为法莱图祖马布及其衍生物称为双特异性锚细胞活性剂（BaCa）7抗体，共同靶对FOLR1和死亡受体-5（DR5）8在一个重组抗体。FOLR1是卵巢和TNBC癌细胞、肿瘤异种移植和患者肿瘤9中明确定义的过度表达靶向受体。值得注意的是，有多个努力，临床利用基于抗体的方法利用FOLR1，使免疫效应细胞和抗体药物结合（ADC）用于卵巢癌和乳腺癌10，11。
在本文论文中，我们使用CHO表达系统克隆、表达和纯化临床抗FOLR1（farletuzumab）以及其他对照抗体。IgG1等型和临床抗白痴粘液-16抗体称为阿巴戈沃马布12 被用作阴性对等对。在蛋白质-A纯化后，指示抗体被标记为IRDye 800CW，并施用到裸鼠的尾静脉中，要么携带卵巢肿瘤异种移植物，要么稳定地转染人类FOLR1，表达穆林结肠癌异种移植。抗体定位通过实时成像跟踪，在多个不同时间点7使用体内成像谱。这种方法不需要任何基因改造或注射基板，使光发射，并明显更快，成本效益和高效。如果有重链和轻链序列，下面描述的一般克隆、表达、纯化和标记协议可应用于任何临床和非临床抗体。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

单克隆抗体是高亲和力多功能药物，通过可变的独立机制来消除癌细胞。在过去的几十年里，抗体药物结合剂、双特异性抗体、嵌合抗原受体（CAR）和癌症免疫治疗领域已成为基础和治疗研究最有希望的领域。随着无数成功的人体试验，以突破性的速度瞄准白血病和黑色素瘤中的免疫检查点受体和 CAR-T 细胞，对于抗体工程变异衍生的肿瘤治疗来说，这是非常激动人心的时刻。令人遗憾的是，由于肿瘤床中免疫效应细胞有限，大量抗体和基于 CAR 的治疗方法在实体癌症的人体试验中也被证明是令人失望的。重要的是，肿瘤以外的组织内治疗抗体的非特异性分布也导致缺乏临床疗效、相关毒性和临床失败。由于临床前研究忠实地转化为人类临床轨迹，高度依赖于小鼠肿瘤异种移植功效和安全研究，在这里我们重点介绍一种测试肿瘤和治疗抗体一般组织分布的方法。这是通过标记蛋白-A纯化抗体与近红外荧光染料，然后对肿瘤轴承小鼠进行活成像。

在所述方法中，首先我们克隆了针对叶酸受体α-1（FOLR1）的抗体，称为法莱图祖马布和lexatumumab的双特异性抗体，以及控制抗体，如阿巴戈沃马布（ 补充文件1中提供的序列）。图1A中显示了DNA克隆（pVH、pVL）中代表性变量重（VH）和可变光（VL） 域的详细信息。为了确认阳性克隆，我们使用信号肽向前（SP For）和CK Rev/CH3 Rev底转（补充文件1中提供的序列）进行了...

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Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

在这里，我们提出了一个方案，研究小鼠肿瘤异种移植模型中抗体的体内定位。

靶性抗原特异性治疗抗体的肿瘤及组织分布分析

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

该协议演示抗体的表达和纯化，以及肿瘤和组织抗体分布的实时监测。使用所述方案筛选抗体将有助于选择非特异性组织分布有限的抗体，并丰富肿瘤定位。所述技术快速且经济高效。其他技术，如单光子发射计算机断层扫描和正电子发射断层扫描，非常昂贵，需要放射性和其他精密的示踪剂。该技术不限于针对癌症的抗体。它可以应用于任何其他疾病，如肺或心脏病，用于分析体内的抗体分布。演示这个程序的将是杰里米盖茨曼，一个兽医技术员从我大学。在德隆，埃伦迈尔的200毫升介质中，生CHO细胞的烧瓶是迷惑不解的。将5毫升CHO自由式介质与50微克的可变重克隆DNA相结合，在15毫升管中结合75微克的可变轻克隆DNA。然后，旋转管子。将混合物留在室温下五分钟。将750微升（每毫升聚乙胺胺1毫克）添加到DNA溶液中，并积极旋转30秒。将混合物留在室温下再多五分钟。将整个混合物添加到CHO细胞中，同时手动摇动烧瓶。立即在37摄氏度下孵育细胞，同时在130 RPM下摇晃。第二天，向细胞添加两毫升100 X抗皱液，加入两毫升100 X抗菌抗菌抗肿瘤溶液。在32至34摄氏度下孵育烧瓶，在130 RPM时摇晃。继续培养细胞10至11天，每五天加入10毫升的 Trypton N1 饲料，每五天加入两毫升 100 X 谷氨酰胺补充剂。每三天对细胞进行计数，以确保细胞生存能力在第10天或第11天保持80%以上，通过将培养基在3000倍G和4摄氏度（4摄氏度）的40至60分钟内离心，收获抗体纯化的培养基。然后，使用 0.22 微米瓶过滤器过滤透明介质。为了净化抗体，用两列结合缓冲液平衡蛋白质 A 列。以每分钟一毫升的流速通过柱形过滤介质。然后用两列卷绑定缓冲区清洗列。使用五毫升洗脱缓冲液将抗体洗成500微升分数。通过加入10微升中和缓冲液进行分馏，中和所暗示抗体的pH值。使用 IgG 的默认协议使用分光光度计测量纯化抗体的浓度。透析 0.5 毫升抗体使用透析盒在一升结合缓冲液中。四个小时后，将透析盒转移到新鲜的缓冲液和透析过夜。为了建立结合反应，每一毫克抗体加入0.03微克的 IRR 染料 800 CWU，总体积为 500 微升。在20摄氏度下孵育混合物两小时，然后通过对PBS进行广泛透析来净化标记的结合体。通过测量染料780纳米的吸收度和280纳米的蛋白质的吸收度来估计标记的程度。要开发小鼠异种图，请轻轻抬起动物的皮肤，将其从底层肌肉层分离。用26针在皮肤下缓慢注射100微升细胞悬浮液。等待几秒钟，然后拿出针头，使地下室基质介质与皮肤下的细胞一起为半固体凝胶状结构提供信息，从而防止混合物从注射部位出来。要进行体内成像，请通过尾静脉注射标有抗体的染料。麻醉鼠标后，检查踏板反射反应不足，通过应用温水扩张静脉。使用 1cc 胰岛素注射器与 26 量针注射 25 微克标记的抗体在 100 微升的体积。作为负对，标记和注射非特异性IgG等型抗体，不针对癌细胞。在抗体注射后8、24和48小时进行体内成像。在成像软件中，单击初始化。确认舞台温度为 37 摄氏度。在控制面板中，通过成像向导设置荧光成像，将激发设置为 773 纳米，发射到 792 纳米。将麻醉小鼠转移到成像室。使用鼻锥将它放在成像场上。准备就绪后，单击用于图像采集的控制面板上的"获取"，然后单击"自动公开"。生成的图像是荧光覆盖在摄影图像上，以计数或光子单位显示光学荧光和密度。具有可变重域和可变光域的正 cDNA 克隆用聚落 PCR 得到确认。在非还原和减少 SDS 页面上运行的纯化 farletuzumab 的代表性结果如下所示。重链和轻链在减少后产生50和25千吨带。细胞表面抗体与原生蛋白质的结合也得到确认。荧光标记的抗体被注入尾静脉，移植到小鼠与完整的R1表达肿瘤。使用 IVIS 的动物在多个时间点被活图像。数据对肿瘤中完全R1和BaCa抗体的选择性富集。在尝试此协议时，请记住，保持CHO细胞对抗体产生至关重要。具有类似程度的荧光染料结合对于竞争性肿瘤定位具有十分重要。按照这个程序，其他方法，如组织免疫组织化学和组织或肿瘤特异性ELISA可以执行，以支持活鼠成像数据。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

单细胞下游特征的靶细胞预富集与全基因组扩增

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

科研

癌症研究

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

数字聚合酶链反应法测定零星家族性腺瘤性息肉病患者的基因变异

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

生成毛因诱导多能干细胞衍生的肿瘤抗原特异性胸腺移民的三维胸腺培养系统

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

体外肿瘤细胞恢复对 chimeric 抗原受体 t 细胞抗肿瘤功能的预测评价

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

在Vivo免疫荧光定位中用于评估癌症研究中的治疗和诊断抗体生物分布

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

利用人类诱导多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

分析肿瘤基因表达因子与CorExplorer门户网站

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

测量组织肿瘤组织切片的实时药物反应

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...