Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Vi er taknemmelige for University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolekylær Analyse Facility, Advanced Mikroskopi Facility og Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S er en tidlig karriere investigator af kræft i æggestokkene Academy (OCA-DoD). Dette arbejde blev støttet af NCI / NIH tilskud (R01CA233752) til J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) gennembrud niveau-1 tildeling til J. T-S (BC17097) og US DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) finansiering tildeling (OC180412) til J. T-S

Alle procedurer, der involverer dyr håndtering og tumor xenografts undersøgelser blev gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) her på University of Virginia og overholder de relevante lovgivningsmæssige standarder
1. Ekspression og rensning af antistoffer
<ol><li>Vedligeholdelse af CHO-celler<ol>
<li>Grow CHO celler i FreeStyle CHO Media suppleret med kommercielt tilgængelige 1x glutamin supplement ved 37 °C omrystning ved 130 rpm med 5% CO2 v...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

Selektiv og tumorvæv specifik levering af anti-cancer terapeutisk middel er nøglen til at måle effekten og sikkerheden af en given målrettet behandling13. Her har vi beskrevet en hurtig og effektiv tilgang til at undersøge den detaljerede væv og tumor fordeling af kliniske, farletuzumab og en ikke-klinisk BaCa antistof. Den beskrevne tilgang gælder for alle nygenererede antistof og kan bruges sammen med et klinisk effektivt antistof (med ønskede kvaliteter) for dets tumor / organ fordeling...

FDA godkendte det første monoklonale antistof rettet mod CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Siden da i de næste tyve år, har der været en hurtig eksplosion inden for antistof teknik på grund af den overvældende succes antistoffer mod immun checkpoint hæmmere3. Ved siden af indirekte aktivering af immunsystemet, antistoffer er rettet mod direkte flag kræftceller til præcist at engagere immun effektor celler, udløse cytotoksicitet via død receptor agonist, blokere tumor celle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vækst af blodkar), begrænse immun checkpoint regulatorer, levere radioisotoper, kemoterapi narkotika og siRNA som en konjugerede agenter2. Desuden er undersøgelse af enkeltkædede variable fragmenter (scFv) af forskellige antistoffer på overfladen af patientbaserede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et hurtigt voksende område af kliniske undersøgelser for cellebaserede behandlinger4.
Den ultra-høje affinitet af antistof-baserede lægemidler, der giver selektivitet til antigen udtrykke tumorceller gør det til et attraktivt middel. Ligeledes, den målrettede levering og tumor fastholdelse af et terapeutisk antistof (eller et kemisk stof) er nøglen til at afbalancere effekten over toksicitet. Derfor, et stort antal protein engineering baserede strategier, der omfatter, men er ikke begrænset til bisspecifikke5 og tri-specifikke antistoffer6 bliver udnyttet til væsentligt at øge ivrighed optimeret tumor tilbageholdelse af intravenøst (IV) injiceret terapeutiske5,7. Her beskriver vi en simpel fluorescens-baseret metode til at løse tumor og væv fordeling af potentielt effektive anti-cancer antistoffer.
Fordi animalsk væv besidder auto-fluorescens, når ophidset i synlige spektrum, antistofferne blev oprindeligt mærket med nær infrarød farvestof (f.eks IRDye 800CW). For proofs of concept undersøgelser, har vi gjort brug af folat receptor alpha-1 (FOLR1) rettet mod antistof kaldet farletuzumab og dens afledte kaldet Bispecific anker Cytotoksicitet aktivator (BaCa)7 antistof, der co-mål FOLR1 og død receptor-5 (DR5)8 i en rekombinant antistof. FOLR1 er en veldefineret overexpressed target receptor i æggestokkene og TNBC kræftceller, tumor xenografts og patient tumorer9. Især er der flere bestræbelser på klinisk at udnytte FOLR1 ved hjælp af antistof-baserede tilgange til at engagere immun effektor celler og antistof stof konjugater (ADC) for kræft i æggestokkene og brystkræft10,11.
I denne metode papir, vi klonede, udtrykt og renset klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrol antistoffer ved hjælp af CHO ekspressionssystem. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistof kaldet abagovomab12 blev anvendt som negative kontroller. Efter protein-A rensning, ingavede antistoffer blev mærket med IRDye 800CW og blev administreret i halen vene af nøgne mus enten forsynet ovarietumor xenografter eller stabilt transficeret humant FOLR1 udtrykke murine tyktarmskræft xenografts. Antistoflokaliseringen blev sporet af live imaging ved hjælp af in vivo-billeddannelsesspektrum på flere forskellige tidspunkter7. Denne metode kræver ikke nogen genetisk modifikation eller injektion af substratet for at muliggøre lysemission og er betydeligt hurtigere, omkostningseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, ekspressions-, rensnings- og mærkningsprotokol, der er beskrevet nedenfor, kan anvendes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistof, hvis der findes tunge og lette kædesekvenser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Monoklonale antistoffer er høj affinitet multifunktionelle lægemidler, der arbejder ved variable uafhængige mekanismer til at fjerne kræftceller. I løbet af de sidste par årtier, inden for antistof-drug konjugater, bispecifikke antistoffer, kimære antigen receptorer (CAR) og kræft immunterapi har vist sig som det mest lovende område af grundlæggende og terapeutiske undersøgelser. Med talrige vellykkede menneskelige forsøg rettet mod immun checkpoint receptorer og CAR-T celler i leukæmi og melanom i et gennembrud tempo, det er meget spændende tider for onkologisk terapi stammer fra variationer af antistof engineering. Desværre, et betydeligt stort antal antistof og CAR baseret terapeutiske har også vist sig skuffende i menneskelige forsøg med fast kræft på grund af den begrænsede tilgængelighed af immun effektor celler i tumorsengen. Vigtigere, uspecifik fordeling af terapeutiske antistoffer i andre væv end tumorer også bidrage til manglen på klinisk effekt, associeret toksicitet og klinisk svigt. Som trofast oversættelse af prækliniske undersøgelser i humane kliniske stier er stærkt afhængige af mus tumor xenograft effekt og sikkerhedsundersøgelser, her fremhæver vi en metode til at teste tumor og generelle væv fordeling af terapeutiske antistoffer. Dette opnås ved at mærke protein-A renset antistof med nær infrarød fluorescerende farvestof efterfulgt af levende billeddannelse af tumorbærende mus.

I den beskrevne metode klonede vi først antistoffer rettet mod folatreceptor alfa-1 (FOLR1) med navnet farletuzumab og et bispecifikt antistof kaldet BaCa bestående af farletuzumab og lexatumumab sammen med kontrolantistoffer som abagovomab (sekvenser i supplerende fil 1). Nærmere oplysninger om repræsentative variable tunge (VH) og variable lys (VL) domæner i DNA kloner (pVH, pVL) er vist i figur 1A. For at bekræfte de positive kloner udførte vi koloni-PCR ved hjælp...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Her præsenterer vi en protokol til at studere in vivo lokalisering af antistoffer i mus tumor xenograft modeller.

Analyse af tumor og væv distribution af Target Antigen specifikke terapeutiske antistof

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Denne protokol demonstrerer ekspression og rensning af antistoffer og realtidsovervågning af antistoffordeling i tumor og væv. Screening antistoffer med beskrevet protokol vil hjælpe med at vælge antistoffer, der har begrænset ikke-specifik vævsfordeling, og berige tumor lokaliseringer. Den beskrevne teknik er hurtig og omkostningseffektiv.Andre teknikker, såsom enkeltfoton emissions computertomografi og positron emission tomografi, er meget dyre og kræver radioaktive og andre avancerede sporstoffer. Teknikken er ikke begrænset til kræft rettet mod antistoffer. Det kan anvendes på enhver anden sygdom, såsom lunge-eller hjertesygdomme, til analyse af antistof fordeling i kroppen.Demonstration af proceduren, vil være Jeremy Gatesman, en veterinær tekniker fra mit universitet. Rå CHO celler i 200 milliliter medier, i Delong, Erlenmeyer forbløffet kolber. Kombiner fem milliliter CHO freestyle medier med 50 mikrogram variabel tung klon DNA, og 75 mikrogram en variabel lys klon DNA i en 15 milliliter rør.Så vortex røret. Lad blandingen være ved stuetemperatur i fem minutter. Tilsæt 750 mikroliter af en milligram per milliliter polyethylenimin lager til DNA-opløsning, og aggressivt vortex det i 30 sekunder.Lad blandingen være ved stuetemperatur i yderligere fem minutter. Hele blandingen til CHO-cellerne, mens kolben rystes manuelt. Straks inkubere cellerne ved 37 grader Celsius, mens ryste ved 130 RPM.På den næste dag, tilsæt to milliliter 100 X anti-sammenklumpningsmiddel, og to milliliter 100 X antibakterielle antimykotiske opløsning til cellerne. Kolber espøse ved 32 til 34 grader Celsius med rystelser ved 130 omdr./min. Fortsæt med at dyrke cellerne i 10 til 11 dage, tilføjer 10 milliliter Tryptone N1 foder, og to milliliter 100 X glutamin supplement på hver femte dag.Tæl cellerne på hver tredje dag for at sikre, at cellernes levedygtighed forbliver over 80% På dag 10 eller 11, høst mediet for antistofrensning ved centrifugering af kulturen ved 3000 gange G, og fire grader Celsius i 40 til 60 minutter. Filtrer derefter det klare medie med et 0,22 mikrometerflaskefilter. For at rense antistofferne skal proteinet A-kolonnen ligevægt med to kolonnemængder af bindingsbuffer.Før det filtrerede medie gennem kolonnen med en milliliter pr. minut. Vask derefter kolonnen med to kolonnemængder af bindingsbuffer. Brug fem milliliter elueringsbuffer til at fremkalde antistoffet i 500 mikroliterfraktioner.Og neutralisere pH af hentydede antistof ved at tilføje 10 mikroliter af neutralisering buffer for fraktion. Mål koncentrationen af det rensede antistof med et spektrofotometer ved hjælp af standardprotokollen for IgG. Dialyze 0,5 milliliter af antistoffet ved hjælp af en dialysekassette i en liter bøjningsbuffer.Efter fire timer overføres dialysekassetten til frisk buffer og dialyze natten over. For at oprette en bøjningsreaktion tilsættes 0,03 mikrogram IRR-farvestof 800 CWU pr. milligram antistof i et samlet volumen på 500 mikroliter. Inkuber blandingen i to timer ved 20 grader Celsius, derefter rense de mærkede konjugater ved omfattende dialyse mod PBS.Anslå mærkningsgraden ved at måle absorbansen af farvestoffet 780 nanometer og absorbans af proteinet ved 280 nanometer. For at udvikle muse xenographs, forsigtigt løfte huden af dyret og adskille det fra den underliggende muskel lag. Injicer langsomt 100 mikroliter cellesuspension under huden med en 26 gauge nål.Vent et par sekunder, før du tager nålen ud, så kælderen matrix medium informere semi-solid gel-lignende struktur sammen med celler under huden, som vil forhindre blandingen i at komme ud af injektionsstedet. For at udføre in vivo billeddannelse skal farvestoffet mærket antistof injiceres via hale venen. Efter bedøvelse af musen, kontrollere for den manglende reaktion på pedal reflekser, og spile venen ved at anvende varmt vand.Brug en 1cc insulin sprøjte med en 26 gauge nål til at injicere 25 mikrogram af det mærkede antistof i et volumen på 100 mikroliter. Som en negativ kontrol, etiket og injicere den ikke-specifikke IgG isotype antistof, som ikke er rettet mod kræftceller. In vivo-billeddannelse udføres otte, 24 og 48 timer efter antistofinjektninger.Klik på initialiser i billedsoftwaren. Bekræft, at scenetemperaturen er 37 grader Celsius. I kontrolpanelet, oprette fluorescens imaging gennem billeddannelse guiden, og indstille excitation til 773 nanometer, emission til 792 nanometer.Overfør den bedøvede mus ind i billedkammeret. Placer den på billedfeltet ved hjælp af næsekeveen. Når du er klar, skal du klikke på anskaffe på kontrolpanelet for billedet erhvervelse, og klik auto eksponere.Det genererede billede er overlejringen af fluorescensen på det fotografiske billede med optisk fluorescens og tæthed, der vises i enheder af optællinger eller fotoner. Positive cDNA kloner med variable tunge og variable lys domæner blev bekræftet med koloni PCR. Repræsentative resultater af renset farletuzumab køre på ikke-reducerende og reducerende SDS side er vist her.Tunge og lette kæder producerede 50 og 25 kilodaltonbånd efter reduktion. Binding af antistoffer til indfødte proteiner i celleoverfladen blev også bekræftet. Fluorescerende mærket antistoffer blev hale vene injiceret, i mus podet med fuld R1 udtrykke tumorer.Dyr blev levet billede på flere tidspunkter ved hjælp af IVIS. data confirs selektiv berigelse af fuld R1 og BaCa antistoffer i tumorer. Når du forsøger denne protokol, Huske på, at holdt vedligeholdelse af CHO celler er afgørende for antistof udbytte.Og det er vigtigt at have en lignende grad af fluorescerende farvestof bøjning for konkurrencedygtige tumor lokalisering. Efter denne procedure, andre metoder såsom væv immunohistokemi og væv eller tumor specifikke ELISA kan udføres for at støtte de levende mus billeddannelse data.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target Cell pre berigelse og hele genom forstærkning for enkelt celle Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for den genetiske Variation i en sporadisk familiær adenomatøs polypose Patient med formatet Chip i rør

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensionel Thymisk kultur system til at generere murine induceret pluripotente stamcelle-afledte tumor antigen-specifikke Thymisk emigranter

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro Tumor celle Rechallenge For intelligent evaluering af kimære Antigen Receptor T-celle Antitumor funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo immunofluorescens lokalisering til vurdering af terapeutisk og diagnostisk antistof Biodistribution i kræftforskning

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Anvendelse af menneskeskabte pluripotente stamceller til generering af tumor antigen-specifikke T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Analyse af tumor Genekspressions faktorer med CorExplorer-webportalen

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måling Real-time Drug Response i organotypic tumorvæv skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...