Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

We zijn de Universiteit van Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomoleculaire Analyse Faciliteit, Advanced Microscopy Facility en de Core Vivarium Facility for Assistance dankbaar. J. T-S is een vroege carrière onderzoeker van Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dit werk werd ondersteund door NCI / NIH subsidie (R01CA233752) aan J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) doorbraak level-1 award aan J. T-S (BC17097) en U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) financiering award (OC180412) aan J. T-S

Alle procedures met betrekking tot dieren behandeling en tumor xenografts studies werden herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hier aan de Universiteit van Virginia en voldoen aan de relevante wettelijke normen
1. Expressie en zuivering van antilichamen
<ol><li>Onderhoud van CHO-cellen<ol>
<li>Kweek CHO cellen in FreeStyle CHO Media aangevuld met commercieel verkrijgbare 1x glutamine supplement bij 37 °C schudden bij 130 rpm met 5% CO2...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

Selectieve en tumorweefsel specifieke levering van anti-kanker therapeutisch middel is de sleutel tot het meten van de werkzaamheid en veiligheid van een bepaalde gerichte therapie13. Hier hebben we een snelle en efficiënte aanpak beschreven om de gedetailleerde weefsel- en tumordistributie van klinische, farletuzumab en een niet-klinisch BaCa-antilichaam te onderzoeken. De beschreven aanpak is van toepassing op elk nieuw gegenereerd antilichaam en kan worden gebruikt naast een klinisch effectief...

FDA keurde het eerste monoklonale antilichaam dat CD3 (OKT3, Muromonab) richt in 1986goed 1,2. Sindsdien voor de komende twintig jaar, is er een snelle explosie op het gebied van antilichaam engineering als gevolg van het overweldigende succes van antilichamen tegen immuun checkpoint remmers3. Naast indirecte activering van het immuunsysteem, antilichamen worden gericht op het direct markeren van kankercellen om precies te betrekken immuun effector cellen, trigger cytotoxiciteit via death receptor agonist, blokkeren tumorcel overleving signalering, obstructie van angiogenese (groei van bloedvaten), beperken immuun regulator checkpoints, leveren radio-isotopen, chemotherapie drugs en siRNA als een geconjugeerde middelen2. Daarnaast is het bestuderen van de variabele fragmenten van de enkele keten (scFv) van verschillende antilichamen op het oppervlak van door de patiënt afgeleide T-cellen en NK-cellen (CAR-T en CAR-NK) een snel groeiend gebied van klinische onderzoeken voor celgebaseerde therapieën4.
De ultrahoge affiniteit van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen die selectiviteit biedt aan antigeenexpressie tumorcellen maakt het een aantrekkelijk middel. Ook de gerichte levering en tumorretentie van een therapeutisch antilichaam (of een chemisch medicijn) is de sleutel tot evenwicht werkzaamheid over toxiciteit. Daarom wordt een groot aantal op eiwitengineering gebaseerde strategieën uitgebuit die geen bispecifieke5- en tri-specifieke antilichamen6 bevatten, om de avidity optimized tumorretentie van intraveneus (IV) geïnjecteerde therapieën5,7aanzienlijk te verbeteren . Hier beschrijven we een eenvoudige fluorescentie gebaseerde methode om de tumor- en weefselverdeling van potentieel effectieve anti-kankerantilichamen aan te pakken.
Omdat dierlijke weefsels autofluorescentie bezitten wanneer ze opgewonden zijn in zichtbaar spectrum, werden de antilichamen aanvankelijk gelabeld met nabij Infrarood kleurstof (bijvoorbeeld IRDye 800CW). Voor proofs of concept investigations, hebben we gebruik gemaakt van foliumzuur receptor alpha-1 (FOLR1) gericht op antilichaam genaamd farletuzumab en de afgeleide genaamd Bispecifieke anker Cytotoxiciteit activator (BaCa)7 antilichaam dat co-doelen FOLR1 en death receptor-5 (DR5)8 in een recombinant antilichaam. FOLR1 is een goed gedefinieerde overexpressed doelreceptor in eierstokkanker- en TNBC-kankercellen, tumor xenografts en patiënttumoren9. Met name zijn er meerdere inspanningen om folr1 klinisch te exploiteren met behulp van op antilichamen gebaseerde benaderingen om immuuneffectorcellen en antilichaammedicatie (ADC) in te schakelen voor eierstokkanker en borstkanker10,11.
In deze methoden papier, we gekloond, uitgedrukt en gezuiverd klinische anti-FOLR1 (farletuzumab) samen met andere controle antilichamen met behulp van CHO expressie systeem. IgG1 isotype en een klinische anti-idiotype mucin-16 antilichaam genaamd abagovomab12 werden gebruikt als negatieve controles. Na eiwit-A zuivering, geïndiceerde antilichamen werden gelabeld met IRDye 800CW en werden toegediend in de staart ader van naakte muizen ofwel met eierstokkanker xenografts of stabiel getransfecteerd menselijke FOLR1 uitdrukken murine dikke darmkanker xenografts. De lokalisatie van antilichamen werd gevolgd door live beeldvorming met behulp van in vivo beeldspectrum op meerdere verschillende tijdstippen7. Deze methode vereist geen genetische modificatie of injectie van het substraat om lichtemissie mogelijk te maken en is aanzienlijk sneller, kosteneffectief en efficiënt. Het hieronder beschreven algemene kloon-, expressie-, zuiverings- en etiketteringsprotocol kan worden toegepast op elk klinisch en niet-klinisch antilichaam als er zware en lichte kettingsequenties beschikbaar zijn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Monoklonale antilichamen zijn hoge affiniteit multifunctionele geneesmiddelen die werken door variabele onafhankelijke mechanismen om kankercellen te elimineren. In de afgelopen decennia is het gebied van antilichaam-drug conjugaten, bispecifieke antilichamen, chimerische antigeenreceptoren (CAR) en kankerimmunotherapie naar voren gekomen als het meest veelbelovende gebied van basis- en therapeutische onderzoeken. Met tal van succesvolle menselijke proeven gericht op immuun checkpoint receptoren en CAR-T cellen in leukemie en melanoom in een doorbraak tempo, het is zeer spannende tijden voor oncologische therapieën afgeleid van variaties van antilichaam engineering. Helaas, een aanzienlijk groot aantal antilichamen en CAR gebaseerde therapieën hebben ook bewezen teleurstellend in menselijke proeven van vaste kankers vanwege de beperkte beschikbaarheid van immuun-effector cellen in de tumor bed. Belangrijk is dat niet-specifieke distributie van therapeutische antilichamen in andere weefsels dan tumoren ook bijdraagt aan het gebrek aan klinische werkzaamheid, bijbehorende toxiciteit en klinisch falen. Zoals getrouwe vertaling van preklinische studies in menselijke klinische paden zijn sterk vertrouwd op muizen tumor xenograft werkzaamheid en veiligheid studies, hier wijzen we op een methode om de tumor en de algemene weefseldistributie van therapeutische antilichamen te testen. Dit wordt bereikt door het etiketteren van de eiwit-Een gezuiverd antilichaam met in de buurt infrarood fluorescerende kleurstof gevolgd door live beeldvorming van tumordragende muizen.

In de beschreven methodologie hebben we eerst antilichamen gekloond die zich richten op foliumreceptor alpha-1 (FOLR1) genaamd farletuzumab, en een bispecifiek antilichaam genaamd BaCa bestaande uit farletuzumab en lexatumumab, samen met controleantilichamen zoals abagovomab (sequenties in aanvullend bestand 1). Details van representatieve variabele zware (VH) en variabele licht (VL) domeinen in DNA klonen (pVH, pVL) worden weergegeven in figuur 1A. Om de positieve klonen te...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Dit protocol toont de expressie en zuivering van antilichamen en real-time monitoring van de distributie van antilichamen in tumor en weefsel. Screening antilichamen met beschreven protocol zal helpen bij het selecteren van antilichamen die een beperkte niet-specifieke weefselverdeling hebben, en verrijken tumorlokalisaties. De beschreven techniek is snel en kosteneffectief.Andere technieken, zoals single-photon emissie computertomografie en positron emissie tomografie, zijn erg duur en vereisen radioactieve en andere geavanceerde tracers. De techniek is niet beperkt tot kanker gericht op antilichamen. Het kan worden toegepast op een andere ziekte, zoals long- of hartziekten, voor de analyse van de distributie van antilichamen in het lichaam.Het aantonen van de procedure, zal Jeremy Gatesman, een dierenarts technicus van mijn universiteit. Ruwe CHO cellen in 200 milliliter media, in Delong, Erlenmeyer verbijsterd kolven. Combineer vijf milliliter CHO freestyle media met 50 microgram variabele zware kloon DNA, en 75 microgram een variabele licht kloon DNA in een 15 milliliter buis.Dan, draai de buis. Laat het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 750 microliter van een milligram per milliliter polyethyleen voorraad aan de DNA-oplossing, en agressief vortex gedurende 30 seconden.Laat het mengsel op kamertemperatuur gedurende een extra vijf minuten. Voeg het hele mengsel toe aan de CHO-cellen terwijl u de kolf handmatig schudt. Onmiddellijk incubeer de cellen op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 130 RPM.Op de volgende dag, voeg twee milliliter van 100 X anti-klonterend middel, en twee milliliter van 100 X antibacteriële antimycotische oplossing aan de cellen. Incubeer de kolven op 32 tot 34 graden Celsius, met schudden bij 130 RPM. Doorgaan met het kweken van de cellen gedurende 10 tot 11 dagen, het toevoegen van 10 milliliter tryptone N1 diervoeder, en twee milliliter van 100 X glutamine supplement op elke vijfde dag.Tel de cellen op elke derde dag om ervoor te zorgen dat de levensvatbaarheid van de cel boven de 80% blijft Op dag 10 of 11, oogst het medium voor antilichaamzuivering door de cultuur te centrifugeren op 3000 keer G en vier graden Celsius gedurende 40 tot 60 minuten. Vervolgens filter je de heldere media met een flesfilter van 0,22 micrometer. Om de antilichamen te zuiveren, equilibrate het eiwit A kolom met twee kolomvolumes van bindende buffer.Geef de gefilterde media door de kolom met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Was vervolgens de kolom met twee kolomvolumes van bindende buffer. Gebruik vijf milliliter elutiebuffer om het antilichaam in 500 microliterfracties te ontwijken.En neutraliseer de pH van het gezinspeelde antilichaam door 10 microliter neutralisatiebuffer voor breuk toe te voegen. Meet de concentratie van het gezuiverde antilichaam met een spectrofotometer met behulp van het standaardprotocol voor IgG. Dialyse 0,5 milliliter van het antilichaam met behulp van een dialysecassette in een liter vervoegingsbuffer.Na vier uur zet u de dialysecassette over naar een verse buffer en dialyseren 's nachts. Om een vervoegingsreactie op te zetten, voeg 0,03 microgram IRR-kleurstof 800 CWU per één milligram antilichaam toe in een totaal volume van 500 microliter. Broed het mengsel twee uur bij 20 graden Celsius en zuiver vervolgens de gelabelde vervoeging door uitgebreide dialyse tegen PBS.Schat de mate van etikettering door het meten van de absorptie van de kleurstof 780 nanometer, en absorptie van het eiwit op 280 nanometer. Om muis xenografen te ontwikkelen, til je voorzichtig de huid van het dier op en scheid het van de onderliggende spierlaag. Injecteer langzaam 100 microliter celsuspensie onder de huid met een naald van 26 meter.Wacht een paar seconden voordat u de naald eruit haalt, zodat het medium keldermatrix de semi-solide gelachtige structuur informeert, samen met cellen onder de huid, die voorkomen dat het mengsel uit de injectieplaats komt. Om in vivo beeldvorming uit te voeren, injecteer de kleurstof gelabeld antilichaam via de staart ader. Controleer na het verdoven van de muis op het gebrek aan respons op pedaalreflexen en verwijd de ader door warm water aan te brengen.Gebruik een 1cc insulinespuit met een 26-meterige naald om 25 microgram van het gelabelde antilichaam in een volume van 100 microliters te injecteren. Als een negatieve controle, label en injecteer het niet-specifieke IgG isotype antilichaam dat niet gericht is op kankercellen. Voer in vivo beeldvorming uit acht, 24 en 48 uur na antilichaaminjecties.Klik in de beeldsoftware op initialiseren. Bevestig dat de temperatuur 37 graden Celsius is. In het bedieningspaneel, het opzetten van fluorescentie beeldvorming door de imaging wizard, en zet de excitatie op 773 nanometer, emissie op 792 nanometer.Breng de verdoofde muis over naar de beeldkamer. Plaats het op het beeldvormingsveld met behulp van de neuskegel. Klik als u klaar bent op acquire op het configuratiescherm voor de afbeeldingsverwerving en klik op automatisch bloot.Het gegenereerde beeld is de overlay van de fluorescentie op het fotografische beeld met optische fluorescentie en dichtheid weergegeven in eenheden van tellingen of fotonen. Positieve cDNA klonen met variabele zware en variabele lichtdomeinen werden bevestigd met kolonie PCR. Representatieve resultaten van gezuiverde farletuzumab draaien op niet-reducerende en verminderende SDS-pagina worden hier weergegeven.Zware en lichte kettingen produceerden 50 en 25 kilodalton banden na reductie. Ook werd het binden van antilichamen aan inheemse eiwitten in het celoppervlak bevestigd. Fluorescerend gelabelde antilichamen waren staartader geïnjecteerd, in muizen geënt met volledige R1 uitdrukken tumoren.Dieren waren geleefd beeld op meerdere tijdstippen met behulp van IVIS. de gegevens confirs selectieve verrijking van volledige R1 en BaCa antilichamen in de tumoren. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat het onderhoud van CHO-cellen van cruciaal belang is voor de opbrengst van antilichamen.En het is belangrijk om een vergelijkbare mate van fluorescerende kleurstof vervoeging voor concurrerende tumor lokalisatie. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals weefselimmunochemische stoffen en weefsel- of tumorspecifieke ELISA om de live muizenbeeldvormingsgegevens te ondersteunen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Een driedimensionaal Thymic cultuur systeem voor het genereren van Murine geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige tumor antigen-specifieke Thymic emigranten

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

In Vitro Tumor cel Rechallenge voor voorspellende evaluatie van chimeer antigeen Receptor T cel antitumorale functie

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het genereren van tumor-antigeen-specifieke T-cellen

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Het analyseren van tumor genexpressie factoren met de CorExplorer Web Portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Het meten van real-time drug respons in organotypic Tumor Tissue Slices

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...