Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
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Nous sommes reconnaissants à l’Université de Virginie Cancer Center Centre Centre d’imagerie de base, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility et le Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S est un chercheur en début de carrière de l’Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Ces travaux ont été appuyés par la subvention de l’INFE/NIH (R01CA233752) à J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) breakthrough level-1 award to J. T-S (BC17097) et U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) funding award (OC180412) to J. T-S

Toutes les procédures concernant la manipulation des animaux et les études sur les xénogreffes tumorales ont été examinées et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ici à l’Université de Virginie et conformes aux normes réglementaires pertinentes
1. Expression et purification des anticorps
<ol><li>Entretien des cellules CHO<ol>
<li>Cultivez les cellules CHO dans FreeStyle CHO Media complétées par un supplément de glutamine 1x disponible dans le ...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

La livraison sélective et spécifique de tissu de tumeur de l’agent thérapeutique anticancéreux est la clé pour mesurer l’efficacité et l’innocuité d’une thérapie cibléedonnée 13. Ici nous avons décrit une approche rapide et efficace pour étudier la distribution détaillée de tissu et de tumeur du clinicien, du farletuzumab et d’un anticorps nonclinique de BaCa. L’approche décrite est applicable à n’importe quel anticorps nouvellement généré et peut être employée a...

Fda a approuvé le premier anticorps monoclonal ciblant CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Depuis lors, pendant les vingt prochaines années, il ya eu une explosion rapide dans le domaine de l’ingénierie des anticorps en raison du succès écrasant des anticorps contre les inhibiteurs du point decontrôle immunitaire 3. Outre l’activation indirecte du système immunitaire, les anticorps visent à signaler directement les cellules cancéreuses pour engager avec précision les cellules effectrices immunitaires, déclencher la cytotoxicité par l’intermédiaire de l’agoniste des récepteurs de la mort, bloquer la signalisation de survie des cellules tumorales, obstruer l’angiogenèse (croissance des vaisseaux sanguins), contraindre les régulateurs de contrôle immunitaires, délivrer des radioisotopes, des agents chimiothérapeutiques et de l’ARN comme agents conjugués2. En outre, l’étude des fragments variables à chaîne unique (scFv) de divers anticorps à la surface des cellules T dérivées du patient et des cellules NK (CAR-T et CAR-NK) est un domaine en croissance rapide des investigations cliniques pour les thérapies cellulaires4.
L’affinité ultra-élevée des médicaments à base d’anticorps qui fournit la sélectivité à l’antigène exprimant les cellules tumorales en fait un agent attrayant. De même, l’accouchement ciblé et la rétention tumorale d’un anticorps thérapeutique (ou d’un médicament chimique) est la clé pour équilibrer l’efficacité sur la toxicité. Par conséquent, un grand nombre de stratégies basées sur l’ingénierie protéique qui incluent mais ne sont pas limitées aux anticorps bispécifiques5 et tri-spécifiques6 sont exploitées pour augmenter sensiblement la conservation optimisée de tumeur d’avidité des thérapeutiques injectées par voie intraveineuse (IV)5,7. Ici, nous décrivons une méthode basée sur la fluorescence simple pour adresser la distribution de tumeur et de tissu des anticorps anticancéreux potentiellement efficaces.
Puisque les tissus animaux possèdent l’auto-fluorescence une fois excités dans le spectre visible, les anticorps ont été au commencement étiquetés avec le colorant infrarouge proche (par exemple, IRDye 800CW). Pour des preuves d’études de concept, nous avons utilisé le récepteur folique alpha-1 (FOLR1) ciblant l’anticorps appelé farletuzumab et son dérivé appelé activateur d’ancrage bispécifique Cytotoxicity (BaCa)7 qui co-cible FOLR1 et récepteur de la mort-5 (DR5)8 dans un anticorps recombinant. FOLR1 est un récepteur cible surexprimé bien défini dans les cellules cancéreuses ovariennes et TNBC, les xénogreffes tumorales et les tumeurs patientes9. Il y a notamment de multiples efforts pour exploiter cliniquement FOLR1 à l’aide d’approches à base d’anticorps pour engager les cellules effectrices immunitaires et les conjugués anticorps (ADC) pour les cancersde l’ovaire et du sein 10,11.
Dans cet article de méthodes, nous avons cloné, exprimé et purifié anti-FOLR1 clinique (farletuzumab) avec d’autres anticorps de contrôle utilisant le système d’expression de CHO. L’isotype IgG1 et un anticorps clinique anti-idiotype mucin-16 appelé abagovomab12 ont été utilisés comme témoins négatifs. Après purification de protéine-A, les anticorps indiqués ont été étiquetés avec IRDye 800CW et ont été administrés dans la veine de queue des souris nues portant des xénogreffes de tumeur ovarienne ou folr1 humain habilement transfected exprimant des xénogreffes de cancer du côlon murine. La localisation des anticorps a été suivie par imagerie en direct à l’aide du spectre d’imagerie in vivo à plusieurs momentsdifférents 7. Cette méthode ne nécessite aucune modification génétique ou injection du substrat pour permettre l’émission de lumière et est beaucoup plus rapide, rentable et efficace. Le protocole général de clonage, d’expression, de purification et d’étiquetage décrit ci-dessous peut être appliqué à n’importe quel anticorps clinique et nonclinique si des séquences de chaîne lourde et légère sont disponibles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Les anticorps monoclonaux sont des médicaments multifonctionnels à haute affinité qui fonctionnent par des mécanismes indépendants variables pour éliminer les cellules cancéreuses. Au cours des dernières décennies, le domaine des anticorps conjugués, des anticorps bispécifiques, des récepteurs d’antigène chimérique (RCA) et de l’immunothérapie contre le cancer est devenu le domaine le plus prometteur des investigations fondamentales et thérapeutiques. Avec de nombreux essais humains réussis ciblant les récepteurs des points de contrôle immunitaires et les cellules CAR-T dans la leucémie et le mélanome à un rythme révolutionnaire, c’est une période très excitante pour les thérapeutiques oncologiques dérivées de variations de l’ingénierie des anticorps. Malheureusement, un nombre significativement élevé d’anticorps et de thérapies basées sur la RCA se sont également avérés décevants dans les essais humains des cancers solides en raison de la disponibilité limitée des cellules immunisées d’effecteur dans le lit de tumeur. Fait important, la distribution non spécifique d’anticorps thérapeutiques dans des tissus autres que les tumeurs contribue également au manque d’efficacité clinique, à la toxicité associée et à l’échec clinique. Comme la traduction fidèle des études précliniques dans les traînées cliniques humaines sont fortement comptées sur des souris tumeur xénogreffe efficacité et études d’innocuité, ici nous soulignons une méthode pour tester la tumeur et la distribution générale de tissu des anticorps thérapeutiques. Ceci est réalisé en étiquetant l’anticorps purifié de protéine-A avec le colorant fluorescent proche infrarouge suivi de l’imagerie vivante des souris porteuses de tumeur.

Dans la méthodologie décrite, nous avons d’abord cloné des anticorps ciblant le récepteur folique alpha-1 (FOLR1) nommé farletuzumab, et un anticorps bispécifique appelé BaCa composé de farletuzumab et de lexatumumab ainsi que d’anticorps témoins tels que l’abagovomab (séquences fournies dans le fichier supplémentaire 1). Les détails des domaines représentant variable lourd (VH) et à lumière variable (VL) dans les clones d’ADN (pVH, pVL) sont indiqués dans la ...

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Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Ici nous présentons un protocole pour étudier la localisation in vivo des anticorps dans les modèles de xénogreffe de tumeur de souris.

Analyse de la distribution des tumeurs et des tissus de l’anticorps thérapeutique spécifique à l’antigène cible

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Ce protocole démontre l’expression et la purification des anticorps et la surveillance en temps réel de la distribution des anticorps dans la tumeur et les tissus. Le criblage des anticorps avec le protocole décrit aidera à sélectionner des anticorps qui ont la distribution non spécifique limitée de tissu, et enrichira des localisations de tumeur. La technique décrite est rapide et rentable.D’autres techniques, telles que la tomographie calculée par émission d’un seul photon et la tomographie par émission de positons, sont très coûteuses et nécessitent des traceurs radioactifs et d’autres traceurs sophistiqués. La technique ne se limite pas aux anticorps ciblant le cancer. Il peut être appliqué à toute autre maladie, comme les maladies pulmonaires ou cardiaques, pour l’analyse de la distribution des anticorps dans le corps.Jeremy Gatesman, un technicien vétérinaire de mon université, fera la démonstration de la procédure. Cellules CHO brutes dans 200 millilitres de médias, dans Delong, Erlenmeyer flacons déconcertés. Combinez cinq millilitres de cho freestyle media avec 50 microgrammes d’ADN variable de clone lourd, et 75 microgrammes un ADN variable de clone de lumière dans un tube de 15 millilitres.Ensuite, vortex le tube. Laisser le mélange à température ambiante pendant cinq minutes. Ajouter 750 microlitres d’un milligramme par millilitre de stock de polyéthyllène à la solution d’ADN, et vortex agressif pendant 30 secondes.Laisser le mélange à température ambiante pendant cinq minutes supplémentaires. Ajouter tout le mélange aux cellules CHO tout en secouant manuellement le flacon. Incuber immédiatement les cellules à 37 degrés Celsius tout en secouant à 130 RPM.Le lendemain, ajouter deux millilitres de 100 X agent anti-agglutination, et deux millilitres de 100 X solution antibactérienne antimycotique aux cellules. Incuber les flacons à 32 à 34 degrés Celsius, avec des secousses à 130 RPM. Continuer à culturer les cellules pendant 10 à 11 jours, en ajoutant 10 millilitres d’alimentation Tryptone N1, et deux millilitres de supplément de glutamine 100 X tous les cinq jours.Comptez les cellules tous les trois jours pour s’assurer que la viabilité cellulaire reste supérieure à 80 % Le jour 10 ou 11, récoltez le milieu pour la purification des anticorps en centrifugant la culture à 3 000 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 40 à 60 minutes. Filtrez ensuite le média clair à l’aide d’un filtre à bouteille de 0,22 micromètre. Pour purifier les anticorps, équilibrer la colonne protéine A avec deux volumes de colonne de tampon liant.Passez le média filtré à travers la colonne à la vitesse d’écoulement d’un millilitre par minute. Ensuite, lavez la colonne avec deux volumes de colonne de tampon de liaison. Utilisez cinq millilitres de tampon d’élitution pour émiguier l’anticorps en 500 fractions de microlitres.Et neutraliser le pH de l’anticorps fait allusion en ajoutant 10 microlitres de tampon de neutralisation pour la fraction. Mesurer la concentration de l’anticorps purifié à l’aide d’un spectrophotomètre à l’aide du protocole par défaut pour IgG. Dialyze 0,5 millilitres de l’anticorps à l’aide d’une cassette de dialyse dans un litre de tampon de conjugaison.Après quatre heures, transférer la cassette de dialyse dans un tampon frais et dialyser pendant la nuit. Pour mettre en place une réaction de conjugaison, ajouter 0,03 microgramme de colorant IRR 800 CWU par milligramme d’anticorps dans un volume total de 500 microlitres. Incuber le mélange pendant deux heures à 20 degrés Celsius, puis purifier les conjugués étiquetés par dialyse étendue contre PBS.Estimer le degré d’étiquetage en mesurant l’absorption du colorant 780 nanomètres, et l’absorption de la protéine à 280 nanomètres. Pour développer des xénographes de souris, soulevez doucement la peau de l’animal et séparez-la de la couche musculaire sous-jacente. Injectez lentement 100 microlitres de suspension cellulaire sous la peau avec une aiguille de calibre 26.Attendez quelques secondes avant de sortir l’aiguille afin que le milieu matriciel du sous-sol informe la structure semi-solide en forme de gel ainsi que les cellules sous la peau, ce qui empêchera le mélange de sortir du site d’injection. Pour effectuer l’imagerie in vivo, injectez l’anticorps étiqueté colorant par la veine de la queue. Après anesthésier la souris, vérifiez le manque de réponse aux réflexes de pédale, et dilatez la veine en appliquant de l’eau chaude.Utilisez une seringue à insuline 1cc avec une aiguille de calibre 26 pour injecter 25 microgrammes de l’anticorps étiqueté dans un volume de 100 microlitres. Comme un contrôle négatif, étiqueter et injecter l’anticorps isotype IgG non spécifique qui ne cible pas les cellules cancéreuses. Effectuez l’imagerie in vivo huit, 24 et 48 heures après les injections d’anticorps.Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur initialiser. Confirmez que la température de l’étape est de 37 degrés Celsius. Dans le panneau de contrôle, configurer l’imagerie par fluorescence par l’intermédiaire de l’assistant d’imagerie, et définir l’excitation à 773 nanomètres, émission à 792 nanomètres.Transférer la souris anesthésiée dans la chambre d’imagerie. Placez-le sur le champ d’imagerie à l’aide du cône avant. Une fois prêt, cliquez sur acquérir sur le panneau de contrôle pour l’acquisition de l’image, et cliquez sur exposer automatiquement.L’image générée est la superposition de la fluorescence sur l’image photographique avec fluorescence optique et densité affichées dans des unités de dénombrements ou de photons. Des clones positifs de cDNA avec les domaines lourds et variables variables de lumière ont été confirmés avec le PCR de colonie. Les résultats représentatifs de farletuzumab purifié exécuté sur la page de SDS non-réduisant et réduisant sont montrés ici.Les chaînes lourdes et légères produisaient 50 et 25 bandes de kilodalton après réduction. La liaison des anticorps aux protéines indigènes dans la surface de cellules a également été confirmée. Les anticorps fluorescents étiquetés étaient la veine de queue injectée, dans les souris greffées avec les tumeurs pleines d’expression de R1.Les animaux ont été vécus image à plusieurs moments en utilisant IVIS. les données confirs enrichissement sélectif des anticorps R1 et BaCa complets dans les tumeurs. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que le maintien des cellules CHO est essentiel pour le rendement des anticorps.Et il est important d’avoir un degré semblable de conjugaison fluorescente de colorant pour la localisation compétitive de tumeur. Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunohistochimie tissulaire et le tissu ou la tumeur spécifique ELISA peuvent être effectuées pour soutenir les données d’imagerie des souris vivantes.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Cible cellulaire pré-enrichissement et Whole Genome Amplification pour la cellule unique caractérisation en aval

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un système de culture thymique tridimensionnel pour générer murine induite Pluripotent Stem Cell-dérivé Des émigrants thymiques spécifiques à l'antigène

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In Vivo Immunofluorescence Localisation pour l'évaluation de la biodistribution thérapeutique et diagnostique des anticorps dans la recherche sur le cancer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Analyse des facteurs d'expression des gènes tumoraux avec le portail Web CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Mesurer la réponse en temps réel des médicaments dans les tranches de tissu tumoral organotypique

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...