Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

אנו אסירי תודה אוניברסיטת וירג'יניה סרטן מרכז הליבה הדמיה מתקן, מתקן ניתוח ביומולקולרי, מתקן מיקרוסקופ מתקדם ומתקן הליבה Vivarium לסיוע. J. T-S הוא חוקר קריירה מוקדמת של האקדמיה לסרטן השחלות (OCA-DoD). עבודה זו נתמכה על ידי מענק NCI/NIH (R01CA233752) ל J. T-S, ארה"ב. משרד העבודה סרטן השד תוכנית לחקר סרטן השד (BCRP) פריצת דרך ברמה 1 פרס J. T-S (BC17097) ו U.S. משרד העבודה סרטן סרטן התוכנית לחקר (OCRP) פרס מימון (OC180412) כדי J.

כל ההליכים הכרוכים בטיפול בבעלי חיים ובחקרי גידולים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) כאן באוניברסיטת וירג'יניה ותואמת את הסטנדרטים הרגולטוריים הרלוונטיים
1. ביטוי וטיהור נוגדנים
<ol><li>תחזוקה של תאי CHO<ol>
<li>לגדול תאי CHO ב FreeStyle CHO מדיה בתוספת עם ...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

משלוח סלקטיבי ותו לא רקמות גידול ספציפי של סוכן טיפולי נגד סרטן הוא המפתח למדיטת יעילות ובטיחות של טיפול ממוקד נתון13. כאן תיארנו גישה מהירה ויעילה לחקור את התפלגות רקמות וגידול מפורט של קליני, farletuzumab ונוגדן BaCa לא קליני. הגישה המתוארת ישימה לכל נוגדן חדש שנוצר וניתן להשתמש בה ל...

ה-FDA אישר את הנוגדן המונוקלונלי הראשון מיקוד CD3 (OKT3, Muromonab) בשנת 19861,2. מאז, בעשרים השנים הבאות, היה פיצוץ מהיר בתחום הנדסת נוגדנים בשל ההצלחה המוחצת של נוגדנים נגד מעכבי מחסום חיסוני3. לצד הפעלה עקיפה של המערכת החיסונית, נוגדנים נועדו ישירות לסמן תאים סרטניים כדי לעסוק במדויק בתאי השפעה חיסונית, לעורר cytotoxicity באמצעות אגוניסט קולטן מוות, לחסום איתות הישרדות תאים סרטניים, לחסום אנגיוגנזה (צמיחה של כלי דם), להגביל את הרגולטורים מחסום חיסוני, לספק radioisotopes, תרופות כימותרפיות siRNAכסוכנים בהסכם 2. בנוסף, לימוד שברי משתנה שרשרת יחיד (scFv) של נוגדנים שונים על פני השטח של המטופל נגזר T-תאים ותאי NK (CAR-T ו CAR-NK) הוא אזור גדל במהירות של חקירות קליניות לטיפולים מבוססי תאים4.
הזיקה הגבוהה במיוחד של תרופות מבוססות נוגדנים המספקת תסנות אנטיגן המביעה תאים סרטניים הופכת אותו לסוכן אטרקטיבי. כמו כן, משלוח ממוקד ושמירה על גידול של נוגדן טיפולי (או תרופה כימית) הוא המפתח לאיזון יעילות על רעילות. לכן, מספר גדול של אסטרטגיות מבוססות הנדסת חלבון הכוללות אך אינן מוגבלות bispecific5 ונוגדנים tri-ספציפיים6 מנוצלים כדי לשפר באופן משמעותי את השמירה גידול אופטימיזציה של תוך ורידי (IV) מוזרקטיפולית 5,7. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה מבוססת פלואורסץ כדי לטפל בהתפלגות הגידול והרקמות של נוגדנים אנטי סרטניים יעילים פוטנציאליים.
מכיוון שלרקמות בעלי חיים יש פלואורסצנטיות אוטומטית כאשר הן מתרגשות בספקטרום הנראה לעין, הנוגדנים סומנו בתחילה עם צבע אינפרא אדום ליד (לדוגמה, IRDye 800CW). להוכחת חקירות קונספט, עשינו שימוש קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) מיקוד נוגדן בשם farletuzumab ונגזרתו בשם מפעיל ציטוקסיה עוגן Bispecific (BaCa)7 נוגדן כי מטרות שותפות FOLR1 קולטן מוות-5 (DR5)8 נוגדן רקומביננטי אחד. FOLR1 הוא קולטן יעד מוגדר היטב במטגן יתר בתאים סרטניים בשחלות ו-TNBC, גידול xenografts ותגידוליםהחולה 9. במיוחד, ישנם מאמצים מרובים לנצל קלינית FOLR1 באמצעות גישות מבוססות נוגדנים לעסוק בתאי השפעה חיסונית ותרופת נוגדנים להציות (ADC) לסרטן השחלותוהשד 10,11.
בשיטות אלה נייר, שיכפלנו, ביטאנו ומטוהרים קליני אנטי FOLR1 (farletuzumab) יחד עם נוגדנים שליטה אחרים באמצעות מערכת ביטוי CHO. IgG1 isotype ונוגדן קליני נגד אידיוטי mucin-16 בשם abagovomab12 שימשו כפקדים שליליים. בעקבות טיהור חלבון-A, נוגדנים מסומנים סומנו עם IRDye 800CW וננתן לתוך ויריד הזנב של עכברים עירומים או נושאות xenografts גידול בשחלות או FOLR1 אנושי transfected באופן יציב המביע סרטן המעי הגס murine קסנוגרפטים. ההתקמה הנוגדן היה במעקב על ידי הדמיה חיה באמצעות ספקטרום הדמיה vivo במספר נקודות זמן שונות7. שיטה זו אינה דורשת כל שינוי גנטי או הזרקה של הצוללת כדי לאפשר פליטת אור והוא מהיר יותר באופן משמעותי, חסכוני ויעיל. פרוטוקול השיבוט, הביטוי, הטיהור והתיוג הכללי המתואר להלן יכול להיות מיושם על כל נוגדן קליני ולא קליני אם רצפי שרשרת כבדים וקלים זמינים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

נוגדנים חד-קלונליים הם תרופות רב-תכליתיות עם זיקה גבוהה שעובדות על ידי מנגנונים עצמאיים משתנים כדי לחסל תאים סרטניים. במהלך העשורים האחרונים, התחום של נוגדנים-סמים התווסדו, נוגדנים דו-ספציפיים, קולטני אנטיגן כימריים (CAR) ואימונותרפיה סרטן התגלה כתחום המבטיח ביותר של חקירות בסיסיות וטיפוליות. עם ניסויים בבני אדם מוצלחים רבים המתמקדים קולטני מחסום חיסוני ותאי CAR-T בלוקמיה ומלנומה בקצב פורץ דרך, זה זמנים מרגשים מאוד עבור טיפולי אונקולוגיים נגזר וריאציות של הנדסת נוגדנים. למרבה הצער, מספר גדול באופן משמעותי של נוגדנים וטיפולים מבוססי רכב הוכיחו גם מאכזב בניסויים בבני אדם של סרטן מוצק בגלל הזמינות המוגבלת של תאי השפעה חיסונית במיטת הגידול. חשוב לציין, הפצה לא ספציפית של נוגדנים טיפוליים ברקמות אחרות מאשר גידולים גם לתרום לחוסר יעילות קלינית, רעילות הקשורים וכשל קליני. כמו תרגום נאמן של מחקרים פרה-קליניים לתוך שבילים קליניים אנושיים הם מאוד להסתמך על עכברים גידול xenograft יעילות ובטיחות מחקרים, כאן אנו מדגישים שיטה כדי לבדוק את הגידול ואת התפלגות רקמות כללית של נוגדנים טיפוליים. זה מושגת על ידי תיוג נוגדן מטוהר חלבון-A עם צבע פלורסנט אינפרא אדום ליד ואחריו הדמיה חיה של עכברים נושאים גידול.

המתודולוגיה המתוארת, תחילה שיכפלנו נוגדנים המתמקדים קולטן חומצה פולית אלפא-1 (FOLR1) בשם farletuzumab, ונוגדן ביסקי בשם BaCa המורכב farletuzumab ו lexatumumab יחד עם נוגדנים שליטה כגון abagovomab (רצפים שסופקו בקובץ משלים 1). פרטים של תחומים כבדים (VH) משתנים ומשתנים של אור משתנה (pVH, pVL) מוצגים באות 1A<...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי ללמוד את ההתקמה vivo של נוגדנים בעכברים גידול xenograft מודלים.

ניתוח גידול ורקמות התפלגות של נוגדן טיפולי ספציפי אנטיגן היעד

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

פרוטוקול זה מדגים את הביטוי והטיהור של נוגדנים וניטור בזמן אמת של התפלגות הנוגדנים בגידול וברקמות. סינון נוגדנים עם פרוטוקול מתואר יעזור לבחור נוגדנים בעלי הפצת רקמות לא ספציפית מוגבלת, ולהעשיר לוקליזציה של גידולים. הטכניקה המתוארת מהירה וחסכונית.טכניקות אחרות, כגון טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד וטומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים, יקרות מאוד ודורשות מעקב רדיואקטיבי ומתוחכם אחר. הטכניקה אינה מוגבלת לסרטן מיקוד נוגדנים. זה יכול להיות מיושם על כל מחלה אחרת, כגון מחלות ריאה או לב, לניתוח של הפצת נוגדנים בגוף.בהדגמת ההליך, יהיה ג'רמי גייטסמן, טכנאי וטרינרי מהאוניברסיטה שלי. תאי CHO גולמיים ב-200 מיליליטר של מדיה, בדלונג, ארלןמאייר בלבל בקבוקונים. שלב חמישה מיליליטר של מדיה בסגנון חופשי CHO עם 50 מיקרוגרם של DNA שיבוט כבד משתנה, ו 75 מיקרוגרם DNA שיבוט אור משתנה בצינור 15 מיליליטר.ואז, מערבולת הצינור. השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף 750 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר פוליאתילנימין תסנור ה-DNA, ו מערבולת אגרסיבית זה במשך 30 שניות.השאירו את התערובת בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות נוספות. מוסיפים את התערובת כולה לתאי CHO תוך טלטול ידני של הבקבוק. מיד דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועד ב 130 סל"ד.ביום שלמחר, להוסיף שני מיליליטר של 100 X נגד גושים סוכן, ושני מיליליטר של 100 X פתרון אנטיבקטריאלי אנטימיקוטי לתאים. הדגירה את flasks ב 32 כדי 34 מעלות צלזיוס, עם רועד ב 130 סל"ד. המשך culturing התאים במשך 10 עד 11 ימים, הוספת 10 מיליליטר של הזנת טריפטון N1, ושני מיליליטר של 100 X תוספת גלוטמין בכל יום חמישי.לספור את התאים בכל יום שלישי כדי להבטיח כי הכדאיות התא נשאר מעל 80% ביום 10 או 11, לקצור את המדיום לטיהור נוגדנים על ידי צנטריפוגה של התרבות ב 3000 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס במשך 40 עד 60 דקות. לאחר מכן, סנן את המדיה הברורה באמצעות מסנן בקבוקים של 0.22 מיקרומטר. כדי לטהר את הנוגדנים, לצייד את החלבון עמודה A עם שני נפחי עמודות של חיץ מחייב.העבר את המדיה המסוננת דרך העמודה בקצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה. לאחר מכן שטפו את העמודה עם שני אמצעי אחסון של עמודות של מאגר איגוד. השתמש בחמישה מיליליטר של מאגר אלוטיון כדי לחמק מהנוגדן לשברים של 500 מיקרוליטר.ולנטרל את ה- pH של הנוגדן רמז על ידי הוספת 10 microliters של חיץ נטרול עבור שבר. למדוד את הריכוז של הנוגדן מטוהר עם ספקטרופוטומטר באמצעות פרוטוקול ברירת המחדל עבור IgG. דיאליזה 0.5 מיליליטר של הנוגדן באמצעות קלטת דיאליזה בליטר אחד של חיץ ההטיה.לאחר ארבע שעות, מעבירים את קלטת הדיאליזה למאגר טרי ומעבירים במהלך הלילה. כדי להגדיר תגובת התייחדות, להוסיף 0.03 מיקרוגרם של צבע IRR 800 CWU לכל מיליגרם אחד של נוגדן בנפח כולל של 500 microliters. הדגירה את התערובת במשך שעתיים ב 20 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לטהר את תווי conjugates על ידי דיאליזה נרחבת נגד PBS.להעריך את מידת התיוג על ידי מדידת ספיגת הצבע 780 ננומטר, וספיגת החלבון ב 280 ננומטר. כדי לפתח קסנוגרפים של העכבר, הרם בעדינות את עור החיה והפרד אותו משכבת השרירים הבסיסית. לאט להזריק 100 microliters של השעיית תא מתחת לעור עם מחט 26 מד.המתן כמה שניות לפני להוציא את המחט, כך מטריצת המרתף מדיום ליידע את המבנה מוצק למחצה דמוי ג'ל יחד עם תאים מתחת לעור, אשר ימנע את התערובת לצאת מאתר ההזרקה. כדי לבצע הדמיה vivo, להזריק את הצבע שכותרתו נוגדן דרך וריד הזנב. לאחר הרדמה של העכבר, בדוק את חוסר התגובה רפלקסים דוושה, ולהעליל את הוריד על ידי החלת מים חמים.השתמש מזרק אינסולין 1cc עם מחט מד 26 להזריק 25 מיקרוגרם של הנוגדן שכותרתו בנפח של 100 microliters. כשליטה שלילית, תווית ולהזריק את נוגדן איזוטיפ IgG לא ספציפי אשר אינו למקד תאים סרטניים. בצע הדמיה vivo שמונה, 24 ו 48 שעות לאחר זריקות נוגדנים.בתוכנת הדימות, לחץ על אתחל. אשר כי טמפרטורת הבמה היא 37 מעלות צלזיוס. בלוח הבקרה, להגדיר הדמיה פלואורסצנטי באמצעות אשף ההדמיה, ולהגדיר את העירור ל 773 ננומטר, פליטה ל 792 ננומטר.העבר את העכבר הרדמה לתא ההדמיה. מקם אותו בשדה ההדמיה באמצעות חרוט האף. כשתהיה מוכן, לחץ על רכוש בלוח הבקרה לרכישת התמונה ולחץ על חשיפה אוטומטית.התמונה שנוצרה היא שכבת-על של הפלואורסצנטיות בתמונה הצילומית עם פלואורסצנטיות אופטית וצפיפות המוצגת ביחידות של ספירות או פוטונים. שיבוטים חיוביים cDNA עם תחומי אור כבד משתנה אושרו עם PCR המושבה. תוצאות מייצגות של farletuzumab מטוהרים לרוץ על דף SDS שאינו צמצום והפחתת מוצגים כאן.שרשראות כבדות וקלות ייצרו רצועות 50 ו-25 קילו-דלטון לאחר ההפחתה. כריכת נוגדנים לחלבונים מקומיים על פני התא אושרה גם היא. נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית הוזרקו לווריד זנב, לעכברים שהושתקו ב-R1 מלא המבטאת גידולים.בעלי חיים חיו תמונה בנקודות זמן מרובות באמצעות IVIS. הנתונים נוגדנים להעשרה סלקטיבית של נוגדני R1 ו-BaCa מלאים לגידולים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש לזכור כי תחזוקה מוחזקת של תאי CHO היא קריטית עבור תשואת נוגדנים.וחשוב לקבל רמה דומה של תיוג צבע פלואורסצנטי עבור לוקליזציה גידול תחרותי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונוהיסטוכימיה של רקמות ורקמות או ELISA ספציפיות לגידול כדי לתמוך בעכברים החיים המדמימים נתונים.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

תלת מימדי הרתי תרבות מערכת לייצר Murine המושרה תא גזע Pluripotent-הגידול הנגזר אנטיגן-מהגרים ספציפיים הרתי

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

ב Vivo אימונוofor, לוקליזציה להערכת הטיפול הרפואי והאבחון ביופצת התרופות בחקר הסרטן

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

ניתוח ביטוי גנים הגידול גורמים עם פורטל האינטרנט של CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

מדידת תגובת התרופה בזמן אמת בפרוסות רקמה אורגנוטימית לגידול

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...