Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

हम वर्जीनिया कैंसर सेंटर कोर इमेजिंग सुविधा, बायोमॉलिक्यूलर विश्लेषण सुविधा, उन्नत माइक्रोस्कोपी सुविधा और सहायता के लिए कोर विवरियम सुविधा विश्वविद्यालय के आभारी हैं। जे टी-एस ओवेरियन कैंसर अकादमी (ओसीए-डीओडी) के शुरुआती करियर अन्वेषक हैं । इस काम को एनसीआई/एनआईएच ग्रांट (R01CA233752) ने जे टी-एस, यूएस डीओडी ब्रेस्ट कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (बीसीआरपी) सफलता स्तर-1 पुरस्कार जे टी-एस (BC17097) और अमेरिकी डीओडी ओवेरियन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (OCRP) फंडिंग अवार्ड (OC180412) को जे-एस को समर्थन दिया ।

जानवरों से निपटने और ट्यूमर xenografts अध्ययन से जुड़े सभी प्रक्रियाओं की समीक्षा की और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा यहां वर्जीनिया विश्वविद्यालय में मंजूरी दे दी और प्रासंगिक नियामक मानक?...

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	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

कैंसर रोधी चिकित्सीय एजेंट की चयनात्मक और ट्यूमर ऊतक विशिष्ट डिलीवरी किसी दिए गए लक्षित चिकित्सा13की प्रभावकारिता और सुरक्षा को मापने की कुंजी है । यहां हमने नैदानिक, फर्लेदुम्ब और एक गैर-नै?...

एफडीए ने 19861,2में सीडी 3 (ओकेटी3, मुरोमोनाब) को लक्षित करने वाले पहले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को मंजूरी दी। तब से अगले बीस वर्षों के लिए, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों के खिलाफ एंटीबॉडी की भारी सफलता के कारण एंटीबॉडी इंजीनियरिंग के क्षेत्र में तेजी से विस्फोट हुआ है3। प्रतिरक्षा प्रणाली के अप्रत्यक्ष सक्रियण के अलावा, एंटीबॉडी को सीधे प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं को शामिल करने के लिए कैंसर कोशिकाओं को ध्वजांकित करने, डेथ रिसेप्टर एगोनिस्ट के माध्यम से साइटोटॉक्सिक्सिटी को ट्रिगर करने, ट्यूमर सेल सर्वाइवल सिग्नलिंग को ब्लॉक करने, एंजियोजेनेसिस (रक्त वाहिकाओं के विकास) में बाधा डालने, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नियामकों को बाधित करने, रेडियोआइसोटोप, कीमोथेरेपी दवाओं और सिआरएनए को एक समझौताएजेंटों केरूप में वितरित करने का लक्ष्य रखा जा रहा है। इसके अलावा, रोगी व्युत्पन्न टी-कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं (कार-टी और कार-एनके) की सतह पर विभिन्न एंटीबॉडी के एकल श्रृंखला चर टुकड़ों (एससीएफवी) का अध्ययन करना सेल-आधारित उपचार4के लिए नैदानिक जांच का एक तेजी से बढ़ता क्षेत्र है।
एंटीबॉडी आधारित दवाओं की अल्ट्रा-हाई एफ़िनिटी जो एंटीजन को ट्यूमर कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए चयनशीलता प्रदान करती है, यह एक आकर्षक एजेंट बनाती है। इसी तरह, लक्षित वितरण और एक चिकित्सीय एंटीबॉडी (या एक रासायनिक दवा) के ट्यूमर प्रतिधारण विषाक्तता पर प्रभावकारिता संतुलन की कुंजी है । इसलिए, बड़ी संख्या में प्रोटीन इंजीनियरिंग आधारित रणनीतियां शामिल हैं, जिनमें बिस्पिफिक5 और त्रि-विशिष्ट एंटीबॉडी6 तक सीमित नहीं हैं, नसों के अनुकूलित ट्यूमर प्रतिधारण को बढ़ाने के लिए शोषण किया जा रहा है (IV) इंजेक्शन थे चिकित्सीय5,7। यहां, हम संभावित प्रभावी कैंसर विरोधी एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण को संबोधित करने के लिए एक साधारण फ्लोरेसेंस-आधारित विधि का वर्णन करते हैं।
क्योंकि पशु ऊतकों के पास ऑटो-फ्लोरेसेंस होता है जब दृश्यमान स्पेक्ट्रम में उत्साहित होता है, एंटीबॉडी को शुरू में निकट इन्फ्रारेड डाई (जैसे, IRDye 800CW) के साथ लेबल किया गया था। अवधारणा जांच के सबूत के लिए, हम फोलेट रिसेप्टर अल्फा-1 (FOLR1) का उपयोग किया है fletuzumab कहा जाता है औरइसके व्युत्पन्न बिस्पेशिक एंकर Cytotoxicity सक्रियक (BaCa) 7 एंटीबॉडी कहा जाता है कि सह लक्ष्य FOLR1 और मौत रिसेप्टर-5 (DR5)8 एक recombinant एंटीबॉडी में । FOLR1 ओवेरियन और टीएनबीसी कैंसर कोशिकाओं, ट्यूमर xenografts और रोगी ट्यूमर 9 में एक अच्छीतरहसे परिभाषित अतिव्यक्त लक्ष्य रिसेप्टर है । विशेष रूप से, ओवेरियन और स्तन कैंसर10,11के लिए प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं और एंटीबॉडी दवा conjugates (एडीसी) को शामिल करने के लिए एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके FOLR1 का चिकित्सकीय रूप से दोहन करने के लिए कई प्रयासहैं।
इस तरीके के कागज में, हमने चो अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके अन्य नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ नैदानिक एंटी-एफओएलआर1 (फारलेजुमाब) का क्लोन, व्यक्त और शुद्ध किया। IgG1 आइसोटाइप और एक नैदानिक विरोधी मूर्खता मसिन-16 एंटीबॉडी abagovomab12 कहा जाता है नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्रोटीन-ए शुद्धिकरण के बाद, संकेत दिया कि एंटीबॉडी को IRDye 800CW के साथ लेबल किया गया था और नग्न चूहों की पूंछ नस में प्रशासित किया गया था या तो ओवेरियन ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट्स असर या छुरा संक्रमित मानव FOLR1 murine पेट के कैंसर xenografts व्यक्त करते हैं । एंटीबॉडी लोकलाइजेशन को लाइव इमेजिंग द्वारा वीवो इमेजिंग स्पेक्ट्रम में कई अलग - अलग समयबिंदुओं पर उपयोगकरके ट्रैक किया गया था। इस विधि को प्रकाश उत्सर्जन को सक्षम करने के लिए सब्सट्रेट के किसी आनुवंशिक संशोधन या इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं होती है और यह काफी तेज, लागत प्रभावी और कुशल है। नीचे वर्णित सामान्य क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लेबलिंग प्रोटोकॉल को किसी भी नैदानिक और गैर-नैदानिक एंटीबॉडी पर लागू किया जा सकता है यदि भारी और प्रकाश श्रृंखला दृश्य उपलब्ध हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उच्च एफ़िनिटी मल्टीफंक्शनल दवाएं हैं जो कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए चर स्वतंत्र तंत्र द्वारा काम करती हैं। पिछले कुछ दशकों में एंटीबॉडी-ड्रग कंजूगेट्स, बिस्पीफिक एंटीबॉडी, चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) और कैंसर इम्यूनोथेरेपी का क्षेत्र बुनियादी और चिकित्सीय जांच के सबसे आशाजनक क्षेत्र के रूप में उभरा है । एक सफलता की गति से ल्यूकेमिया और मेलानोमा में प्रतिरक्षा चेकपॉइंट रिसेप्टर्स और कार-टी कोशिकाओं को लक्षित करने वाले कई सफल मानव परीक्षणों के साथ, यह एंटीबॉडी इंजीनियरिंग की विविधताओं से प्राप्त ऑन्कोलॉजिक चिकित्सा के लिए बेहद रोमांचक समय है। अफसोस, एंटीबॉडी और कार आधारित चिकित्सा विज्ञान की एक काफी बड़ी संख्या में भी ट्यूमर बिस्तर में प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं की सीमित उपलब्धता की वजह से ठोस कैंसर के मानव परीक्षणों में निराशाजनक साबित कर दिया है । महत्वपूर्ण बात, ट्यूमर के अलावा ऊतकों में चिकित्सीय एंटीबॉडी का गैर-विशिष्ट वितरण भी नैदानिक प्रभावकारिता, संबद्ध विषाक्तता और नैदानिक विफलता की कमी में योगदान देता है। मानव नैदानिक ट्रेल्स में प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के वफादार अनुवाद के रूप में चूहों ट्यूमर ज़ेनोग्राफ़ प्रभावकारिता और सुरक्षा अध्ययनों पर अत्यधिक भरोसा किया जाता है, यहां हम चिकित्सकीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और सामान्य ऊतक वितरण का परीक्षण करने के लिए एक विधि पर प्रकाश डालते हैं। यह प्रोटीन-एक शुद्ध एंटीबॉडी के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है जिसके बाद ट्यूमर असर चूहों की लाइव इमेजिंग होती है।

वर्णित पद्धति में, पहले हमने फोलेट रिसेप्टर अल्फा-1 (FOLR1) को लक्षित करते हुए एंटीबॉडी का क्लोन बनाया, जिसका नाम फर्लेतुज़ुमाब है, और एक बिस्पीफिक एंटीबॉडी जिसे बायगुजुम्ब और लेक्सातुम्ब शामिल है, साथ ही न...

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Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

यहां हम चूहों ट्यूमर xenograft मॉडल में एंटीबॉडी के वीवो स्थानीयकरण में अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।

लक्ष्य एंटीजन विशिष्ट चिकित्सीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण का विश्लेषण

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

यह प्रोटोकॉल एंटीबॉडी की अभिव्यक्ति और शुद्धि और ट्यूमर और ऊतक में एंटीबॉडी वितरण की वास्तविक समय निगरानी को दर्शाता है। वर्णित प्रोटोकॉल के साथ एंटीबॉडी स्क्रीनिंग उन एंटीबॉडी का चयन करने में मदद करेगी जिनमें सीमित गैर-विशिष्ट ऊतक वितरण है, और ट्यूमर स्थानीयकरण को समृद्ध करते हैं। वर्णित तकनीक त्वरित और लागत प्रभावी है।एकल फोटॉन उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी और पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी जैसी अन्य तकनीकें बहुत महंगी हैं और इसके लिए रेडियोधर्मी और अन्य परिष्कृत ट्रेसर की आवश्यकता होती है। यह तकनीक एंटीबॉडी को लक्षित करने वाले कैंसर तक ही सीमित नहीं है । यह शरीर में एंटीबॉडी वितरण के विश्लेषण के लिए फेफड़े या दिल की बीमारियों जैसे किसी अन्य बीमारी पर लागू किया जा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन, जेरेमी गेट्समैन, मेरे विश्वविद्यालय से एक पशु चिकित्सा तकनीशियन होगा । मीडिया के २०० मिलीलीटर में कच्चे चो कोशिकाओं, Delong में, Erlenmeyer चकित flasks । 50 माइक्रोग्राम वेरिएबल हैवी क्लोन डीएनए के साथ चो फ्रीस्टाइल मीडिया के पांच मिलीलीटर, और 75 माइक्रोग्राम एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एक चर प्रकाश क्लोन डीएनए मिलाएं।इसके बाद ट्यूब को भंवर से उतारा। मिश्रण को कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए छोड़ दें। डीएनए समाधान में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर पॉलीथीनमाइन स्टॉक के 750 माइक्रोलीटर जोड़ें, और आक्रामक रूप से इसे 30 सेकंड के लिए भंवर करें।अतिरिक्त पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण छोड़ दें। चो कोशिकाओं में पूरे मिश्रण जोड़ें, जबकि मैन्युअल रूप से फ्लास्क मिलाते हुए। 130 आरपीएम पर मिलाते हुए तुरंत कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।अगले दिन, कोशिकाओं में 100 एक्स एंटी-क्लम्पिंग एजेंट के दो मिलीलीटर और 100 एक्स एंटीबैक्टीरियल एंटीमाइकोटिक समाधान के दो मिलीलीटर जोड़ें। १३० आरपीएम पर मिलाते हुए ३२ से ३४ डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क को इनक्यूबेट करें । 10 से 11 दिनों के लिए कोशिकाओं को खेती जारी रखें, ट्राइप्टोन एन1 फ़ीड के 10 मिलीलीटर और हर पांचवें दिन 100 एक्स ग्लूटामाइन पूरक के दो मिलीलीटर जोड़ें।यह सुनिश्चित करने के लिए हर तीसरे दिन कोशिकाओं की गणना करें कि कोशिका व्यवहार्यता 10 या 11 दिन पर 80% से ऊपर बनी रहे, संस्कृति को 3000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करके एंटीबॉडी शुद्धि के लिए माध्यम की कटाई करें, और 40 से 60 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस। फिर, 0.22 माइक्रोमीटर बोतल फिल्टर के साथ स्पष्ट मीडिया को फ़िल्टर करें। एंटीबॉडी को शुद्ध करने के लिए, प्रोटीन ए कॉलम को बाध्यकारी बफर के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ बराबर करें।प्रति मिनट एक मिलीलीटर की प्रवाह दर पर कॉलम के माध्यम से फ़िल्टर किए गए मीडिया को पास करें। फिर बाध्यकारी बफर के दो कॉलम वॉल्यूम के साथ कॉलम धोएं। एंटीबॉडी को 500 माइक्रोलीटर अंशों में एल्यूयूशन बफर के पांच मिलीलीटर का उपयोग करें।और अंश के लिए बेअसर बफर के 10 माइक्रोलीटर जोड़कर इशारा एंटीबॉडी के पीएच बेअसर। आईजीजी के लिए डिफ़ॉल्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ शुद्ध एंटीबॉडी की एकाग्रता को मापें। एक लीटर कंजूगेशन बफर में डायलिसिस कैसेट का उपयोग करके एंटीबॉडी के 0.5 मिलीलीटर को डायलिज़ करें।चार घंटे के बाद, डायलिसिस कैसेट को ताजा बफर में स्थानांतरित करें और रात भर डायलाइज करें। एक संयुग्म प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए, 500 माइक्रोलीटर की कुल मात्रा में प्रति एक मिलीग्राम एंटीबॉडी आईआरआर डाई 800 सीडब्ल्यूयू के 0.03 माइक्रोग्राम जोड़ें। मिश्रण को 20 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, फिर पीबीएस के खिलाफ व्यापक डायलिसिस द्वारा लेबल किए गए संजूगेट को शुद्ध करें।डाई 780 नैनोमीटर के अवशोषण को मापने, और 280 नैनोमीटर पर प्रोटीन के अवशोषण द्वारा लेबलिंग की डिग्री का अनुमान लगाएं। माउस ज़ेनाग्राफ विकसित करने के लिए, धीरे-धीरे जानवर की त्वचा को उठाएं और इसे अंतर्निहित मांसपेशियों की परत से अलग करें। धीरे-धीरे 26 गेज सुई के साथ त्वचा के नीचे सेल निलंबन के 100 माइक्रोलीटर इंजेक्ट करें।सुई को बाहर निकालने से पहले कुछ सेकंड तक प्रतीक्षा करें ताकि बेसमेंट मैट्रिक्स माध्यम त्वचा के नीचे कोशिकाओं के साथ अर्ध-ठोस जेल जैसी संरचना को सूचित करे, जो मिश्रण को इंजेक्शन साइट से बाहर आने से रोकेगा। वीवो इमेजिंग में प्रदर्शन करने के लिए, पूंछ नस के माध्यम से एंटीबॉडी लेबल डाई इंजेक्ट करें। माउस को एनेस्थेटाइज करने के बाद, पेडल सजगता के जवाब की कमी की जांच करें, और गर्म पानी लागू करके नस को फैलाएं।100 माइक्रोलीटर की मात्रा में लेबल किए गए एंटीबॉडी के 25 माइक्रोग्राम इंजेक्ट करने के लिए 26 गेज सुई के साथ 1 सीसी इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, लेबल और गैर विशिष्ट आईजीजी आइसोटाइप एंटीबॉडी जो कैंसर की कोशिकाओं को लक्षित नहीं करता है सुई । एंटीबॉडी इंजेक्शन के आठ, 24 और 48 घंटे बाद वीवो इमेजिंग में प्रदर्शन करें।इमेजिंग सॉफ्टवेयर में, शुरुआत में क्लिक करें। इसकी पुष्टि करें कि स्टेज का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस है। नियंत्रण कक्ष में, इमेजिंग जादूगर के माध्यम से फ्लोरेसेंस इमेजिंग की स्थापना की, और 773 नैनोमीटर, उत्सर्जन 792 नैनोमीटर के लिए उत्तेजना सेट करें।एनेस्थेटाइज्ड माउस को इमेजिंग चैंबर में स्थानांतरित करें। नाक शंकु का उपयोग कर इमेजिंग क्षेत्र पर यह स्थिति। तैयार होने पर, छवि अधिग्रहण के लिए नियंत्रण कक्ष पर अधिग्रहण पर क्लिक करें, और ऑटो एक्सपोज पर क्लिक करें।उत्पन्न छवि ऑप्टिकल फ्लोरेसेंस और गिनती या फोटॉनों की इकाइयों में प्रदर्शित घनत्व के साथ फोटोग्राफिक छवि पर फ्लोरेसेंस का ओवरले है। कॉलोनी पीसीआर के साथ वेरिएबल हैवी और वेरिएबल लाइट डोमेन के साथ पॉजिटिव सीडीएनए क्लोन की पुष्टि हुई । शुद्ध फरलेदुम्ब के प्रतिनिधि परिणाम यहां गैर-कम करने और एसडीएस पृष्ठ को कम करने पर चलते हैं।हैवी और लाइट चेन में कमी के बाद 50 और 25 किलोडलटन बैंड का उत्पादन किया। कोशिका की सतह में देशी प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी के बाध्यकारी भी पुष्टि की गई थी । फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी पूंछ नस इंजेक्शन थे, चूहों में पूर्ण R1 ट्यूमर व्यक्त करने के साथ कलम ।जानवरों को IVIS का उपयोग कर कई समय अंक पर छवि रहते थे । डेटा ट्यूमर में पूर्ण R1 और BaCa एंटीबॉडी के चयनात्मक संवर्धन confirs । इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ध्यान रखें कि चो कोशिकाओं का आयोजित रखरखाव एंटीबॉडी उपज के लिए महत्वपूर्ण है।और प्रतिस्पर्धी ट्यूमर स्थानीयकरण के लिए फ्लोरोसेंट डाई कंजूगेशन की एक समान डिग्री होना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, जीवित चूहों इमेजिंग डेटा का समर्थन करने के लिए ऊतक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और ऊतक या ट्यूमर विशिष्ट एलिसा जैसे अन्य तरीकों को किया जा सकता है।

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Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

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