Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
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우리는 버지니아 대학 암 센터 핵심 이미징 시설, 생체 분자 분석 시설, 고급 현미경 검사시설 및 핵심 Vivarium 지원에 감사드립니다. J. T-S는 난소암 아카데미 (OCA-DoD)의 초기 경력 조사자입니다. 이 작품은 J. T-S, 미국 DoD 유방암 연구 프로그램 (BCRP)에 NCI / NIH 보조금 (R01CA233752)에 의해 지원되었다 J. T-S (BC17097) 및 미국 DoD 난소암 연구 프로그램 (OCRP) 자금 지원 상 (OC180412) J-S.J.

동물 취급 및 종양 xenografts 연구 와 관련된 모든 절차는 버지니아 대학에 여기에서 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되고 관련 규제 기준을 준수했습니다
1. 항체의 발현 및 정화
<ol><li>CHO 셀의 유지 보수<ol>
<li>프리스타일 초 미디어에서 CHO 세포를 성장시키면 37°C에서 130rpm에서 흔들리는 1x 글루타민 보충제로 보충되었으며, 5%CO2는 유리 또?...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

항암 치료제의 선택적 및 종양 조직 특이적 전달은 주어진 표적요법(13)의효능 및 안전성 을 측정하는 열쇠이다. 여기서 우리는 임상, 팔레투주맙 및 비임상 BaCa 항체의 상세한 조직 및 종양 분포를 조사하기 위하여 신속하고 능률적인 접근을 기술했습니다. 설명된 접근법은 새로 생성된 항체에 적용가능하며 종양/장기 분포 특성에 대한 임상적으로 효과적인 항체(원하는 자질)와...

FDA는 1986년1,2에서CD3(OKT3, 무로모나브)를 대상으로 한 최초의 단일클론항체를승인했다. 그 이후 20년 동안 면역 체크포인트 억제제3에대한 항체의 압도적인 성공으로 인해 항체 공학 분야에서 급속한 폭발이 있었습니다. 면역 계통의 간접적인 활성화 외에, 항체는 면역 효과기 세포를 정확하게 관여하기 위하여 암세포를 직접 플래그화하고, 죽음 수용체 작용제를 통해 세포 독성을, 종양 세포 생존 신호를 막고, 혈관 신생 (혈관의 성장), 면역 체크포인트 조절을 제한하고, 방사성 동위 원소를 전달하고, 화학 요법 약물 및 siRNA를 공자에이전트로2. 또한, 환자 유래 T세포 및 NK 세포(CAR-T 및 CAR-NK)의 표면에 다양한 항체의 단일 사슬 가변 단편(scFv)을 연구하는 것은 세포 기반 치료법에 대한 임상 조사의 급속한 성장 영역이다4.
종양 세포를 발현하는 항원에게 선택성을 제공하는 항체 기반 약물의 초고친화성은 매력적인 제대리인입니다. 마찬가지로, 치료 항체(또는 화학약물)의 표적 전달 및 종양 보유는 독성에 대한 효능의 균형을 맞추는 열쇠이다. 따라서, 이중특이적5 및 삼중특이항체(6)를 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 단백질 공학 기반 전략이 정맥내(IV)의 종양 보유를 크게 향상시키는 데 이용되고 있다5,7. 여기서, 우리는 잠재적으로 효과적인 항암 항체의 종양 및 조직 분포를 해결하기 위한 간단한 형광 기반 방법을 설명한다.
동물 조직은 가시 스펙트럼에서 흥분할 때 자동 형광을 가지고 있기 때문에, 항체는 처음에 근적외선 염료로 표지되었다 (예를 들어, IRDye 800CW). 개념 조사의 증거를 위해, 우리는 엽산 수용체 알파-1 (FOLR1)의 탈구 수용체 알파-1 (FOLR1) 팔레투주맙이라고 불리는 항체와 그 유도체라는 이중 특이적 앵커 Cyto독성 활성제 (BaCa)7 항체를 공동 표적으로 하는 FOLR1 및 죽음 수용체-5 (DR5)8을 하나의 재조합 항체에서 사용했습니다. FOLR1은 난소 및 TNBC 암세포, 종양 이종이이식 및 환자 종양9에서잘 정의된 과발현 표적 수용체이다. 특히, 난소 및 유방암을 위한 면역 효과제 세포 및 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 참여시키기 위한 항체 기반접근법을이용하여FOLR1을임상적으로 악용하기 위한 여러 노력이 있다.
본 방법 논문에서, 우리는 CHO 발현 시스템을 이용한 다른 제어 항체와 함께 임상 항FOLR1(farletuzumab)을 복제, 발현 및 정제하였다. IgG1 아이소타입 및 아바고보마브(12)라고 불리는 임상 항관용형 뮤신-16 항체가 음의 대조군으로 사용되었다. 단백질-A 정화에 따라, 표시된 항체는 IRDye 800CW로 표지되었고, 난소 종양 이종이이식또는 안정적으로 전염성이 있는 인간 FOLR1을 베어링 난소 종양 xenografts 또는 안정적으로 전염성이 있는 인간 FOLR1의 꼬리 정맥으로 투여되었다. 항체 국소화는 여러 개의 상이한 시간점7에서 생체 내 이미징 스펙트럼을 이용한 라이브 이미징에 의해 추적되었다. 이 방법은 빛 방출을 가능하게 하기 위하여 기판의 어떤 유전 수정 또는 주입을 요구하지 않으며 상당히 빠르고, 비용 효과적이고 효율적입니다. 아래에 설명된 일반적인 복제, 발현, 정제 및 라벨링 프로토콜은 중형 및 광 사슬 서열을 사용할 수 있는 경우 모든 임상 및 비임상 항체에 적용될 수 있다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

단일 클론 항체는 암세포를 제거하기 위해 가변 독립적 인 메커니즘에 의해 작동하는 높은 친화성 다기능 약물이다. 지난 수십 년 동안 항체-약물 접합, 이중 특이적 항체, 키메라 항원 수용체(CAR) 및 암 면역 요법 분야는 기본 및 치료 조사의 가장 유망한 영역으로 부상했습니다. 백혈병과 흑색종에 있는 면역 체크포인트 수용체 및 CAR-T 세포를 획기적인 속도로 표적으로 하는 수많은 성공적인 인간 적인 예심으로, 항체 공학의 변이에서 파생된 종양학 치료에 대한 매우 흥미로운 시간입니다. 유감스럽게도, 상당히 많은 수의 항체와 CAR 기반 치료법은 종양 침대에서 면역 효과기 세포의 제한된 가용성으로 인해 고형 암의 인체 실험에서 실망스러운 것으로 입증되었습니다. 중요한 것은, 종양 이외의 조직에서 치료 항체의 비특이적 분포는 또한 임상 효능의 부족, 관련 독성 및 임상 실패에 기여한다. 인간 임상 적 흔적으로 전임상 연구의 충실한 번역이 마우스 종양 xenograft 효능 및 안전 연구에 크게 의존하기 때문에, 여기에서 우리는 치료 항체의 종양 및 일반 조직 분포를 테스트하는 방법을 강조한다. 이것은 종양 베어링 마우스의 살아있는 화상 진찰에 선행된 근적외선 형광염염으로 단백질-A 정제항체를 표지하여 달성됩니다.

기술된 방법론에서, 먼저 우리는 엽산 수용체 알파-1(FOLR1)이라는 이름의 엽산 수용체 알파-1(FOLR1)을 표적으로 하는 항체를 복제하고, 바백고보맙과 같은 대조군 항체와 함께 팔레투주맙과 렉사투무맙으로 구성된 BaCa라는 이중특이적 항체(보충 파일 1에서제공된 서열). DNA 클론(pVH, pVL)의 대표적인 가변 헤비(VH) 및 가변광(VL) 도메인의 세부 사항은 도 1A에도시된다....

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Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

여기서 우리는 마우스 종양 제노이식 모델에서 항체의 생체 내 국소화를 연구하는 프로토콜을 제시한다.

표적 항원 특이적 치료 항체의 종양 및 조직 분포 분석

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

이 프로토콜은 종양 및 조직에서 항체 분포의 발현 및 정제 및 실시간 모니터링을 보여줍니다. 기술된 프로토콜을 가진 항체를 검열하는 것은 종양 현지화를 제한하는 항체를 선택하는 것을 도울 것입니다. 설명된 기술은 빠르고 비용 효율적입니다.단일 광자 방출 컴퓨팅 단층 촬영 및 양전자 방출 단층 촬영과 같은 다른 기술은 매우 비싸며 방사성 및 기타 정교한 추적자가 필요합니다. 이 기술은 항체를 표적으로 하는 암에 국한되지 않습니다. 그것은 바디에 있는 항체 분포의 분석을 위해 폐 또는 심장 병과 같은 그밖 질병에 적용될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 제레미 게이츠먼, 내 대학에서 수의학 기술자가 될 것입니다. Delong에서 200 밀리리터의 미디어 에서 원시 CHO 세포, 에를렌마이어 당황 플라스크. CHO 자유형 미디어 5밀리리터와 가변 중클론 DNA 50마이크로그램, 15밀리리터 튜브에 가변 광 클론 DNA 75 마이크로그램을 결합합니다.그런 다음 튜브를 소용돌이시다. 혼합물을 실온에서 5분간 그대로 둡니다. DNA 용액에 밀리리터 폴리에틸레니민 스톡당 750 마이크로리터를 추가하고 30초 동안 적극적으로 소용돌이를 가합니다.혼합물을 실온에서 5분간 추가로 둡니다. 플라스크를 수동으로 흔들면서 전체 혼합물을 CHO 셀에 추가합니다. 즉시 130 RPM에서 흔들면서 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.다음 날에는 100 X 항 응집제의 밀리리터 2개와 세포에 100 X 항균 항진성 용액의 2 밀리리터를 추가합니다. 플라스크를 섭씨 32~34도에서 배양하고 130RPM에서 흔들리면 됩니다. 10 일에서 11 일 동안 세포를 계속 배양하고 트립톤 N1 사료의 10 밀리리터와 5 일째에 100 X 글루타민 보충제 2 밀리리터를 추가하십시오.세포 생존이 10일 또는 11일에 80%를 넘도록 3일째에 세포를 세어, 배양을 3000배, 섭씨 4도에서 40~60분 동안 원심분리하여 항체 정화배지를 수확한다. 그런 다음 0.22 마이크로미터 병 필터로 투명 미디어를 필터링합니다. 항체를 정화하기 위해, 결합 완충제의 두 컬럼 부피로 단백질 A 컬럼을 평형화한다.분당 1밀리리터의 유량으로 여과된 미디어를 컬럼을 통과합니다. 그런 다음 바인딩 버퍼의 두 열 볼륨으로 열을 세척합니다. 용출 버퍼 5 밀리리터를 사용하여 항체를 500 마이크로리터 분획으로 엘로트합니다.그리고 분획에 대한 중화 완충제의 10 마이크로리터를 추가하여 암시된 항체의 pH를 중화한다. IgG에 대한 기본 프로토콜을 사용하여 분광계로 정제된 항체의 농도를 측정합니다. 투석 0.5 밀리리터의 투석 카세트를 1리터의 컨쥬게이션 버퍼에 사용한다.4시간 후 투석 카세트를 신선한 버퍼로 옮기고 하룻밤 동안 투석을 합니다. 인주 반응을 설정하려면, 500 마이크로리터의 총 부피에서 항체의 1 밀리그램 당 IRR 염료 800 CWU의 0.03 마이크로그램을 추가합니다. 20섭씨에서 2시간 동안 혼합물을 배양한 다음, PBS에 대한 광범위한 투석으로 표시된 컨쥬게이트를 정화합니다.280 나노미터에서 염료 780 나노미터의 흡광도 및 단백질의 흡광도를 측정하여 라벨링 정도를 추정한다. 마우스 제노그래프를 개발하려면 동물의 피부를 부드럽게 들어 올리고 기본 근육 층과 분리합니다. 천천히 26 게이지 바늘로 피부 아래에 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 주입합니다.바늘을 꺼내기 전에 몇 초 동안 기다렸다가 지하 매트릭스 매체가 피부 아래세포와 함께 반고체 젤과 같은 구조를 알려주므로 혼합물이 주입 부위에서 나오는 것을 방지할 수 있습니다. 생체 내 이미징에서 수행하려면 꼬리 정맥을 통해 염료 표지 항체를 주입하십시오. 마우스를 마취한 후, 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인하고 따뜻한 물을 적용하여 정맥을 팽창시다.1cc 인슐린 주사기를 26 게이지 바늘로 사용하여 100 마이크로리터의 부피로 표지된 항체의 25 마이크로그램을 주입하십시오. 음성 대조군으로서, 암세포를 표적으로 하지 않는 비특이적 IgG 동위타입 항체를 라벨 및 주입한다. 항체 주사 후 생체 내 이미징 8, 24 및 48 시간 수행.이미징 소프트웨어에서 초기화를 클릭합니다. 스테이지 온도가 섭씨 37도인지 확인합니다. 제어판에서 이미징 마법사를 통해 형광 이미징을 설정하고 773 나노미터로 발산을 설정하여 792 나노미터로 방출합니다.마취된 마우스를 이미징 챔버로 옮기. 코 콘을 사용하여 이미징 필드에 배치합니다. 준비가 되면 이미지 수집을 위해 제어판을 획득한 다음 자동 노출을 클릭합니다.생성된 이미지는 광학 형광 및 밀도가 수 또는 광자의 단위로 표시되는 사진 이미지에 형광의 오버레이입니다. 가변 중압 및 가변 광 도메인을 가진 양성 cDNA 클론은 콜로니 PCR로 확인되었다. SDS 페이지를 축소하고 줄이는 데 있어 정제된 팔레투주맙의 대표적인 결과가 여기에 나와 있습니다.헤비 및 라이트 체인은 감소 후 50 킬로달톤 밴드와 25 킬로달톤 밴드를 생산했다. 세포 표면에서 원토 단백질에 대한 항체의 결합도 확인되었다. 형광표지 항체는 전체 R1 발현 종양으로 이식된 마우스로 꼬리 정맥주입하였다.동물은 IVIS를 사용하여 여러 시간 지점에서 이미지를 살았습니다. 데이터는 종양으로 전체 R1 및 BaCa 항체의 선택적 농축을 confirs. 이 프로토콜을 시도할 때 CHO 세포의 유지 보수가 항체 수율에 중요하다는 점에 유의하십시오.그리고 경쟁종양 국소화를 위해 유사한 정도의 형광염 염료 연상을 갖는 것이 중요하다. 이 절차에 이어, 조직 면역 조직 화학 및 조직 또는 종양 특이적 ELISA와 같은 다른 방법은 살아있는 마우스 이미징 데이터를 지원하기 위해 수행될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

단일 셀 다운스트림 특성화에 대 한 대상 셀 사전 농축 및 전체 게놈 증폭

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

연구

암 연구학

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

CorExplorer 웹 포털을 통한 종양 유전자 발현 인자 분석

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

오르가노티픽 종양 조직 슬라이스에서 실시간 약물 반응 측정

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...