Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Vi er takknemlige til University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility og Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S er en tidlig karriere etterforsker av Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dette arbeidet ble støttet av NCI/NIH stipend (R01CA233752) til J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) gjennombrudd nivå-1 award til J. T-S (BC17097) og US DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) finansiering award (OC180412) til J. T-S

Alle prosedyrene som involverer dyr håndtering og tumor xenografts studier ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) her ved University of Virginia og i samsvar med de relevante regulatoriske standarder
1. Uttrykk og rensing av antistoffer
<ol><li>Vedlikehold av CHO-celler<ol>
<li>Grow CHO celler i FreeStyle CHO Media supplert med kommersielt tilgjengelig 1x glutamin supplement ved 37 ° C risting ved 130 rpm med 5% CO2 ved hjelp av avlan...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

Selektiv og tumorvev spesifikk levering av anti-kreft terapeutisk middel er nøkkelen til å måle effekt og sikkerhet av en gitt målrettet terapi13. Her har vi beskrevet en rask og effektiv tilnærming for å undersøke detaljert vev og tumorfordeling av klinisk, farletuzumab og et ikke-klinisk BaCa-antistoff. Den beskrevne tilnærmingen gjelder for ethvert nylig generert antistoff og kan brukes sammen med et klinisk effektivt antistoff (med ønskede egenskaper) for sine tumor / organfordelingse...

FDA godkjente det første monoklonale antistoffet rettet mot CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Siden da i de neste tjue årene har det vært en rask eksplosjon innen antistoffteknikk på grunn av den overveldende suksessen til antistoffer mot immunkontrollpunkthemmere3. Ved siden av indirekte aktivering av immunsystemet, antistoffer blir rettet mot å direkte flagge kreftceller for å nøyaktig engasjere immun effektorceller, utløse cytotoksisitet via død reseptoragonist, blokkere tumorcelle overlevelse signalering, hindre angiogenese (vekst av blodkar), begrense immun kontrollpunkt regulatorer, levere radioisotoper, kjemoterapi narkotika og siRNA som en konjugert agenter2. I tillegg er det å studere enkeltkjedevariable fragmenter (scFv) av ulike antistoffer på overflaten av pasientavledede T-celler og NK-celler (CAR-T og CAR-NK) et raskt voksende område av kliniske undersøkelser for cellebaserteterapier 4.
Den ultrahøye affiniteten til antistoffbaserte legemidler som gir selektivitet til antigen som uttrykker tumorceller, gjør det til et attraktivt middel. Likeledes, målrettet levering og tumor oppbevaring av et terapeutisk antistoff (eller et kjemisk stoff) er nøkkelen til å balansere effekten over toksisitet. Derfor utnyttes et stort antall proteiningeniørbaserte strategier som inkluderer, men ikke er begrenset til bispesifikke5 og trispesifikkeantistoffer 6 for å forbedre ivrig optimalisert tumorretensjon av intravenøst (IV) injiserte terapeutiskemidler 5,7. Her beskriver vi en enkel fluorescensbasert metode for å håndtere tumor- og vevsfordelingen av potensielt effektive anti-kreftantistoffer.
Fordi dyrevev har autofluorescen når de er begeistret i synlig spektrum, ble antistoffene opprinnelig merket med nær infrarød fargestoff (f.eks. IRDye 800CW). For bevis på konseptundersøkelser har vi benyttet folatreseptor alfa-1 (FOLR1) rettet mot antistoff kalt farletuzumab og dets derivat kalt Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)7 antistoff som er rettet mot FOLR1 og dødreseptor-5 (DR5)8 i ett rekombinant antistoff. FOLR1 er en veldefinert overuttrykt målreseptor i eggstokkreftceller og TNBC kreftceller, tumor xenografts og pasientsvulster9. Spesielt er det flere anstrengelser for å klinisk utnytte FOLR1 ved hjelp av antistoffbaserte tilnærminger for å engasjere immuneffektorceller og antistoffkonjugater (ADC) for eggstokkreft og brystkreft10,11.
I dette metodepapiret klonet, uttrykte og renset vi klinisk anti-FOLR1 (farletuzumab) sammen med andre kontrollantistoffer ved hjelp av CHO-uttrykkssystemet. IgG1 isotype og et klinisk anti-idiotype mucin-16 antistoff kalt abagovomab12 ble brukt som negative kontroller. Etter protein-A rensing, indikerte antistoffer ble merket med IRDye 800CW og ble administrert inn i halen vene av nakne mus enten bærer ovarietumor xenografts eller stabilt transfected menneskelig FOLR1 uttrykker murine tykktarmskreft xenografts. Antistoff lokalisering ble sporet av live imaging ved hjelp av in vivo bildespekteret på flere forskjellige tidspunkter7. Denne metoden krever ingen genetisk modifikasjon eller injeksjon av substratet for å muliggjøre lysutslipp og er betydelig raskere, kostnadseffektiv og effektiv. Den generelle klonings-, uttrykks-, rense- og merkingsprotokollen beskrevet nedenfor kan brukes på ethvert klinisk og ikke-klinisk antistoff hvis tunge og lette kjedesekvenser er tilgjengelige.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Monoklonale antistoffer er multifunksjonelle legemidler med høy affinitet som virker ved variable uavhengige mekanismer for å eliminere kreftceller. I løpet av de siste tiårene har feltet antistoff-medikamentkonjugater, bispesifikke antistoffer, kimeriske antigenreseptorer (CAR) og kreftimmunterapi dukket opp som det mest lovende området for grunnleggende og terapeutiske undersøkelser. Med mange vellykkede menneskelige studier rettet mot immun kontrollpunkt reseptorer og CAR-T celler i leukemi og melanom i et gjennombrudd tempo, Det er svært spennende tider for onkologiske terapier avledet fra varianter av antistoff engineering. Dessverre har et betydelig stort antall antistoff- og CAR-baserte terapeutiske midler også vist seg skuffende i menneskelige studier av fast kreft på grunn av begrenset tilgjengelighet av immuneffektorceller i tumorsengen. Viktigere, uspesifikk fordeling av terapeutiske antistoffer i vev annet enn svulster bidrar også til mangel på klinisk effekt, assosiert toksisitet og klinisk svikt. Som trofast oversettelse av prekliniske studier til menneskelige kliniske stier er svært avhengig av mus tumor xenograft effekt og sikkerhetsstudier, her fremhever vi en metode for å teste svulsten og generell vevfordeling av terapeutiske antistoffer. Dette oppnås ved å merke protein-A renset antistoff med nær infrarød fluorescerende fargestoff etterfulgt av levende avbildning av tumorbærende mus.

I den beskrevne metodikken klonet vi først antistoffer rettet mot folatreseptor alfa-1 (FOLR1) kalt farletuzumab, og et bispesifikt antistoff kalt BaCa bestående av farletuzumab og leksatumumab sammen med kontrollantistoffer som abagovomab (sekvenser gitt i supplerende fil 1). Detaljer om representative variable tunge (VH) og variable lys (VL) domener i DNA-kloner (pVH, pVL) er vist i figur 1A. For å bekrefte de positive klonene, utførte vi kolonien PCR ved hjelp av sign...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Her presenterer vi en protokoll for å studere in vivo lokalisering av antistoffer i mus tumor xenograft modeller.

Analysere tumor- og vevsfordeling av målantigenspesifikt terapeutisk antistoff

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Denne protokollen demonstrerer uttrykk og rensing av antistoffer og sanntidsovervåking av antistofffordeling i svulst og vev. Screening antistoffer med beskrevet protokoll vil bidra til å velge antistoffer som har begrenset ikke-spesifikk vevfordeling, og berike tumor lokaliseringer. Den beskrevne teknikken er rask og kostnadseffektiv.Andre teknikker, som enkeltfotonutslipps computertomografi og positronutslippstomografi, er svært dyre og krever radioaktive og andre sofistikerte sporstoffer. Teknikken er ikke begrenset til kreft rettet mot antistoffer. Det kan brukes på enhver annen sykdom, som lunge- eller hjertesykdommer, for analyse av antistofffordeling i kroppen.Demonstrerte prosedyren, vil være Jeremy Gatesman, en veterinær tekniker fra universitetet mitt. Rå CHO-celler i 200 milliliter media, i Delong, Erlenmeyer forbløffet flasker. Kombiner fem milliliter CHO freestyle media med 50 mikrogram variabel tung klone DNA, og 75 mikrogram en variabel lys klone DNA i en 15 milliliter tube.Deretter virvler røret. La blandingen stå ved romtemperatur i fem minutter. Tilsett 750 mikroliter på ett mg per milliliter polyetylenimin lager til DNA-løsningen, og aggressivt vortex det i 30 sekunder.La blandingen stå ved romtemperatur i ytterligere fem minutter. Tilsett hele blandingen til CHO-cellene mens du rister kolben manuelt. Umiddelbart inkubere cellene ved 37 grader Celsius mens du rister ved 130 RPM.På neste dag legger du til to milliliter med 100 X antiklumpingsmiddel, og to milliliter med 100 X antibakteriell antimykotisk løsning på cellene. Inkuber kolben ved 32 til 34 grader Celsius, med risting ved 130 RPM. Fortsett å kultere cellene i 10 til 11 dager, og tilsett 10 milliliter Tryptone N1-fôr, og to milliliter på 100 X glutamin supplement på hver femte dag.Tell cellene på hver tredje dag for å sikre at cellelevbarheten forblir over 80%På dag 10 eller 11 høster du mediet for antistoffrensing ved å sentrifugere kulturen ved 3000 ganger G, og fire grader Celsius i 40 til 60 minutter. Deretter filtrerer du det klare mediet med et 0,22 mikrometerflaskefilter. For å rense antistoffene, likevekt proteinet A-kolonne med to kolonnevolumer av bindingsbuffer.Send det filtrerte mediet gjennom kolonnen med en strømningshastighet på én milliliter per minutt. Vask deretter kolonnen med to kolonnevolumer med bindingsbuffer. Bruk fem milliliter elutionbuffer for å elute antistoffet i 500 mikroliters fraksjoner.Og nøytraliser pH-en til det hentyde antistoffet ved å legge til 10 mikroliter nøytraliseringsbuffer for brøk. Mål konsentrasjonen av det rensede antistoffet med et spektrofotometer ved hjelp av standardprotokollen for IgG. Dialyze 0,5 milliliter av antistoffet ved hjelp av en dialysekassett i en liter bøyningbuffer.Etter fire timer, overfør dialysekassetten til fersk buffer og dialyze over natten. For å sette opp en bøyningsreaksjon, legg til 0,03 mikrogram IRR-fargestoff 800 CWU per ett milligram antistoff i et totalt volum på 500 mikroliter. Inkuber blandingen i to timer ved 20 grader Celsius, og rens deretter de merkede konjugatene ved omfattende dialyse mot PBS.Anslå graden av merking ved å måle absorbansen av fargestoff 780 nanometer, og absorbans av proteinet ved 280 nanometer. For å utvikle mus xenografer, løft forsiktig dyrets hud og skill det fra det underliggende muskellaget. Injiser sakte 100 mikroliter cellefjæring under huden med en 26 gauge nål.Vent noen sekunder før du tar nålen ut slik at kjelleren matrise medium informere semi-solid gel-lignende struktur sammen med celler under huden, som vil hindre blandingen fra å komme ut av injeksjonsstedet. For å utføre in vivo-bildebehandling, injiser fargestoffet merket antistoff via halevenen. Etter å ha bedøvet musen, se etter mangel på respons på pedalreflekser, og utvide venen ved å bruke varmt vann.Bruk en 1 cc insulinsprøyte med en 26 gauge kanyle for å injisere 25 mikrogram av det merkede antistoffet i et volum på 100 mikroliter. Som en negativ kontroll, etikett og injisere den ikke-spesifikke IgG isotype antistoff som ikke målrette kreftceller. Utfør in vivo imaging åtte, 24 og 48 timer etter antistoffinjeksjoner.Klikk initialiser i bildeprogramvaren. Bekreft at trinntemperaturen er 37 grader Celsius. I kontrollpanelet setter du opp fluorescensavbildning gjennom bildeveiviseren, og setter eksitasjonen til 773 nanometer, utslipp til 792 nanometer.Overfør den bedøvede musen inn i bildekammeret. Plasser den på bildefeltet ved hjelp av nesekjeglen. Når du er klar, klikker du på hent på kontrollpanelet for bildeanskaffelsen, og klikker på automatisk eksponering.Det genererte bildet er overlegget av fluorescensen på det fotografiske bildet med optisk fluorescens og tetthet som vises i enheter av tellinger eller fotoner. Positive cDNA kloner med variabel tunge og variable lysdomener ble bekreftet med kolonien PCR. Representative resultater av renset farletuzumab som kjører på ikke-reduserende og redusere SDS-siden, vises her.Tunge og lette kjeder produserte 50 og 25 kilodaltonbånd etter reduksjon. Binding av antistoffer mot innfødte proteiner i celleoverflaten ble også bekreftet. Fluorescerende merkede antistoffer ble halevene injisert, i mus podet med full R1 uttrykke svulster.Dyr ble levd bilde på flere tidspunkter ved hjelp av IVIS. dataene gir selektiv berikelse av fulle R1- og BaCa-antistoffer inn i svulstene. Når du prøver denne protokollen, Husk at holdt vedlikehold av CHO celler er avgjørende for antistoff utbytte.Og det er viktig å ha en lignende grad av fluorescerende fargestoffbedømming for konkurransedyktig tumor lokalisering. Etter denne prosedyren kan andre metoder som vev immunohistochemistry og vev eller tumor spesifikke ELISA utføres for å støtte levende mus imaging data.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Målet cellen pre berikelse og hele genomet forsterkning for enkeltcelle nedstrøms karakteristikk

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

En tredimensjonal Tymusatrofi kultur system for å generere murine indusert pluripotent Stem Cell-avledet tumor antigen-spesifikke Tymusatrofi nybyggere

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro svulst celle Rechallenge For prediktiv evaluering av Chimeric Antigen reseptor T celle Antitumor funksjon

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo Immunofluorescence lokalisering for vurdering av terapeutiske og diagnostiske antistoff Biodistribusjon i Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Analysere tumor Gene Expression faktorer med CorExplorer Web portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Måle sanntids narkotikarespons i organotypic tumor vev skiver

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...