Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
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Somos gratos ao Centro de Câncer da Universidade da Virgínia, ao Centro de Análise Biomolecular, ao Centro Avançado de Microscopia e ao Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S é um investigador de carreira em início de carreira da Academia de Câncer de Ovário (OCA-DoD). Este trabalho foi apoiado pela subvenção do NCI/NIH (R01CA233752) para J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) prêmio de financiamento nível-1 para J. T-S (BC17097) e prêmio de financiamento do Programa de Pesquisa do Câncer de Ovário (OCRP) dos EUA (OC180412) para J. T-S

Todos os procedimentos envolvendo o manejo de animais e os estudos de xenoenxertos tumorais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) aqui na Universidade da Virgínia e de acordo com as normas regulamentares pertinentes
1. Expressão e purificação de anticorpos
<ol><li>Manutenção de células CHO<ol>
<li>Cultivar células CHO em FreeStyle CHO Media complementada com suplemento de 1x glutamina disponível comercialmente a 37 °C tremendo a...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. 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O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

A entrega específica do tecido seletivo e tumoral de agente terapêutico anticâncer é a chave para medir a eficácia e a segurança de uma determinada terapia-alvo13. Aqui descrevemos uma abordagem rápida e eficiente para investigar a distribuição detalhada de tecidos e tumores de anticorpos clínicos, farletuzumabe e um anticorpo BaCa não clínico. A abordagem descrita é aplicável a qualquer anticorpo recém-gerado e pode ser usada juntamente com um anticorpo clinicamente eficaz (com qua...

A FDA aprovou o primeiro anticorpo monoclonal direcionado ao CD3 (OKT3, Muromonab) em 19861,2. Desde então, nos próximos vinte anos, houve uma rápida explosão no campo da engenharia de anticorpos devido ao sucesso esmagador de anticorpos contra inibidores de ponto de verificação imunológico3. Além da ativação indireta do sistema imunológico, os anticorpos estão sendo destinados a sinalizar diretamente as células cancerígenas para engajar precisamente as células efeitológicas, desencadear a citotoxicidade através do agonista do receptor da morte, bloquear a sinalização de sobrevivência das células tumorais, obstruir a angiogênese (crescimento dos vasos sanguíneos), restringir os reguladores imunológicos, fornecer radioisótopos, drogas de quimioterapia e siRNA como agentes conjugados2. Além disso, estudar os fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de vários anticorpos na superfície das células T derivadas do paciente e células NK (CAR-T e CAR-NK) é uma área de rápido crescimento das investigações clínicas para terapias baseadas em células4.
A afinidade ultra-alta de drogas à base de anticorpos que fornecem seletividade para células tumorais expressas de antígeno torna-o um agente atraente. Da mesma forma, a entrega direcionada e a retenção tumoral de um anticorpo terapêutico (ou uma droga química) é a chave para equilibrar a eficácia sobre a toxicidade. Portanto, um grande número de estratégias baseadas em engenharia de proteínas que incluem, mas não se limitam a anticorpos bisespecíficos5 e tri-específicos6 estão sendo explorados para melhorar significativamente a retenção otimizada de tumores de intravenosamente (IV) injetável terapêutica5,7. Aqui, descrevemos um método simples baseado em fluorescência para abordar a distribuição de tumores e tecidos de anticorpos anticâncicos potencialmente eficazes.
Como os tecidos animais possuem auto-fluorescência quando excitados em espectro visível, os anticorpos foram inicialmente rotulados com corante infravermelho próximo (por exemplo, IRDye 800CW). Para provas de investigações conceituais, fizemos uso do receptor de folato alfa-1 (FOLR1) visando anticorpos chamados farletuzumab e seu derivado chamado ativador de citotoxicidade de âncora bispecífica (BaCa)7 anticorpo que co-visa FOLR1 e receptor de morte-5 (DR5)8 em um anticorpo recombinante. FOLR1 é um receptor-alvo superexpresso bem definido em células cancerígenas ovarianas e TNBC, xenoenxertos tumorais e tumores de pacientes9. Notavelmente, existem múltiplos esforços para explorar clinicamente folr1 usando abordagens baseadas em anticorpos para engajar células de efeito imunológico e conjugados de anticorpos (ADC) para cânceres de ovário e mama10,11.
Neste artigo de métodos, clonamos, expressamos e purificamos o anti-FOLR1 clínico (farletuzumab) juntamente com outros anticorpos de controle usando o sistema de expressão CHO. O isótipo IgG1 e um anticorpo clínico anti-idiotype mucin-16 chamado abagovomab12 foram usados como controles negativos. Após a purificação da proteína A, os anticorpos indicados foram rotulados com IRDye 800CW e foram administrados na veia traseira de camundongos nus, com xenoenxertos de tumor ovariano ou FOLR1 humanos transfectados com facadas expressando xenoenxertos de câncer de cólon murino. A localização de anticorpos foi rastreada por imagens ao vivo usando espectro de imagem in vivo em vários pontos de tempo diferentes7. Este método não requer qualquer modificação genética ou injeção do substrato para permitir a emissão de luz e é significativamente mais rápido, econômico e eficiente. O protocolo geral de clonagem, expressão, purificação e rotulagem descrito abaixo pode ser aplicado a qualquer anticorpo clínico e não clínico se as sequências de cadeia pesada e leve estiverem disponíveis.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Anticorpos monoclonais são drogas multifuncionais de alta afinidade que trabalham por mecanismos independentes variáveis para eliminar células cancerígenas. Ao longo das últimas décadas, o campo de conjugados anticorpos, anticorpos bisespecíficos, receptores de antígeno quimérico (CAR) e imunoterapia contra o câncer emergiu como a área mais promissora de investigações básicas e terapêuticas. Com numerosos testes em humanos bem-sucedidos visando receptores de ponto de verificação imunológicos e células CAR-T em leucemia e melanoma em um ritmo inovador, são tempos altamente emocionantes para terapêuticas oncológicas derivadas de variações da engenharia de anticorpos. Lamentavelmente, um número significativamente grande de anticorpos e terapêutica baseada em CAR também se mostrou decepcionante em testes em humanos de cânceres sólidos devido à limitada disponibilidade de células de efeito imunológico no leito tumoral. É importante ressaltar que a distribuição inespecífica de anticorpos terapêuticos em tecidos diferentes dos tumores também contribui para a falta de eficácia clínica, toxicidade associada e falha clínica. Como a tradução fiel de estudos pré-clínicos em trilhas clínicas humanas são altamente confiadas na eficácia e estudos de segurança do xenoenxerto de tumores de camundongos, aqui destacamos um método para testar o tumor e a distribuição geral de tecidos de anticorpos terapêuticos. Isso é conseguido rotulando o anticorpo purificado proteína-A com corante fluorescente infravermelho próximo seguido de imagem viva de camundongos portadores de tumores.

Na metodologia descrita, primeiro clonamos anticorpos voltados para o receptor de folato alfa-1 (FOLR1) chamado farletuzumab, e um anticorpo bispecífico chamado BaCa consistindo de farletuzumabe e lexatumumab, juntamente com anticorpos de controle como abagovomab (sequências fornecidas no Arquivo Suplementar 1). Detalhes dos domínios de variável pesada (VH) e luz variável (VL) em clones de DNA (pVH, pVL) são mostrados na Figura 1A. Para confirmar os clones positivos, r...

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Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.

Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Este protocolo demonstra a expressão e purificação de anticorpos e o monitoramento em tempo real da distribuição de anticorpos em tumor e tecido. Os anticorpos de triagem com o protocolo descrito ajudarão a selecionar anticorpos que tenham distribuição limitada de tecidos não específicos e enriquecer as localizações tumorais. A técnica descrita é rápida e econômica.Outras técnicas, como tomografia computadorizada por emissão de fótons e tomografia de emissão de pósitrons, são muito caras e requerem rastreadores radioativos e outros traçadores sofisticados. A técnica não se limita ao câncer mirando anticorpos. Pode ser aplicado a qualquer outra doença, como doenças pulmonares ou cardíacas, para a análise da distribuição de anticorpos no corpo.Demonstrando o procedimento, estará Jeremy Gatesman, um técnico veterinário da minha universidade. Células DE CHO brutas em 200 mililitros da mídia, em Delong, Erlenmeyer confundiu frascos. Combine cinco mililitros de mídia freestyle CHO com 50 microgramas de DNA de clone pesado variável, e 75 microgramas um DNA de clone de luz variável em um tubo de 15 mililitros.Então, vórtice do tubo. Deixe a mistura em temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione 750 microlitadores de um miligrama por mililitro de polietilenimina à solução de DNA, e agressivamente vórtice por 30 segundos.Deixe a mistura em temperatura ambiente por mais cinco minutos. Adicione toda a mistura às células CHO enquanto agita manualmente o frasco. Incubar imediatamente as células a 37 graus Celsius enquanto treme a 130 RPM.No dia seguinte, adicione dois mililitros de 100 X anti-clumping agente, e dois mililitros de 100 X solução antibacteriana antimíctica para as células. Incubar os frascos a 32 a 34 graus Celsius, com agitação a 130 RPM. Continue aculturar as células por 10 a 11 dias, adicionando 10 mililitros de ração Tryptone N1, e dois mililitros de 100 X suplemento de glutamina a cada quinto dia.Conte as células em cada três dias para garantir que a viabilidade celular permaneça acima de 80% No dia 10 ou 11, colher o meio para purificação de anticorpos, centrifugando a cultura a 3000 vezes G, e quatro graus Celsius por 40 a 60 minutos. Em seguida, filtre a mídia clara com um filtro de garrafa de 0,22 micrômetro. Para purificar os anticorpos, equilibre a proteína Uma coluna com dois volumes de coluna de tampão de ligação.Passe a mídia filtrada através da coluna na taxa de fluxo de um mililitro por minuto. Em seguida, lave a coluna com dois volumes de coluna de tampão de ligação. Use cinco mililitros de tampão de elução para elutar o anticorpo em 500 frações de microliter.E neutralizar o pH do anticorpo alusão adicionando 10 microliters de tampão de neutralização para fração. Meça a concentração do anticorpo purificado com um espectotômetro usando o protocolo padrão para IgG. Dialyze 0,5 mililitros do anticorpo usando um de diálise em um litro de tampão de conjugação.Depois de quatro horas, transfira o de diálise para tampão fresco e difera durante a noite. Para configurar uma reação de conjugação, adicione 0,03 microgramas de corante IRR 800 CWU por um miligrama de anticorpo em um volume total de 500 microliters. Incubar a mistura por duas horas a 20 graus Celsius, depois purificar os conjugados rotulados por diálise extensiva contra a PBS.Estime o grau de rotulagem medindo a absorção do corante de 780 nanômetros, e a absorvância da proteína em 280 nanômetros. Para desenvolver xenógrafos de camundongos, levante suavemente a pele do animal e separe-a da camada muscular subjacente. Injete lentamente 100 microliters de suspensão celular sob a pele com uma agulha calibre 26.Aguarde alguns segundos antes de tirar a agulha para que o meio da matriz do porão informe a estrutura semissólida semelhante a gel, juntamente com células sob a pele, o que impedirá que a mistura saia do local da injeção. Para realizar imagens in vivo, injete o anticorpo rotulado de corante através da veia da cauda. Depois de anestesiar o mouse, verifique a falta de resposta aos reflexos do pedal e dilatar a veia aplicando água morna.Use uma seringa de insulina de 1cc com uma agulha de calibre 26 para injetar 25 microgramas do anticorpo rotulado em um volume de 100 microliters. Como um controle negativo, rotule e injete o anticorpo isótipo IgG não específico que não tenha como alvo as células cancerígenas. Realize imagens in vivo oito, 24 e 48 horas após injeções de anticorpos.No software de imagem, clique em inicializar. Confirme que a temperatura do palco é de 37 graus Celsius. No painel de controle, configure imagens de fluorescência através do assistente de imagem, e defina a excitação para 773 nanômetros, emissão para 792 nanômetros.Transfira o rato anestesiado para a câmara de imagens. Posicione-o no campo de imagem usando o cone do nariz. Quando estiver pronto, clique em adquirir no painel de controle para a aquisição da imagem e clique em expor automaticamente.A imagem gerada é a sobreposição da fluorescência na imagem fotográfica com fluorescência óptica e densidade exibida em unidades de contagens ou fótons. Clones de cDNA positivos com domínios de luz variável pesada e variável foram confirmados com PCR colônia. Os resultados representativos do farletuzumabe purificado executado na página SDS não redutor e redutor são mostrados aqui.As cadeias pesadas e leves produziram 50 e 25 faixas quilodalton após a redução. Também foi confirmada a ligação de anticorpos às proteínas nativas na superfície celular. Anticorpos fluorescentes rotulados foram injetados na veia da cauda, em camundongos enxertados com tumores expressos de R1 completos.Os animais eram imagens vividas em vários pontos de tempo usando ivis. os dados confrem enriquecimento seletivo de anticorpos R1 e BaCa completos nos tumores. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que a manutenção das células CHO é fundamental para o rendimento de anticorpos.E é importante ter um grau semelhante de conjugação de corante fluorescente para localização competitiva do tumor. Após esse procedimento, outros métodos como a imunohistoquímica tecidual e o tecido ou tumor específico ELISA podem ser realizados para apoiar os dados de imagem de camundongos vivos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Pesquisa do câncer

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Ensaio de reação em cadeia de polimerase digital para a variação genética em paciente esporádicos polipose adenomatosa familiar usando o formato de microplaqueta-em-um-tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Um sistema tridimensional da cultura Thymic para gerar os Emigrants Thymic antígeno-específicos induzidos pilha-derivados do tumor derivado murine

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Em Vitro Tumor Cell reexposição para avaliação preditiva de Receptor de antígeno quimérico célula T função antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo localização de imunofluorescência para avaliação de anticorpo terapêutico e diagnóstico biodistribuição em pesquisa de câncer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Usando células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem para a geração de células T específicas de antígeno tumoral

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