Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Мы благодарны Университету Вирджинии онкологический центр Core Imaging фонда, биомолекулярного анализа фонда, Расширенный микроскопии фонда и основной Виварий фонда для оказания помощи. J. T-S является ранней карьеры следователя Академии рака яичников (OCA-DoD). Эта работа была поддержана грантом NCI/NIH (R01CA2333752) J. T-S, Программой исследований рака молочной железы (BCRP) прорывной премии уровня-1 J. T-S (BC17097) и премией США по исследованию рака яичников (OCRP) (OCRP) J. T-S

Все процедуры, связанные с обращением с животными и исследования ксенотрансплантатами опухолей, были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными (IACUC) здесь, в Университете Вирджинии, и соответствуют соответствующим нормативным стандартам
1....

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

Селективная и опухолевая ткань специфической доставки противооопухольной терапевтического агента является ключом к измерению эффективности и безопасности данной целевойтерапии 13. Здесь мы описали быстрый и эффективный подход к исследованию детального распределения т?...

FDA одобрило первый моноклональный антитела ориентации CD3 (OKT3, Muromonab) в 1986году 1,2. С тех пор в течение следующих двадцати лет, произошел быстрый взрыв в области инженерии антител из-за подавляющего успеха антител против ингибиторов иммунной контрольной точки3. Помимо косвенной активации иммунной системы, антитела в настоящее время направлены непосредственно флаг раковых клеток точно заниматься иммунных клеток эффектора, вызвать цитотоксиситу через агонист рецепторов смерти, блок выживания опухолевых клеток сигнализации, препятствовать ангиогенеза (рост кровеносных сосудов), ограничить иммунные регуляторы контрольно-пропускных псов, доставить радиоизотопы, химиотерапевтические препараты и siRNAв качестве спряженных агентов 2. Кроме того, изучение одной цепи переменных фрагментов (scFv) различных антител на поверхности пациента производных Т-клеток и НК-клеток (CAR-T и CAR-NK) является быстро растущей областью клинических исследований для клеточнойтерапии 4.
Сверхвысокое сродство препаратов на основе антител, которые обеспечивают избирательность к антигену, выражаюму опухолевые клетки, делает его привлекательным агентом. Аналогичным образом, целевая доставка и удержание опухоли терапевтического антитела (или химического препарата) является ключом к балансу эффективности над токсичностью. Таким образом, большое количество белков инженерных стратегий, которые включают, но неограничиваются бисспецифических 5 и трехспецифическихантител 6 в настоящее время используются для значительного повышения алчность оптимизированной опухоли удержания внутривенно (IV)вводили терапии 5,7. Здесь мы описываем простой метод на основе флуоресценции для решения опухоли и распределения тканей потенциально эффективных противоораком антител.
Поскольку ткани животных обладают автоматической флуоресценцией при возбуждении в видимом спектре, антитела были первоначально помечены вблизи инфракрасного красителя (например, IRDye 800CW). Для доказательства концептуальных исследований, мы использовали фолиевой рецептор альфа-1 (FOLR1) ориентации антитела называется farletuzumab и его производные называется Бисспецифический якорь Цитотоксичность активатор (BaCa)7 антитела, которые совместно цели FOLR1 и смерти рецептор-5 (DR5)8 в одном рекомбинантных антител. FOLR1 является четко определенным переэкспрессом целевого рецептора в раковых клетках яичников и TNBC, опухолевых ксенотрансплантатах и опухоляхпациентов 9. Примечательно, что Есть несколько усилий, чтобы клинически использовать FOLR1 с использованием антител на основе подходов для привлечения иммунных клеток эффектора и антител наркотиков конъюгации (ADC) для рака яичникови молочной железы 10,11.
В этой работе методов, мы клонировали, выразили и очищены клинические анти-FOLR1 (farletuzumab) наряду с другими антителами контроля с помощью системы выражения CHO. Isotype IgG1 и клиническое anti-idiotype mucin-16 антитело вызванное abagovomab12 были использованы как отрицательные управления. После очистки белка-А, указанные антитела были помечены IRDye 800CW и вводились в хвостовую вену обнаженных мышей либо подшипников опухоли яичников ксенотрансплантатов или ножом трансфицированных человека FOLR1 выражая мурин рака толстой кишки ксенотрансплантатов. Локализация антител отслеживалась живой визуализацией с использованием спектра визуализации in vivo в нескольких разных точкахвремени 7. Этот метод не требует каких-либо генетических модификаций или инъекций субстрата для обеспечения легкого излучения и значительно быстрее, рентабельнее и эффективнее. Общий протокол клонирования, экспрессии, очистки и маркировки, описанный ниже, может применяться к любым клиническим и неклиническим антителам, если имеются тяжелые и легкие цепные последовательности.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Моноклональные антитела являются высокой сродством многофункциональных препаратов, которые работают с переменными независимыми механизмами для устранения раковых клеток. За последние несколько десятилетий наиболее перспективной областью основных и терапевтических исследований стала область конъюгированных антител антител, бисспецифических антител, химерных антигенных рецепторов (ЦАР) и иммунотерапии рака. С многочисленными успешными испытаниями на людях, направленных на иммунные рецепторы контрольно-пропускных мишеней и CAR-T клеток при лейкемии и меланоме в прорывном темпе, это очень захватывающие времена для онкологических терапевтических средств, полученных из вариаций антител инженерии. К сожалению, значительно большое количество антител и CAR основе терапии также оказались разочаровывающими в человеческих испытаний твердых раковых заболеваний из-за ограниченной доступности иммунных клеток-эффекторов в опухолевой постели. Важно отметить, что неспецифическое распределение терапевтических антител в тканях, помимо опухолей, также способствует отсутствию клинической эффективности, связанной с этим токсичности и клинической недостаточности. Поскольку верный перевод доклинических исследований в клинические тропы человека в значительной степени зависит от ксенотрансплантата мышей эффективности и безопасности исследований, здесь мы подчеркиваем метод для проверки опухоли и общего распределения тканей терапевтических антител. Это достигается путем маркировки белка-очищенные антитела с вблизи инфракрасного флуоресцентного красителя следуют живые изображения опухолевых мышей подшипника.

В описанной методологии, сначала мы клонировали антитела ориентации фолиевой рецептор альфа-1 (FOLR1) имени farletuzumab, и биспецифические антитела под названием BaCa, состоящий из farletuzumab и lexatumumab наряду с антителами контроля, таких как abagovomab (последовательности, представленные в дополнител?...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Здесь мы представляем протокол для изучения виво локализации антител у мышей опухоли ксенотрансплантата моделей.

Анализ опухоли и распределения тканей целевого антигена специфических терапевтических антител

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Этот протокол демонстрирует экспрессию и очищение антител и мониторинг распределения антител в опухоли и тканях в режиме реального времени. Скрининг антител с описанным протоколом поможет выбрать антитела, которые имеют ограниченное неспецифическое распределение тканей, и обогатить локализацию опухоли. Описанный метод является быстрым и рентабельным.Другие методы, такие, как однокотонная эмиссионная компьютерная томография и позитронно-эмиссионная томография, стоят очень дорого и требуют радиоактивных и других сложных трассировщиков. Техника не ограничивается антителами, нацеленные на рак. Он может быть применен к любым другим заболеваниям, таким как болезни легких или сердца, для анализа распределения антител в организме.Демонстрацией процедуры будет Джереми Гейтсман, ветеринарный техник из моего университета. Сырые клетки CHO в 200 миллилитров средств массовой информации, в Delong, Erlenmeyer сбит с толку колбы. Объедините пять миллилитров средств массовой информации CHO freestyle с 50 микрограммами переменной тяжелой ДНК клона и 75 микрограммами ДНК клона переменного света в 15 миллилитровой трубке.Затем вихрь трубки. Оставьте смесь при комнатной температуре на пять минут. Добавьте 750 микролитров по 1 миллиграмму на миллилитр полиэтиленовый запас в раствор ДНК и агрессивно вихрем в течение 30 секунд.Оставьте смесь при комнатной температуре еще на пять минут. Добавьте всю смесь в клетки CHO, вручную встряхивая колбу. Немедленно инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию при встряхивании при 130 об/мин.На следующий день добавьте в клетки два миллилитра антикомпания 100 X и два миллилитров антибактериального раствора 100 X. Инкубировать колбы при 32 до 34 градусов по Цельсию, со тряской при 130 об/мин. Продолжить культивирование клеток в течение 10 до 11 дней, добавив 10 миллилитров триптона N1 корма, и два миллилитров 100 X глутамин дополнения на каждый пятый день.Подсчитайте клетки на каждый третий день, чтобы убедиться, что жизнеспособность клеток остается выше 80% На день 10 или 11, урожай среды для очистки антител путем центрифугирования культуры в 3000 раз G, и четыре градуса по Цельсию в течение 40 до 60 минут. Затем отфильтруй чистый мультимедиа с помощью фильтра бутылки 0,22 микрометра. Чтобы очистить антитела, эквилибрировать белок колонки с двумя объемами столбца связывающего буфера.Перейдите фильтрованные средства массовой информации через столбец со скоростью потока в один миллилитр в минуту. Затем вымойте столбец двумя объемами столбца связывающего буфера. Используйте пять миллилитров буфера элюции, чтобы урезать антитела в 500 фракций микролитров.И нейтрализовать рН ссылающихся антител, добавив 10 микролитров буфера нейтрализации для фракции. Измерьте концентрацию очищенного антитела с помощью спектрофотометра с помощью протокола по умолчанию для IgG. Диализ 0,5 миллилитров антитела с помощью диализной кассеты в одном литре буфера спряжения.Через четыре часа перенесите кассету с диализом в свежий буфер и облизой на ночь. Чтобы настроить реакцию спряжения, добавьте 0,03 микрограмма красителя IRR 800 CWU на один миллиграмм антител в общем объеме 500 микролитров. Инкубировать смесь в течение двух часов при 20 градусах по Цельсию, а затем очистить помечены конъюгирует обширный диализ против PBS.Оцените степень маркировки путем измерения поглощения красителя 780 нанометров и поглощения белка на 280 нанометров. Для разработки ксенографов мышей аккуратно поднимите кожу животного и отделите ее от основного мышечного слоя. Медленно ввись 100 микролитров клеточной подвески под кожу с 26 калибровочных игл.Подождите несколько секунд, прежде чем принимать иглу так, что подвал матрицы среды информировать полутвердых гель-как структура вместе с клетками под кожей, которая будет препятствовать смеси от выхода из места инъекции. Для выполнения в vivo изображений, вводить краситель помечены антитела через хвостовой вены. После анестезии мыши, проверьте на отсутствие реакции на педали рефлексы, и расширить вену, применяя теплую воду.Используйте шприц инсулина 1cc с иглой 26 датчика для того чтобы впрыснуть 25 микрограммов обозначенного антитела в томе 100 микролитров. В качестве отрицательного контроля, этикетки и вводить неспецифические IgG изотип антитела, которые не нацелены на раковые клетки. Выполните в vivo изображения восемь, 24 и 48 часов после инъекций антител.В программном обеспечении для визуализации щелкните инициализировать. Подтвердите, что температура стадии составляет 37 градусов по Цельсию. В панели управления на настройке флуоресценции изображения через мастера изображений, и установить возбуждение до 773 нанометров, выброс до 792 нанометров.Перенесите анестезированной мыши в камеру визуализации. Распоимите его на поле визуализации с помощью носового конуса. Когда вы будете готовы, нажмите приобрести на панели управления для получения изображения, и нажмите кнопку автоматического разоблачения.Сгенерированное изображение является наложением флуоресценции на фотографическое изображение с оптической флуоресценцией и плотностью, отображаемой в единицах графов или фотонов. Положительные клоны cDNA с переменными тяжелыми и переменными доменами света были подтверждены с ПЦР колонии. Здесь показаны репрезентативные результаты очищенного фарлетузумаба, запущенного на странице без сокращения и уменьшения SDS.Тяжелые и легкие цепи произвели 50 и 25 килодальтонных полос после сокращения. Подтверждена также привязка антител к местным белкам на поверхности клетки. Флуоресцентно помеченные антитела были впрыснуты хвостовой вены, в мышей привитых с полным R1 экспрессии опухолей.Звери жили изображения в нескольких точках времени с помощью IVIS. данные confirs селективного обогащения полного R1 и BaCa антител в опухоли. При попытке этого протокола, имейте в виду, что содержание клеток CHO имеет решающее значение для выработки антител.И важно иметь аналогичную степень спряжения флуоресцентных красителей для конкурентной локализации опухоли. После этой процедуры, другие методы, такие как иммуногистохимия тканей и тканей или опухоли конкретных ELISA могут быть выполнены для поддержки живых мышей изображений данных.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Целевые ячейки предварительного обогащения и весь геном усилители на одну ячейку вниз по течению характеристика

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Трехмерная тимическая культурная система для генерации Murine индуцированных Плюрипотентные стволовые клетки полученных Опухолевые антигена конкретных Тимических эмигрантов

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

В Vitro опухолевых клеток Rechallenge для прогнозирования оценки химерных антигена рецепторов Т-клеток противоопухолевые функции

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

В Vivo Иммунофлуоресценция Локализация для оценки терапевтического и диагностического антитела биораспределения в онкологических исследований

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Анализ факторов экспрессии генов опухоли с веб-порталом CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Измерение в режиме реального времени ответ на наркотики в органотипической опухоли ткани фрагменты

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...