Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Estamos agradecidos a la instalación de imágenes principales del Centro Oncológico de la Universidad de Virginia, a la Instalación de Análisis Biomolecular, a la Instalación de Microscopía Avanzada y a la Instalación Core Vivarium para asistencia. J. T-S es un investigador de carrera temprana de la Academia de Cáncer de Ovario (OCA-DoD). Este trabajo fue apoyado por la subvención NCI/NIH (R01CA233752) a J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) premio de nivel 1 de gran avance a J. T-S (BC17097) y U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) premio de financiación (OC180412) a J. T-S

Todos los procedimientos relacionados con el manejo de animales y estudios de xenoinjertos tumorales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aquí en la Universidad de Virginia y se ajustan a las normas regulatorias pertinentes
1. Expresión y purificación de anticuerpos
<ol><li>Mantenimiento de células CHO<ol>
<li>Cultivar células CHO en FreeStyle CHO Media complementado con suplemento de glutamina 1x disponible comercialmente a 37 o...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

La administración selectiva y específica del tejido tumoral del agente terapéutico contra el cáncer es la clave para medir la eficacia y la seguridad de una terapia dirigida determinada13. Aquí hemos descrito un enfoque rápido y eficiente para investigar la distribución detallada del tejido y tumoral de la clínica, farletuzumab y un anticuerpo BaCa no clínico. El enfoque descrito es aplicable a cualquier anticuerpo recién generado y se puede utilizar junto con un anticuerpo clínicamente...

Fda aprobó el primer anticuerpo monoclonal dirigido a CD3 (OKT3, Muromonab) en 19861,2. Desde entonces durante los siguientes veinte años, ha habido una rápida explosión en el campo de la ingeniería de anticuerpos debido al éxito abrumador de los anticuerpos contra los inhibidores del punto de control inmune3. Además de la activación indirecta del sistema inmunitario, los anticuerpos están destinados a marcar directamente las células cancerosas para atacar con precisión las células del efector inmune, desencadenar la citotoxicidad a través del agonista del receptor de la muerte, bloquear la señalización de supervivencia de las células tumorales, obstruir la angiogénesis (crecimiento de los vasos sanguíneos), restringir los reguladores del punto de control inmune, entregar radioisótopos, medicamentos de quimioterapia y siRNA como agentes conjugados2. Además, el estudio de los fragmentos variables de cadena única (scFv) de varios anticuerpos en la superficie de células T y células NK derivadas del paciente (CAR-T y CAR-NK) es un área de rápido crecimiento de las investigaciones clínicas para terapias basadas en células4.
La afinidad ultra alta de los fármacos basados en anticuerpos que proporciona selectividad a los antígenos que expresan las células tumorales lo convierten en un agente atractivo. Del mismo modo, la administración dirigida y la retención tumoral de un anticuerpo terapéutico (o un fármaco químico) es la clave para equilibrar la eficacia sobre la toxicidad. Por lo tanto, un gran número de estrategias basadas en la ingeniería de proteínas que incluyen pero no se limitan a biespecíficos5 y anticuerpos tri-específicos6 están siendo explotados para mejorar significativamente la avidez optimizada de la retención tumoral de la terapia inyectada por vía intravenosa (IV)5,7. Aquí, describimos un método simple basado en la fluorescencia para abordar la distribución del tumor y el tejido de anticuerpos contra el cáncer potencialmente eficaces.
Debido a que los tejidos animales poseen autofluorescencia cuando se excitan en el espectro visible, los anticuerpos fueron inicialmente etiquetados con un tinte infrarrojo cercano (por ejemplo, IRDye 800CW). Para las pruebas de investigaciones conceptuales, hemos hecho uso del receptor de folato alfa-1 (FOLR1) dirigido a anticuerpos llamados farletuzumab y su derivado llamado activador de citotoxicidad de anclaje biespecí (BaCa)7 anticuerpo que se dirige a FOLR1 y receptor de muerte-5 (DR5)8 en un anticuerpo recombinante. FOLR1 es un receptor diana sobreexpresado bien definido en células cancerosas de ovario y TNBC, xenoinjertos tumorales y tumores de pacientes9. En particular, existen múltiples esfuerzos para explotar clínicamente FOLR1 utilizando enfoques basados en anticuerpos para involucrar células efectos inmunes y conjugados de fármacos de anticuerpos (ADC) para cánceres de ovario y de mama10,11.
En este documento de métodos, clonamos, expresamos y purificamos anti-FOLR1 clínicos (farletuzumab) junto con otros anticuerpos de control utilizando el sistema de expresión CHO. El isotipo IgG1 y un anticuerpo clínico anti-idiotipo mucina-16 llamado abagovomab12 se utilizaron como controles negativos. Tras la purificación de proteínaS A, los anticuerpos indicados se etiquetaron con IRDye 800CW y se administraron en la vena de la cola de ratones desnudos que tenían xenoinjertos tumorales de ovario o se trans infectaron establemente FOLR1 humano que expresan xenoinjertos de cáncer de colon murino. La localización de anticuerpos fue rastreada por imágenes en vivo utilizando espectro de imágenes in vivo en múltiples puntos de tiempo diferentes7. Este método no requiere ninguna modificación genética o inyección del sustrato para permitir la emisión de luz y es significativamente más rápido, rentable y eficiente. El protocolo general de clonación, expresión, purificación y etiquetado descrito a continuación se puede aplicar a cualquier anticuerpo clínico y no clínico si hay secuencias de cadena pesadas y ligeras disponibles.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Los anticuerpos monoclonales son fármacos multifuncionales de alta afinidad que funcionan mediante mecanismos independientes variables para eliminar las células cancerosas. En las últimas décadas, el campo de los conjugados de anticuerpos y fármacos, anticuerpos biespecíficos, receptores de antígenos quiméricos (CAR) e inmunoterapia contra el cáncer ha surgido como el área más prometedora de las investigaciones básicas y terapéuticas. Con numerosos ensayos en humanos exitosos dirigidos a receptores de punto de control inmune y células CAR-T en leucemia y melanoma a un ritmo revolucionario, es muy emocionante para las terapias oncológicas derivadas de variaciones de la ingeniería de anticuerpos. Lamentablemente, un número significativamente grande de anticuerpos y terapias basadas en CAR también han demostrado ser decepcionantes en los ensayos en humanos de cánceres sólidos debido a la limitada disponibilidad de células de efector inmune en el lecho tumoral. Es importante destacar que la distribución inespecífica de anticuerpos terapéuticos en tejidos distintos de los tumores también contribuye a la falta de eficacia clínica, toxicidad asociada e insuficiencia clínica. Como la traducción fiel de estudios preclínicos en senderos clínicos en humanos se basa en gran medida en los estudios de eficacia y seguridad del xenoinjerto tumoral de ratones, aquí destacamos un método para probar el tumor y la distribución general del tejido de los anticuerpos terapéuticos. Esto se logra mediante la etiqueta del anticuerpo purificado de proteína A con un tinte fluorescente infrarrojo cercano seguido de imágenes en vivo de ratones portadores de tumores.

En la metodología descrita, primero clonamos anticuerpos dirigidos al receptor de folato alfa-1 (FOLR1) llamado farletuzumab, y un anticuerpo biespecífico llamado BaCa que consiste en farletuzumab y lexatumumab junto con anticuerpos de control como abagovomab (secuencias proporcionadas en el Archivo Suplementario 1). Los detalles de los dominios representativos de la variable pesada (VH) y de la luz variable (VL) en los clones de ADN (pVH, pVL) se muestran en la Figura 1A....

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Este protocolo demuestra la expresión y purificación de anticuerpos y la monitorización en tiempo real de la distribución de anticuerpos en tumores y tejidos. Los anticuerpos de detección con el protocolo descrito ayudarán a seleccionar anticuerpos que tienen una distribución limitada de tejido no específico y enriquecerán las localizaciones tumorales. La técnica descrita es rápida y rentable.Otras técnicas, como la tomografía computarizada por emisión de un solo fotón y la tomografía por emisión de positrones, son muy costosas y requieren trazadores radiactivos y otros trazadores sofisticados. La técnica no se limita a los anticuerpos dirigidos al cáncer. Se puede aplicar a cualquier otra enfermedad, como enfermedades pulmonares o cardíacas, para el análisis de la distribución de anticuerpos en el cuerpo.Demostrando el procedimiento, estará Jeremy Gatesman, un técnico veterinario de mi universidad. Células CHO crudas en 200 mililitros de medios, en delong, Erlenmeyer desconcertado matraces. Combine cinco mililitros de medios de estilo libre CHO con 50 microgramos de ADN de clon pesado variable y 75 microgramos de ADN de clon ligero variable en un tubo de 15 mililitros.Luego, vórtice el tubo. Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos. Añadir 750 microlitros de un miligramo por mililitro de polietilenimina a la solución de ADN, y vórtice agresivamente durante 30 segundos.Dejar la mezcla a temperatura ambiente durante cinco minutos adicionales. Agregue toda la mezcla a las células CHO mientras agita manualmente el matraz. Incubar inmediatamente las células a 37 grados centígrados mientras se agita a 130 RPM.Al día siguiente, agregue dos mililitros de agente anti-clumping de 100 X y dos mililitros de solución antibacteriana antimicótica a las células. Incubar los matraces a 32 a 34 grados celsius, con agitación a 130 RPM. Continúe cultivando las células durante 10 a 11 días, añadiendo 10 mililitros de alimento de triptona N1, y dos mililitros de suplemento de 100 X glutamina en cada quinto día.Cuente las células cada tercer día para asegurarse de que la viabilidad celular se mantenga por encima del 80% En el día 10 u 11, cosechar el medio para la purificación de anticuerpos centrifugando el cultivo a 3000 veces G, y grados cuatro Celsius durante 40 a 60 minutos. A continuación, filtre el medio transparente con un filtro de botella de 0,22 micrómetros. Para purificar los anticuerpos, equilibre la columna de proteína A con dos volúmenes de columna de tampón de unión.Pase el medio filtrado a través de la columna a un caudal de un mililitro por minuto. A continuación, lave la columna con dos volúmenes de columna de búfer de enlace. Utilice cinco mililitros de tampón de elución para eluir el anticuerpo en 500 fracciones de microlitro.Y neutralice el pH del anticuerpo aludido añadiendo 10 microlitros de tampón de neutralización para fracción. Mida la concentración del anticuerpo purificado con un espectrofotómetro utilizando el protocolo predeterminado para IgG. Dialyze 0,5 mililitros del anticuerpo utilizando un casete de diálisis en un litro de tampón de conjugación.Después de cuatro horas, transfiera el cassette de diálisis a un tampón fresco y dialyze durante la noche. Para configurar una reacción de conjugación, agregue 0,03 microgramos de tinte IRR 800 CWU por un miligramo de anticuerpo en un volumen total de 500 microlitros. Incubar la mezcla durante dos horas a 20 grados centígrados, luego purificar los conjugados etiquetados por diálisis extensa contra PBS.Estimar el grado de etiquetado midiendo la absorbancia del tinte 780 nanómetros, y la absorbancia de la proteína a 280 nanómetros. Para desarrollar xenogramas de ratón, levante suavemente la piel del animal y sepárela de la capa muscular subyacente. Inyecte lentamente 100 microlitros de suspensión celular debajo de la piel con una aguja de calibre 26.Espere unos segundos antes de sacar la aguja para que el medio de matriz del sótano informe la estructura semisólida similar al gel junto con las células debajo de la piel, lo que evitará que la mezcla salga del lugar de inyección. Para realizar imágenes in vivo, inyecte el anticuerpo etiquetado con el tinte a través de la vena de la cola. Después de anestesiar el ratón, compruebe la falta de respuesta a los reflejos del pedal y dilate la vena aplicando agua tibia.Utilice una jeringa de insulina de 1 cc con una aguja de calibre 26 para inyectar 25 microgramos del anticuerpo etiquetado en un volumen de 100 microlitros. Como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo isotipo IgG no específico que no se dirige a las células cancerosas. Realizar imágenes in vivo ocho, 24 y 48 horas después de las inyecciones de anticuerpos.En el software de imágenes, haga clic en inicializar. Confirme que la temperatura de la etapa es de 37 grados centígrados. En el panel de control, configure imágenes de fluorescencia a través del asistente de imágenes y ajuste la excitación a 773 nanómetros, emisión a 792 nanómetros.Transfiera el ratón anestesiado a la cámara de imágenes. Colóquelo en el campo de imagen usando el cono nasal. Cuando esté listo, haga clic en adquirir en el panel de control para la adquisición de imágenes y haga clic en exponer automáticamente.La imagen generada es la superposición de la fluorescencia en la imagen fotográfica con fluorescencia óptica y densidad mostrada en unidades de recuentos o fotones. Se confirmaron clones positivos de ADNs con dominios de luz variable pesada y variable con PCR de colonia. Los resultados representativos de la ejecución de farletuzumab purificado en la página SDS no reductora y reductora se muestran aquí.Las cadenas pesadas y ligeras producían bandas de 50 y 25 kilodalton después de la reducción. También se confirmó la unión de anticuerpos a proteínas nativas en la superficie celular. Los anticuerpos con etiqueta fluorescente fueron inyectados en venas de cola, en ratones injertados con tumores completos de R1 que expresan tumores.Los animales se vivieron imagen en varios puntos de tiempo utilizando IVIS. el enriquecimiento selectivo de los inhibidores de datos de anticuerpos completos R1 y BaCa en los tumores. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que el mantenimiento de las células CHO es fundamental para el rendimiento de anticuerpos.Y es importante tener un grado similar de conjugación de tinte fluorescente para la localización de tumores competitivos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunohistoquímica de tejidos y el ELISA específico de tejidos o tumores para apoyar los datos de imágenes de ratones vivos.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital de la reacción en cadena de polimerasa para la variación genética en un paciente de la poliposis adenomatosa familiar esporádico con el formato de Chip en tubo

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Un sistema de cultivo timático tridimensional para generar emigrantes timémicos específicos de células madre pluripotentes inducidos por la murino

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

En Vitro Tumor celular Rechallenge de evaluación predictiva de antígeno quimérico del Receptor de la célula T función antitumoral

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Uso de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para la generación de células T específicas de antígenos tumorales

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Análisis de los factores de expresión génica tumoral con el portal web de CorExplorer

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Medición de la respuesta de fármacos en tiempo real en rebanadas de tejido tumoral organotípico

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...