Name: analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Vi är tacksamma för University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility och Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S är en tidig karriär utredare av äggstockscancer Academy (OCA-DoD). Detta arbete stöddes av NCI / NIH bidrag (R01CA233752) till J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) genombrott nivå-1 tilldelning till J. T-S (BC17097) och US DoD Äggstockscancer Research Program (OCRP) finansiering tilldelning (OC180412) till J. T-S

Alla förfaranden som involverar djurhantering och tumör xenografts studier granskades och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) här vid University of Virginia och överensstämmer med de relevanta lagstadgade normerna
1. Uttryck och rening av antikroppar
<ol><li>Underhåll av CHO-celler<ol>
<li>Odla CHO-celler i FreeStyle CHO Media kompletteras med kommersiellt tillgängliga 1x glutamin tillägg vid 37 °C skakning vid 130 rpm med 5% CO2 med hjälp a...

<ol>
	<li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muromonab+CD3+(Orthoclone+OKT3).">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li><li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody-siRNA+conjugates:+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy.">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li><li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+immunotherapy.">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1 (2013).</li><li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+Antigen+Receptor+(CAR)+T-Cell+Therapy.">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).</li><li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+bispecific+antibodies.">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li><li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics.">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50 (2018).</li><li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer.">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li><li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation.">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).</li><li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Folate+receptor-alpha+(FOLR1)+expression+and+function+in+triple+negative+tumors.">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209 (2015).</li><li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody,+farletuzumab,+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity.">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li><li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+(Kadcyla).">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li><li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer.">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li><li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer:+considerations+for+efficacy+and+safety.">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li><li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells.">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li><li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer.">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, 18-30 (2010).</li><li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroPET/SPECT/CT+imaging+of+small+animal+models+of+disease.">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li><li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease:+the+SPARC+study.">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li><li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology:+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development.">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li><li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+(TMDD)+Models.">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li></ol>

Selektiv och tumörvävnad specifik leverans av anti-cancer terapeutiska agent är nyckeln till att mäta effekt och säkerhet av en viss riktad terapi13. Här har vi beskrivit ett snabbt och effektivt tillvägagångssätt för att undersöka den detaljerade vävnads- och tumörfördelningen av klinisk, farletuzumab och en nonklinisk BaCa-antikropp. Det beskrivna tillvägagångssättet är tillämpligt på någon nygenererad antikropp och kan användas tillsammans med en kliniskt effektiv antikrop...

FDA godkände den första monoklonala antikroppen inriktning CD3 (OKT3, Muromonab) i 19861,2. Sedan dess under de kommande tjugo åren har det skett en snabb explosion inom området för antikroppsteknik på grund av den överväldigande framgången för antikroppar mot immun kontrollpunktshämmare3. Bredvid indirekt aktivering av immunsystemet, antikroppar syftar till att direkt flagga cancerceller att exakt engagera immun effektorceller, utlösa cytotoxicitet via död receptogonist, blockera tumör cell överlevnad signalering, hindra angiogenes (tillväxt av blodkärl), begränsa immun checkpoint regulatorer, leverera radioisotoper, kemoterapi läkemedel och siRNA som en konjugerad agenter2. Dessutom är studera den enda kedjan variabel fragment (scFv) av olika antikroppar på ytan av patienten härrör T-celler och NK celler (CAR-T och CAR-NK) ett snabbt växande område av kliniska undersökningar för cell-baserade terapier4.
Den ultrahöga affiniteten av antikroppsbaserade läkemedel som ger selektivitet mot antigen som uttrycker tumörceller gör det till ett attraktivt medel. Likaså är riktad leverans och tumör lagring av en terapeutisk antikropp (eller ett kemiskt läkemedel) nyckeln till balans effekt över toxicitet. Därför är ett stort antal protein engineering baserade strategier som inkluderar men inte är begränsade till bispecifika5 och tri-specifika antikroppar6 utnyttjas för att avsevärt förstärka avidity optimerad tumörretention av intravenöst (IV) injicerade therapeutics5,7. Här beskriver vi en enkel fluorescens-baserad metod för att ta itu med tumör och vävnad distribution av potentiellt effektiva anti-cancer antikroppar.
Eftersom djurvävnader besitter auto-fluorescens när upphetsad i synligt spektrum, var antikropparna ursprungligen märkta med nära IR-färgämne (t.ex., IRDye 800CW). För proofs of concept investigations har vi utnyttjat folatreceptorn alpha-1 (FOLR1) med inriktning på antikropp som kallas farletuzumab och dess derivat som kallas Bispecific anchor Cytotoxicity activator (BaCa)7 antibody that co-targets FOLR1 and death receptor-5 (DR5)8 in one recombinant antibody. FOLR1 är en väldefinierad överuttryckt målreceptor i äggstocks- och TNBC-cancerceller, tumörxenografts och patienttumörer9. Noterbart är att det finns flera försök att kliniskt utnyttja FOLR1 med hjälp av antikroppsbaserade metoder för att engagera immuneffektorceller och antikroppar läkemedel konjugater (ADC) för äggstockscancer och bröstcancer10,11.
I detta metoder papper, vi klonade, uttryckt och renade kliniska anti-FOLR1 (farletuzumab) tillsammans med andra kontroll antikroppar med hjälp av CHO uttryck system. IgG1 isotype och en klinisk anti-idiotype mucin-16 antikroppar kallas abagovomab12 användes som negativa kontroller. Efter protein-A rening, indikerade antikroppar var märkt med IRDye 800CW och administrerades i svansen ven av nakna möss antingen med äggstockscancer tumör xenografts eller stably transfected mänskliga FOLR1 uttrycker murine kolon cancer xenografts. Antikroppslokalisationen spårades av live avbildning med hjälp av in vivo imaging spektrum vid flera olika tidpunkter7. Denna metod kräver inte någon genetisk modifiering eller injektion av substratet för att möjliggöra ljusemission och är betydligt snabbare, kostnadseffektiv och effektiv. Det allmänna klonings-, uttrycks-, renings- och märkningsprotokollet som beskrivs nedan kan tillämpas på vilken klinisk och icke-klinisk antikropp som helst om tung- och lätta kedjesekvenser finns tillgängliga.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FreeStyle CHO media</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 12651-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Anti (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Clumping Agent</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 01-0057DG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Insulin Syringe</td>
			<td>BD BioSciences</td>
			<td>Cat #329420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caliper IVIS Spectrum</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>Cat #124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO CD EfficientFeed B</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat #A10240-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-13-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 500 mL RPMI 1640</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 10-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>Cat # 709-175-149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax-I (100X)</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Cat # K21007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>Cat # 11-0034-93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion</td>
			<td>Takara BioScience</td>
			<td>STO344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRDye 800CW NHS Ester</td>
			<td>LI-COR</td>
			<td>Cat # 929-70020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>Cat # 11695-6777-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant Eye Ointment</td>
			<td>Refresh Lacri-Lube</td>
			<td>Cat #4089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Cat # 354234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI transfection reagent</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Cat # BMS1003A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Cat # 66333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop Vacuum Filters</td>
			<td>Millipore Express</td>
			<td>Cat #S2GPT02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>Cat # 15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: OVCAR-3</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>ATCC HTB-161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human: CHO-K cells</td>
			<td>Stable transformed in our lab</td>
			<td>ATCC CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: 4T1</td>
			<td>Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38</td>
			<td>Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td>
			<td>Authenticated by STR profiling</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MC38 hFOLR1</td>
			<td>Generated in our laboratory (This paper)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td>
			<td>Envigo</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>Multiple Orders</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing tumor and tissue distribution of target antigen specific therapeutic antibody

Monoklonala antikroppar är hög affinitet multifunktionella läkemedel som verkar genom variabel oberoende mekanismer för att eliminera cancerceller. Under de senaste decennierna har området antikropp-läkemedel konjugater, bispecifika antikroppar, chimära antigenreceptorer (CAR) och cancer immunterapi framträtt som det mest lovande området för grundläggande och terapeutiska undersökningar. Med många framgångsrika mänskliga försök riktade immun checkpoint receptorer och CAR-T-celler i leukemi och melanom i en genombrottstakt, är det mycket spännande tider för onkologiska therapeutics härrör från variationer av antikroppar engineering. Tyvärr har ett betydligt stort antal antikroppar och CAR-baserade therapeutics också visat sig vara en besvikelse i mänskliga prövningar av fasta cancerformer på grund av den begränsade tillgången på immuneffektorceller i tumörbädden. Viktigt, ospecifik fördelning av terapeutiska antikroppar i andra vävnader än tumörer bidrar också till bristen på klinisk effekt, associerad toxicitet och klinisk misslyckande. Som trogen översättning av prekliniska studier i mänskliga kliniska spår är starkt förlitat sig på möss tumör xenograft effekt och säkerhet studier, här vi belysa en metod för att testa tumör och allmänna vävnad distribution av terapeutiska antikroppar. Detta uppnås genom att märka proteinet-A renad antikropp med nära IR fluorescerande färgämne följt av levande avbildning av tumörbärande möss.

I den beskrivna metodiken klonade vi först antikroppar riktade mot folatreceptorn alpha-1 (FOLR1) med namnet farletuzumab, och en bispecific antikropp som kallas BaCa som består av farletuzumab och lexatumumab tillsammans med kontrollantikroppar som abagovomab (sekvenser som tillhandahålls i Supplementary File 1). Uppgifter om representativa variabel tunga (VH) och variable light (VL) domäner i DNA-kloner (pVH, pVL) visas i figur 1A. För att bekräfta de positiva kloner...

Watch this Scientific Journal Video about Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody at JoVE.com

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Här presenterar vi ett protokoll för att studera in vivo lokalisering av antikroppar i möss tumör xenograft modeller.

Analysera tumör och vävnad distribution av Target Antigen specifik terapeutisk antikropp

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Detta protokoll visar uttryck och rening av antikroppar och realtid övervakning av antikropp distribution i tumör och vävnad. Screening antikroppar med beskrivna protokollet kommer att hjälpa välja antikroppar som har begränsad icke-specifika vävnad distribution, och berika tumör lokaliseringar. Den beskrivna tekniken är snabb och kostnadseffektiv.Andra tekniker, såsom enfoton utsläpp datortomografi och positron emissions tomografi, är mycket dyra och kräver radioaktiva och andra sofistikerade spårämnen. Tekniken är inte begränsad till cancer inriktning antikroppar. Det kan appliceras på någon annan sjukdom, såsom lung- eller hjärtsjukdomar, för analys av antikroppsfördelning i kroppen.Demonstrerar proceduren, kommer att Jeremy Gatesman, en veterinär tekniker från mitt universitet. Råa CHO-celler i 200 milliliter media, i Delong, Erlenmeyer förbryllade kolvar. Kombinera fem milliliter CHO freestyle media med 50 mikrogram variabel tung klon DNA, och 75 mikrogram en variabel ljus klon DNA i en 15 milliliter tub.Sedan, virvel röret. Låt blandningen stå i rumstemperatur i fem minuter. Tillsätt 750 mikroliter på ett milligram per milliliter polyetylenimin lager till DNA-lösningen, och aggressivt virvel det i 30 sekunder.Låt blandningen stå i rumstemperatur i ytterligare fem minuter. Tillsätt hela blandningen till CHO-cellerna medan du skakar kolven manuellt. Omedelbart inkubera cellerna vid 37 grader Celsius medan skakar vid 130 RPM.På nästa dag, tillsätt två milliliter av 100 X anti-klumpmedel, och två milliliter av 100 X antibakteriell antimycotic lösning till cellerna. Inkubera kolvarna i 32 till 34 grader Celsius, med skakningar vid 130 RPM. Fortsätt att kultföra cellerna i 10 till 11 dagar, lägga till 10 milliliter tryptone N1 foder, och två milliliter 100 X glutamin tillägg på var femte dag.Räkna cellerna på var tredje dag för att säkerställa att cellernas livskraft förblir över 80%På dag 10 eller 11, skörda mediet för antikroppsrening genom centrifugering av kulturen vid 3000 gånger G, och fyra grader Celsius i 40 till 60 minuter. Filtrera sedan det klara mediet med ett 0,22 mikrometers flaskfilter. För att rena antikropparna, jämvikt proteinet A kolonn med två kolonn volymer av bindande buffert.För det filtrerade mediet genom kolumnen med flödeshastigheten på en milliliter per minut. Tvätta sedan kolonnen med två kolonnvolymer av bindningsbuffert. Använd fem milliliter elueringsbuffert för att elera antikroppen till 500 mikroliterfraktioner.Och neutralisera pH-värdet i den anspelade antikroppen genom att lägga till 10 mikroliter av neutraliseringsbuffert för fraktion. Mät koncentrationen av den renade antikroppen med en spektrofotometer med hjälp av standardprotokollet för IgG. Dialyze 0,5 milliliter av antikroppen med hjälp av en dialyskassett i en liter konjugationsbuffert.Efter fyra timmar överför du dialyskassetten till färsk buffert och dialyze över natten. För att ställa in en konjugation reaktion, tillsätt 0,03 mikrogram IRR färgämne 800 CWU per ett milligram av antikropp i en total volym av 500 mikroliter. Inkubera blandningen i två timmar vid 20 grader Celsius, sedan rena de märkta konjugaterna genom omfattande dialys mot PBS.Uppskatta graden av märkning genom att mäta absorbansen hos färgämnet 780 nanometer, och absorbans av proteinet vid 280 nanometer. För att utveckla mus xenografer, försiktigt lyfta huden på djuret och separera den från den underliggande muskellagret. Injicera långsamt 100 mikroliter av cellfjädring under huden med en 26 gauge nål.Vänta i några sekunder innan du tar nålen ut så att källaren matris medium informera halvfast gel-liknande struktur tillsammans med celler under huden, vilket kommer att förhindra att blandningen kommer ut från injektionsstället. För att utföra in vivo-avbildning, injicera färgämnet märkt antikropp via svansvenen. Efter sövning musen, kontrollera om det saknas svar på pedal reflexer, och vidga venen genom att tillämpa varmt vatten.Använd en 1cc insulinspruta med en 26 gauge nål för att injicera 25 mikrogram av den märkta antikroppen i en volym av 100 mikroliter. Som en negativ kontroll, märka och injicera den icke-specifika IgG isotyp antikropp som inte riktar cancerceller. Utför in vivo bildframställning åtta, 24 och 48 timmar efter antikroppsinjektioner.Klicka på initialisera i bildhanteringsprogrammet. Bekräfta att scenen temperaturen är 37 grader Celsius. I kontrollpanelen, ställa in fluorescens imaging genom avbildning guiden, och ställ excitation till 773 nanometer, utsläpp till 792 nanometer.Överför den sövda musen in i bildkammaren. Placera den på bildrbildningsfältet med hjälp av noskonen. När redo, klicka förvärva på kontrollpanelen för bilden förvärvet, och klicka på auto exponera.Den genererade bilden är överlagringen av fluorescensen på den fotografiska bilden med optisk fluorescens och densitet som visas i enheter av räkningar eller fotoner. Positiva cDNA kloner med variabel tunga och variabel ljus domäner bekräftades med koloni PCR. Representativa resultat av renad farletuzumab som körs på icke-reducerande och minskande SDS-sida visas här.Tunga och lätta kedjor producerade 50 och 25 kilodaltonsband efter reducering. Bindning av antikroppar mot inhemska proteiner i cellytan bekräftades också. Fluorescently märkt antikroppar var svans ven injiceras, i möss ympade med full R1 uttrycker tumörer.Djur levdes bild vid flera tidpunkter med hjälp av IVIS. datakonfirs selektiv anrikning av full R1 och BaCa antikroppar in i tumorsna. När du försöker detta protokoll, tänk på att höll underhåll av CHO-celler är avgörande för antikroppar avkastning.Och det är viktigt att ha en liknande grad av fluorescerande färgkonjugering för konkurrenskraftig tumör lokalisering. Efter denna procedur kan andra metoder såsom vävnad immunohistokemi och vävnad eller tumör specifika ELISA utföras för att stödja de levande möss imaging data.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Mål Cell före berikning och hela genomet förstärkning för enstaka Cell nedströms karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitala polymeras Chain Reaction Assay för den genetiska variationen i en sporadisk familjär adenomatös polypos Patient med formatet Chip-i-ett-rör

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ett tredimensionellt thymic kultur system för att generera murin inducerad pluripotenta stamcells härledda tumör antigen-specifika thymic emigranter

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro tumör Cell återinsättning för förutsägande utvärdering av chimära Antigen receptorn T Cell antitumöreffekt funktion

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo Immunofluorescenslokalisering för bedömning av terapeutisk och diagnostisk antikropps biodistribution i cancer forskning

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Analyzing Tumor Gene Expression Factors with the CorExplorer Web Portal

Analysera tumör gen uttrycks faktorer med CorExplorer webb Portal

Differential gene expression analysis is an important technique for understanding disease states. The machine learning algorithm CorEx has shown utility ...

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

Mätning i realtid läkemedelsrespons i organotypiska tumörvävnad skivor

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...