Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح من البرنامج الوطني للعلوم والتكنولوجيا المعدلة وراثيا (2019ZX08010-003 إلى Y.Z.) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31872637 إلى Y.Z.) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2019TC028 إلى Y.Z.) ، وNSF-IOS-1354434 ، NSF-IOS-1339185، وNIH-GM132582-01 إلى S.P.D.K.

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة على الأسلوب في الشكل 1.
1. إعداد المواد النباتية
<ol><li>تنمو N. بنثاميانا البذور في التربة الرطبة بكثافة عالية والحفاظ عليها في غرفة المناخ مع ضوء 16 ساعة (حوالي 75 ميكرومول / م2ث) و 8 ساعة فترة ضوئية مظلمة في 23-25 درجة مئوية.<...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

يتم إنشاء الرباط البيوتيد TurboID بواسطة الخميرة القائمة على عرض تطور توجيه BioID10. لديها العديد من المزايا على إنزيمات PL الأخرى. TurboID يسمح بتطبيق PL على أنظمة نموذج أخرى، بما في ذلك الذباب والديدان، ودرجة حرارة النمو الأمثل حوالي 25 درجة مئوية10. على الرغم من أن نهج PL قد ا?...

PPIs هي أساس العمليات الخلوية المختلفة. تشمل الطرق التقليدية لتحديد PPIs فحص الخميرة-اثنين الهجين (Y2H) وهطول الامطار المناعية إلى جانب قياس الطيف الكتلي (IP-MS)1. ومع ذلك، يعاني كلاهما من بعض العيوب. فعلى سبيل المثال، يتطلب فحص عام 2حاء توافر مكتبة Y2H للأنواع النباتية أو الحيوانية المستهدفة. إن بناء هذه المكتبات كثيف العمالة ومكلف. وعلاوة على ذلك، يتم تنفيذ نهج Y2H في خميرة الكائن الحي الأوكاريوتيكي أحادي الخلية غير المتجانسة، والتي قد لا تمثل الحالة الخلوية للخلايا الأوكاريوتيكية العليا.
وعلى النقيض من ذلك، فإن IP-MS يظهر كفاءة منخفضة في التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أو الضعيفة، كما أنه غير مناسب لتلك البروتينات ذات الوفرة المنخفضة أو الهيدروفوبية العالية. يتم التعبير عن العديد من البروتينات الهامة المشاركة في مسارات إشارات النبات مثل الكيناز الشبيهة بالمستقبل (RLKs) أو عائلة NLR من مستقبلات المناعة بمستويات منخفضة وغالباً ما تتفاعل مع البروتينات الأخرى بشكل عابر. ولذلك، فإنه يحد إلى حد كبير من فهم الآليات التي تقوم عليها تنظيم هذه البروتينات.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير طرق وضع العلامات القرب (PL) على أساس الايكوربات المهندسة peroxidase (APEX) ومتحولة Escherichia coli biotin الكولاي biraR118G (المعروفة باسم BioID) واستخدامها لدراسة PPIs2،3،4. مبدأ PL هو أن البروتين المستهدف من الفائدة تنصهر مع إنزيم، مما يحفز تشكيل labile biotinyl-AMP (الحيوي AMP). يتم تحرير هذه الحرة الحيوية AMP بواسطة إنزيمات PL وتنتشر إلى محيط البروتين المستهدف، مما يسمح للتفريط الحيوي من البروتينات القريبة في الأمينات الأولية ضمن دائرة نصف قطرها تقدر بـ 10 نانومتر5.
ولهذا النهج مزايا كبيرة على النهجالتقليدي لعام 2H وIP-MS، مثل القدرة على التقاط مؤشرات أسعار الصرف الأولي العابرة أو الضعيفة. وعلاوة على ذلك، يسمح PL وضع العلامات من البروتينات القريبة من البروتين المستهدف في بيئاتها الخلوية الأصلية. الإنزيمات PL مختلفة لها عيوب فريدة عند تطبيقها على أنظمة مختلفة. على سبيل المثال ، على الرغم من أن APEX يقدم حركية علامات أعلى مقارنة بـ BioID ويتم تطبيقه بنجاح في أنظمة الثدييات ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في هذا النهج يجعلها غير مناسبة لدراسات PL في النباتات.
في المقابل ، يتجنب PL المستند إلى BioID استخدام H2O2السام ، ولكن معدل وضع العلامات بطيء (يتطلب 18-24 ساعة لإكمال علم الخلايا الحيوية) ، مما يجعل التقاط مؤشرات أسعار الصفحات العابرة أقل كفاءة. وعلاوة على ذلك، فإن ارتفاع درجة حرارة الحضانة (37 درجة مئوية) اللازمة لكفاءة PL بواسطة BioID يدخل الإجهاد الخارجي لبعض الكائنات الحية، مثل النباتات4. لذلك ، تم الإبلاغ عن نشر محدود من PL المستندة إلى BioID في النباتات (أي نتوءات الأرز وArabidopsis و N. benthamiana) 6و7و8و9. الانزيم TurboID وصفها مؤخرا يتغلب على أوجه القصور من APEX وBioID القائم على PL. TurboID أظهرت نشاط عال يمكن من إنجاز PL في غضون 10 دقيقة في RT10. وقد تم تطبيق PL توربوID المستندة بنجاح في خلايا الثدييات والذباب والديدان10. في الآونة الأخيرة، ونحن وغيرها من مجموعات البحوث بشكل مستقل الأمثل وتوسيع نطاق استخدام PL توربودي المستندة لدراسة PPIs في أنظمة نباتية مختلفة، بما في ذلك N. بنتامانيا والنباتات Arabidopsis والطماطم جذور شعر11،12،13،14. أشارت التحليلات المقارنة إلى أن TurboID يؤدي أداء أفضل لPL في النباتات مقارنة بـ BioID11,14. كما أظهرت متانة PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال تحديد عدد من التفاعلات الجديدة مع مستقبلات المناعة NLR11, بروتين يصعب عادة الحصول على شركاء التفاعل باستخدام الطرق التقليدية.
يوضح هذا البروتوكول PL المستندة إلى TurboID في بلانتا من خلال وصف تحديد بروتينات التفاعل في مجال النقل البري الدولي N-terminal لمستقبلات المناعة NLR في نباتات N. benthamiana. ويمكن توسيع هذه الطريقة إلى أي بروتينات ذات أهمية في N. بنثاميانا. والأهم من ذلك، أنه يوفر مرجعا هاما للتحقيق PPIs في الأنواع النباتية الأخرى مثل العربيدوبسيسوالطماطم وغيرها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

تقنيات وضع العلامات القرب (PL) باستخدام هندسة أسكوربات بيروكسيديز (APEX) أو Escherichia coli biotin biotin ligase Bira (المعروفة باسم BioID) وقد استخدمت بنجاح لتحديد التفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) في خلايا الثدييات. ومع ذلك ، فإن متطلبات بيروكسيد الهيدروجين السام (H2O2)في PL المستندة إلى APEX ، ووقت الحضانة الأطول مع البيوتين (16-24 ساعة) ، ودرجة حرارة الحضانة الأعلى (37 درجة مئوية) في PL المستندة إلى BioID تحد بشدة من تطبيقاتها في النباتات. وPL التي وصفت مؤخرا TurboID المستندة إلى العديد من القيود من BioID وAPEX. يسمح TurboID بوضع علامات سريعة على قرب البروتينات في 10 دقيقة فقط تحت ظروف درجة حرارة الغرفة (RT). على الرغم من أن فائدة TurboID قد ثبت في النماذج الحيوانية، أظهرنا مؤخرا أن PL المستندة إلى TurboID يؤدي بشكل أفضل في النباتات مقارنة بـ BioID لوضع العلامات من البروتينات التي هي قريبة من البروتين من الفائدة. يقدم هنا بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد شركاء التفاعل البروتين باستخدام N-محطة تول / interleukin-1 مستقبلات المجال (TIR) من النيوكليوتيدات ملزمة leucine الغنية مكرر الأسرة (NLR) البروتين كنموذج. تصف الطريقة بناء النواقل ، والتسلل الزراعي لبنيات التعبير البروتينية ، وعلاج البيوتين ، واستخراج البروتين وإزالة الملح ، والكم ، وإثراء البروتينات المتناهية الحيوية عن طريق تنقية التقارب. ويمكن تكييف البروتوكول الموصوف هنا بسهولة لدراسة البروتينات الأخرى ذات الأهمية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.

البيانات التمثيلية، التي توضح النتائج المتوقعة استناداً إلى البروتوكول الموصوف، مقتبسة من تشانغ وآخرون11. يلخص الشكل 1 إجراءات تنفيذ PL المستندة إلى TurboID في N. benthamiana. ويبين الشكل 2 التعبير البروتين والحيوية tinylation في أوراق N. بنتامانيانا...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

وصفها هنا هو طريقة وضع العلامات القرب لتحديد شركاء التفاعل من مجال النقل البري الدولي من مستقبلات المناعة NLR في أنسجة أوراق نيكوتيانا بنتاميانا. كما يتم توفير بروتوكول مفصل لتحديد التفاعلات بين البروتينات الأخرى ذات الأهمية باستخدام هذه التقنية في نيكوتيانا والأنواع النباتية الأخرى.

TurboID القائم على القرب العلامات في تحديد بلانتا لشبكات التفاعل البروتين البروتين

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

مستقبلات المناعة NLR تلعب دورا حاسما في التوسط الدفاع النباتي ضد مسببات الأمراض المختلفة. نحن وصف القرب TurboID القائمة على طريقة وضع العلامات لتحديد التفاعل الشركاء من عدد / interleukin - 1 مستقبلات المجال التي تحتوي على NLRs مثل مستقبلات المناعة في النباتات بنثامايان Nicotiana. يوفر هذا البروتوكول مرجعا هاما للتحقيق في التفاعلات البروتين البروتيني في الأنواع النباتية الأخرى ويمكن أن تمتد إلى أي بروتين الفائدة في Nicotiana benthamiana.إن نهج وضع العلامات على القرب من TurboID له ميزة مميزة على النهج التقليدية لأنه يمكن استخدامه لالتقاط تفاعلات البروتين البروتينية العابرة أو الضعيفة في الجسم الحي. تبدأ من خلال زراعة بذور N.benthamiana في التربة الرطبة في كثافة عالية. الحفاظ عليها في غرفة المناخ مع ضوء 18 ساعة و8 ساعات فترة الصورة المظلمة في 23 إلى 25 درجة مئوية.إبقاء النباتات في الغرفة لمدة أربعة أسابيع تقريبا حتى أنها تنمو إلى مرحلة ورقة من أربعة إلى ثمانية للتصفية الزراعية اللاحقة. بناء الانصهار TurboID وتحويل البلازميدات إلى الخلايا المختصة Agrobacterium tumefaciens كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدام حقنة واحدة ملليلتر بدون إبرة للتسلل inoculum من البشرة abaxial من أوراق N.benthamiana ناضجة تماما.في 36 ساعة بعد الترشيح، التسلل 200 البيوتين ميكرومولار في الأوراق والحفاظ على النبات لمدة ثلاث إلى 12 ساعة إضافية قبل حصاد أنسجة ورقة. لجمع عينة ورقة، وقطع الأوراق المتسللة في قاعدة petiole، وإزالة الوريد ورقة، وفلاش تجميد الأنسجة في النيتروجين السائل. طحن الأنسجة ورقة مع الحشرات وقذائف الهاون وتخزين مسحوق في أنابيب فالكون 15 أو 50 ملليلتر في ناقص 80 درجة مئوية.لاستخراج البروتين الكلي، نقل حوالي 0.35 غرام من مسحوق ورقة إلى أنبوب ملليلتر اثنين. تأكد من الحفاظ على الأنسجة في درجة حرارة منخفضة في النيتروجين السائل خلال هذه العملية. إضافة 700 ميكرولترات من العازلة ريبا تحلل إلى مسحوق.دوامة الأنبوب لمدة 10 دقائق وترك العينة على الجليد لمدة 30 دقيقة، وخلط المحتويات كل أربع إلى خمس دقائق عن طريق عكس الأنابيب. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 20،000 مرات ز في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. ثم جمع ناظر.إزالة البيوتين الحرة عن طريق تشغيل العينة من خلال عمود desalting. إزالة السدادة في الجزء السفلي من العمود ووضعها في أنبوب 50 ملليلتر. ثم تخفيف الغطاء والطرد المركزي العمود في 1، 000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقتين.ضع عمود desalting في أنبوب 50 ملليلتر جديدة وتكف العمود ثلاث مرات مع خمسة ملليلتر من العازلة ريبا تحلل. جهاز طرد مركزي في 1،000 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة دقيقتين والتخلص من تدفق من خلال كل مرة. إضافة 1.5 ملليلتر من مستخلص البروتين إلى أعلى الراتنج في العمود توازنها.وعندما يدخل استخراج الراتنج، إضافة 100 ميكرولترات أخرى من العازلة تحلل RIPA. الطرد المركزي العمود لمدة دقيقتين وترك العينات desalted على الجليد حتى مزيد من الاستخدام. لتحديد كمي مستخلصات البروتين المُستخلصة من المياه، قم بقياس OD595 باستخدام مقياس طيفي Bio-Rad.رسم منحنى قياسي على أساس قيمة حل BSA التدرج وحساب تركيز عينات البروتين desalteded. اكويبيرت streptavidin C1 الخرز المغناطيسي مترافق مع ملليلتر واحد من العازلة ريبا تحلل لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدام رف المغناطيسي لامتصاص الخرز لمدة ثلاث دقائق وتبخر بلطف الحل.ثم كرر غسل مرة أخرى. نقل استخراج البروتين إلى الخرز المغناطيسي توازنها واحتضان الأنبوب في أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها على دوار لتقارب تنقية البروتينات. في اليوم التالي، التقاط الخرز مع رف المغناطيسي وpirate اضحا.المقبل، وغسل الخرز مع 1.7 ملليلتر من غسل العازلة واحدة عن طريق إضافته إلى أنبوب واحتضان على الدوار لمدة ثماني دقائق. إزالة supernatant كما هو موضح سابقا وكرر غسل مع 1.7 ملليلتر من العازلة غسل اثنين وغسل العازلة ثلاثة. إضافة 1.7 ملليلتر من 50 ملليمولار تريس HCL لإزالة المنظفات.ثم ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي وأزل المابير. كرر الغسيل مع ملليلتر واحد من 50 ملليمولار تريس HCL ونقل الخرز إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر. وأخيرا، يغسل الخرز ست مرات مع 50 ميليمولار بيكربونات العازلة لمدة خمس دقائق لكل غسل.استخدام 100 ميكرولترات من الخرز لتحليل مناعية لتأكيد إثراء البروتينات الحيوية وتجميد فلاش بقية العينة ليتم تخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. استخدمت البقع الغربية لتحليل التعبير البروتيني و biotinylation في أوراق N.benthamiana الزراعية. تم إثراء البروتينات الحيوية في الأوراق المتسللة بكفاءة مع الخرز المغناطيسي Streptavidin C1 المقترنة لتحليل الطيف الشامل اللاحقة.تم التقاط بروتينات مختلفة بأحجام متنوعة وأظهر تحليل البقعة الغربية للبروتينات المخصبة نطاقات ملطخة. عند محاولة هذا الإجراء، يرجى تذكر لإزالة السدادة في الجزء السفلي من العمود desalting وتخفيف القبعات قبل كل الطرد المركزي. هذا البروتوكول هو قابل للتكيف بسهولة مع غيرها من البروتينات ذات الأهمية في Nicotiana benthamiana ويمكن أيضا أن تستخدم لتوسيع PL TurboID في الأنواع النباتية الأخرى.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

الجسيمات أسلوب التلصيق لتحديد فيروس شلل الأطفال

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

A طريقة لوصفها الأوعية الدموية في الفئران الجنينية

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

A المنهج المقارن لتوصيف المشهد من المضيف الممرض البروتين البروتين التفاعلات

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

فحوصات لتحديد رواية الأدوية المضادة للفيروسات ضد فيروس اللسان الأزرق

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

تحديد تسلسل التعريب بلاسموديسمال في البروتينات في بﻻنتا

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

تحديد "علامات الفوعة" بكتريا أبسسيسوس "النسخ المتماثل داخل الخلايا" في البالعات

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...