Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 til Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 til Y.Z.), og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 til Y.Z.), og NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 og NIH-GM132582-01 til S.P.D.K.

BEMÆRK: En oversigt over metoden er vist i figur 1.
1. Fremstilling af plantemateriale
<ol><li>Grow N. benthamiana frø i våd jord ved en høj tæthed og vedligeholde dem i et klimakammer med en 16 h lys (ca. 75 μmol/m2s) og 8 h mørkt fotoperiode ved 23-25 °C.</li>
	<li>Omkring 1 uge senere, omhyggeligt overføre hver ung sætteplante til 4 'x 4' potter og holde planter i samme kammer.</li>
	<li>Vedligehold planterne i kamme...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

TurboID biotin ligase genereres af gær display-baseret rettet udvikling af BioID10. Det har mange fordele i forhold til andre PL enzymer. TurboID tillader anvendelse af PL til andre modelsystemer, herunder fluer og orme, hvis optimale væksttemperatur er omkring 25 °C10. Selv om PL-metoden har været udbredt i dyresystemer, er dens anvendelse i planter begrænset. Den protokol, der er beskrevet her, giver en trinvis procedure for oprettelse af TurboID-baserede PL i N....

PPI er grundlaget for forskellige cellulære processer. Traditionelle metoder til identifikation af PPI omfatter gær-to-hybrid (Y2H) screening og immunudfældning kombineret med massespektrometri (IP-MS)1. Men begge lider under nogle ulemper. For eksempel kræver Y2H screening tilgængeligheden af Y2H bibliotek af målet plante eller dyrearter. Opførelsen af disse biblioteker er arbejdskrævende og dyrt. Desuden udføres Y2H-metoden i den heterologe eukaryote organismegær med en enkelt celle, som muligvis ikke repræsenterer den cellulære status for højere eukaryote celler.
I modsætning hertil viser IP-MS lav effektivitet i indfangning af forbigående eller svage PPI, og det er også uegnet til de proteiner med lav overflod eller høj hydrofobitet. Mange vigtige proteiner involveret i planten signalering veje såsom receptor-lignende kinaser (RLKs) eller NLR familie af immunreceptorer udtrykkes på lave niveauer og ofte interagere med andre proteiner forbigående. Derfor begrænser det i høj grad forståelsen af mekanismer, der ligger til grund for reguleringen af disse proteiner.
For nylig, nærhed mærkning (PL) metoder baseret på manipuleret ascorbat peroxidase (APEX) og en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (kendt som BioID) er blevet udviklet og udnyttet til studiet af PPI2,3,4. Princippet i PL er, at et målprotein af interesse er sammensmeltet med et enzym, som katalyserer dannelsen af labilbiotinyl-AMP (bio-AMP). Disse frie bio-AMP frigives af PL enzymer og diffuse til nærheden af målet protein, så biotinylation af proksimale proteiner på de primære aminer inden for en anslået radius på 10 nm5.
Denne tilgang har betydelige fordele i forhold til de traditionelle Y2H- og IP-MS-tilgange, såsom evnen til at fange forbigående eller svage PPI. Desuden tillader PL mærkning af proksimale proteiner af målproteinet i deres oprindelige cellulære miljøer. Forskellige PL enzymer har unikke ulemper, når de anvender dem til forskellige systemer. Selv om APEX tilbyder højere tagging kinetik sammenlignet med BioID og anvendes med succes i pattedyrsystemer, gør kravet om giftig hydrogenperoxid (H2O2)i denne metode det uegnet til PL-undersøgelser i planter.
I modsætning hertil undgår BioID-baseret PL brugen af den giftige H2O2, men mærkningshastigheden er langsom (kræver 18-24 h for at fuldføre biotinylation), hvilket gør indfangningen af forbigående PPI mindre effektiv. Desuden medfører den højere inkubationstemperatur (37 °C), der kræves for effektiv PL ved BioID, ekstern stress for nogle organismer, såsom planter4. Der er derfor rapporteret om begrænset udbredelse af BioID-baseret PL i planter (dvs. risprotoplasts, Arabidopsis og N. benthamiana) 6,7,8,9. Den nyligt beskrevne TurboID enzym overvinder manglerne ved APEX og BioID-baserede PL. TurboID viste høj aktivitet, der gør det muligt at realiseringen af PL inden for 10 min på RT10. TurboID-baserede PL er blevet anvendt med succes i pattedyr celler, fluer, og orme10. For nylig har vi og andre forskningsgrupper uafhængigt optimeret og udvidet brugen af TurboID-baserede PL til at studere PPI i forskellige plantesystemer, herunder N. benthamiana og Arabidopsis planter og tomat behårede rødder11,,12,13,14. Sammenlignende analyser viste , at TurboID klarer sig bedre for PL i planter sammenlignet med BioID11,14. Det har også vist robustheden af TurboID-baseret PL i planta ved at identificere en række nye interaktioner med en NLR immunreceptor11, et protein, hvis interaktionspartnere normalt er vanskelige at opnå ved hjælp af traditionelle metoder.
Denne protokol illustrerer det TurboID-baserede PL i planta ved at beskrive identifikationen af interaktionsproteiner i NLR-immunreceptorens N-terminal-tir-domæne i N. benthamianaplanter. Metoden kan udvides til at omfatte proteiner af interesse i N. benthamiana. Endnu vigtigere, det giver en vigtig reference til at undersøge PPI i andre plantearter såsom Arabidopsis, tomat, og andre.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Nærhedsmærkningsteknikker (PL) ved hjælp af manipuleret ascorbatperoxidase (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (kendt som BioID) er med succes blevet anvendt til identifikation af proteinproteininteraktioner (PPI) i pattedyrceller. Kravene til giftig hydrogenperoxid (H2O2) i APEX-baseret PL, længere inkubationstid med biotin (16-24 timer) og højere inkubationstemperatur (37 °C) i BioID-baseret PL begrænser imidlertid i alvorlig grad deres anvendelse i planter. Den nyligt beskrevne TurboID-baserede PL adresser mange begrænsninger af BioID og APEX. TurboID giver mulighed for hurtig nærhed mærkning af proteiner på bare 10 min under stuetemperatur (RT) betingelser. Selv om nytten af TurboID er blevet påvist i dyremodeller, vi for nylig viste, at TurboID-baserede PL klarer sig bedre i planter i forhold til BioID for mærkning af proteiner, der er proksimale til et protein af interesse. Forudsat her er en trin-for-trin protokol til identifikation af protein interaktion partnere ved hjælp af N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domæne af nukleotid-bindende leucin-rige gentage (NLR) protein familie som model. Metoden beskriver vektorkonstruktion, agroinfiltration af proteinekspressionskonstruktioner, biotinbehandling, proteinekstraktion og afsaltning, kvantificering og berigelse af de biotinyterede proteiner ved affinitetsrensning. Den protokol, der er beskrevet her, kan let tilpasses til at studere andre proteiner af interesse i Nicotiana og andre plantearter.

De repræsentative data, som illustrerer de forventede resultater baseret på den beskrevne protokol, er tilpasset fra Zhang et al11. Figur 1 opsummerer procedurerne for udførelse af TurboID-baseret PL i N. benthamiana. Figur 2 viser proteinekspressionen og biotinylationen i de infiltrerede N. benthamianablade. Figur 3 viser, at de biotinylatere proteiner i de infiltrerede blade effektivt b...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Beskrevet her er en nærhed mærkning metode til identifikation af interaktion partnere tir domæne NLR immunreceptoren i Nicotiana benthamiana bladvæv. Der findes også en detaljeret protokol til identifikation af interaktioner mellem andre proteiner af interesse ved hjælp af denne teknik i Nicotiana og andre plantearter.

TurboID-baseret nærhed mærkning for I Planta Identifikation af Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR immune receptorer spiller en afgørende rolle i mægle plante forsvar mod forskellige patogener. Vi beskriver en TurboID-baseret nærhed mærkning metode til identifikation af interaktion partnere Toll / interleukin-1 receptor domæne, der indeholder NLRs såsom immun receptorer i Nicotiana benthamiana planter. Denne protokol giver en vigtig reference til undersøgelse af proteinproteininteraktioner i andre plantearter, og den kan udvides til at omfatte ethvert protein af interesse i Nicotiana benthamiana.TurboID-baserede nærhed mærkning tilgang har en klar fordel i forhold til de traditionelle tilgange, fordi det kan bruges til at fange forbigående eller svage protein-protein interaktioner in vivo. Start med at dyrke N.benthamiana frø i våd jord ved en høj tæthed. Vedligehold dem i et klimakammer med en 18-timers lys og otte timers mørk fotoperiode ved 23 til 25 grader Celsius.Hold planterne i kammeret i omkring fire uger, indtil de vokser til et blad fase af fire til otte for efterfølgende agroinfiltration. Konstruere TurboID fusioner og omdanne plasmider i Agrobacterium tumefaciens kompetente celler som beskrevet i tekstprotokollen. Brug en en milliliter nåleløs sprøjte til at infiltrere inokulum af abaxial epidermis af de fuldt modne N.benthamiana blade.På 36 timer efter filtrering, infiltrere 200 mikromolar biotin i bladene og vedligeholde planten i yderligere tre til 12 timer før høst bladvævet. For at indsamle bladprøven skal du skære de infiltrerede blade i bunden af stilken, fjerne bladvenen og blinke vævet i flydende nitrogen. Grind bladvævet med en støder og mørtel og opbevar pulveret i 15 eller 50 milliliter Falcon rør ved minus 80 grader Celsius.For at udtrække det samlede protein, overføre omkring 0,35 gram blad pulver til en to milliliter rør. Sørg for at opretholde vævet ved lav temperatur i det flydende kvælstof under denne proces. Tilsæt 700 mikroliter RIPA lysis buffer til pulveret.Vortex røret i 10 minutter og lad prøven på is i 30 minutter, blande indholdet hver fire til fem minutter ved at vende rørene. Centrifuge rørene ved 20, 000 gange g ved fire grader Celsius i 10 minutter. Derefter indsamle supernatant.Den frie biotin fjernes ved at køre prøven gennem en afsaltningskolonne. Fjern forseglingen i bunden af kolonnen og læg den i et 50 milliliterrør. Løsn derefter hætten og centrifuge kolonnen ved 1, 000 gange g og fire grader Celsius i to minutter.Afsaltningssøjlen anbringes i et friskt 50 milliliterrør, og kolonnen ligevægtes tre gange med fem milliliter RIPA lysis-buffer. Centrifuge det ved 1, 000 gange g og fire grader Celsius i to minutter og kassér flow-through hver gang. Der tilsættes 1,5 milliliter proteinekstrakt til toppen af harpiksen i den ligevægtede kolonne.Og når ekstraktet kommer ind i harpiksen, tilføjes yderligere 100 mikroliter RIPA lysis buffer. Centrifuge kolonnen i to minutter og lad de afsaltede prøver blive på is indtil videre. For at kvantificere de afsaltede proteinekstrakter måles OD595 ved hjælp af et Bio-Rad spektrofotometer.Tegn standardkurven baseret på værdien af gradient BSA-opløsningen, og udregn koncentrationen af de afsaltede proteinprøver. Ligevægt af streptavidin C1 konjugerede magnetiske perler med en milliliter RIPA lysis buffer i et minut ved stuetemperatur. Brug den magnetiske rist til at absorbere perlerne i tre minutter og forsigtigt aspirere opløsningen.Gentag derefter vasken en gang til. Overfør proteinekstraktet til de ligevægtede magnetiske perler og inkuber røret ved fire grader Celsius natten over på en rotator for at rense proteinerne. På den næste dag, fange perlerne med en magnetisk rack og aspirere supernatant.Dernæst vaskes perlerne med 1,7 milliliter vaskebuffer en ved at tilføje den til røret og inkubere det på rotoren i otte minutter. Supernatanten fjernes som tidligere beskrevet, og vasken gentages med 1,7 ml vaskepude to og vaskepudebuffer tre. Der tilsættes 1,7 milliliter 50 millimolar Tris HCL for at fjerne vaskemidlet.Placer derefter røret på den magnetiske rist og fjern supernatanten. Vasken gentages med en milliliter 50 millimolar Tris HCL, og perlerne overføres til et nyt 1,5 milliliterrør. Endelig vaskes perlerne seks gange med 50 millimolar ammoniumbikarbonatbuffer i fem minutter pr. vask.Brug 100 mikroliter perler til immunoblotanalyse for at bekræfte berigelsen af de biotinylaterede proteiner og flashfryse resten af prøven, der skal opbevares ved minus 80 grader Celsius. Vestlige blots blev brugt til at analysere protein udtryk og biotinylation i agroinfiltrated N.benthamiana blade. De biotinylede proteiner i de infiltrerede blade blev effektivt beriget med streptavidin C1 konjugerede magnetiske perler til efterfølgende massespektrometrianalyse.Forskellige proteiner med forskellige størrelser blev fanget og western blot analyse af de berigede proteiner viste smurt bands. Når du forsøger denne procedure, skal du huske at fjerne forseglingen i bunden af afsaltningskolonnen og løsne hætterne før hver centrifugering. Denne protokol er let at tilpasse til andre proteiner af interesse i Nicotiana benthamiana og kan også bruges til at udvide TurboID PL i andre plantearter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

En komparativ tilgang til at karakterisere Landskab værtspatogene protein-protein interaktioner

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Assays til identifikation af nye Antivirale mod bluetonguevirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikation af Gram-negative bakterier fra Blood kulturvæsken Brug MALDI-TOF-massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identifikation af Plasmodesmal lokalisering sekvenser i proteiner i Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikation af virulens markører af Mycobacterium abscessus intracellulære replikering i fagocytter

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...