Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 tot Y.Z.), de National Natural Science Foundation of China (31872637 aan Y.Z.), en de Fundamental Research Funds voor de Centrale Universiteiten (2019TC028 aan Y.Z.), en NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 en NIH-GM132582-01 naar S.P.D.K.

LET OP: Een overzicht van de methode wordt weergegeven in figuur 1.
1. Materiaalbereiding van planten
<ol><li>Kweek N. benthamiana zaden in natte grond met een hoge dichtheid en bewaar ze in een klimaatkamer met een 16 uur licht (ongeveer 75 μmol/m2s) en 8 uur donkere fotoperiode bij 23-25 °C.</li>
	<li>Ongeveer 1 week later, zorgvuldig overbrengen van elke jonge zaailing tot 4 'x 4' potten en houd de zaailingen in dezelfde kam...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

De TurboID biotine ligase wordt gegenereerd door gist display-gebaseerde gerichte evolutie van de BioID10. Het heeft vele voordelen ten opzichte van andere PL enzymen. TurboID maakt de toepassing van PL op andere modelsystemen mogelijk, waaronder vliegen en wormen, waarvan de optimale groeitemperatuur ongeveer 25 °C10ligt. Hoewel de PL-aanpak op grote schaal is gebruikt in dierlijke systemen, is de toepassing ervan in planten beperkt. Het protocol dat hier wordt beschreven...

PPR's vormen de basis van verschillende cellulaire processen. Traditionele methoden voor het identificeren van PPR's omvatten gist-twee-hybride (Y2H) screening en immunoneerslag in combinatie met massaspectrometrie (IP-MS)1. Echter, beide lijden aan een aantal nadelen. Y2H-screening vereist bijvoorbeeld de beschikbaarheid van de Y2H-bibliotheek van de doelplanten- of diersoorten. De bouw van deze bibliotheken is arbeidsintensief en duur. Bovendien wordt de Y2H-benadering uitgevoerd in de heterologe eencellige eukaryotische organismengist, die mogelijk niet de cellulaire status van hogere eukaryotische cellen vertegenwoordigt.
Ip-MS laat daarentegen een lage efficiëntie zien bij het vastleggen van voorbijgaande of zwakke PPR's, en het is ook ongeschikt voor eiwitten met een lage overvloed of hoge hydrofobie. Veel belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij de plant signalering trajecten zoals receptor-achtige kinases (RLKs) of de NLR familie van immuunreceptoren worden uitgedrukt op lage niveaus en vaak interageren met andere eiwitten tijdelijk. Daarom beperkt het sterk het begrip van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulering van deze eiwitten.
Onlangs zijn proximity labeling (PL) methoden op basis van engineered ascorbate peroxidase (APEX) en een mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekend als BioID) ontwikkeld en gebruikt voor de studie van PPR's2,3,4. Het principe van PL is dat een doeleiwit van belang wordt gefuseerd met een enzym, dat de vorming van labiel biotinyl-AMP (bio-AMP) katalyseert. Deze vrije bio-AMP worden vrijgegeven door PL enzymen en diffuus naar de nabijheid van het doeleiwit, waardoor de biotinylation van proximale eiwitten op de primaire amines binnen een geschatte straal van 10 nm5.
Deze aanpak heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van de traditionele Y2H- en IP-MS-benaderingen, zoals de mogelijkheid om voorbijgaande of zwakke PPR's vast te leggen. Bovendien maakt PL het labelen van proximale eiwitten van het doeleiwit in hun eigen cellulaire omgevingen mogelijk. Verschillende PL enzymen hebben unieke nadelen bij het toepassen van hen op verschillende systemen. Hoewel APEX bijvoorbeeld hogere tagging kinetiek biedt in vergelijking met BioID en met succes wordt toegepast in zoogdiersystemen, maakt de eis van toxische waterstofperoxide (H2O2)in deze aanpak het ongeschikt voor PL-studies in planten.
BioID-gebaseerde PL vermijdt daarentegen het gebruik van de toxische H2O2, maar de etiketteringssnelheid is traag (waarbij 18-24 uur nodig is om biotinylation te voltooien), waardoor het vangen van voorbijgaande PPR's minder efficiënt wordt. Bovendien introduceert de hogere incubatietemperatuur (37 °C) die nodig is voor een efficiënte PL van BioID externe stress voor sommige organismen, zoals planten4. Daarom is een beperkte inzet van op BioID gebaseerde PL in planten (d.w.z. rijstprotoplasten, Arabidopsis en N. benthamiana) gemeld6,7,8,9. De onlangs beschreven TurboID enzym overwint de tekortkomingen van APEX en BioID-gebaseerde PL. TurboID toonde een hoge activiteit die de verwezenlijking van PL binnen 10 min op RT10mogelijk maakt. TurboID-gebaseerde PL is met succes toegepast in zoogdiercellen, vliegen en wormen10. Onlangs hebben wij en andere onderzoeksgroepen onafhankelijk geoptimaliseerd en uitgebreid het gebruik van TurboID-gebaseerde PL voor het bestuderen van PPR's in verschillende plantaardige systemen, waaronder N. benthamiana en Arabidopsis planten en tomatenharige wortels11,12,13,14. Vergelijkende analyses wezen uit dat TurboID beter presteert voor PL in fabrieken in vergelijking met BioID11,14. Het heeft ook aangetoond dat de robuustheid van TurboID-gebaseerde PL in planta door het identificeren van een aantal nieuwe interacties met een NLR immuunreceptor11, een eiwit waarvan de interactie partners zijn meestal moeilijk te verkrijgen met behulp van traditionele methoden.
Dit protocol illustreert de op TurboID gebaseerde PL in planta door de identificatie van interactie-eiwitten van het N-terminal TIR-domein van de NLR-immuunreceptor in N. benthamiana-planten te beschrijven. De methode kan worden uitgebreid tot alle eiwitten die van belang zijn in N. benthamiana. Wat nog belangrijker is, het verstrekt een belangrijke verwijzing voor het onderzoeken van PPR's in andere installatiesoorten zoals Arabidopsis,tomaat, en anderen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Proximity labeling (PL) technieken met behulp van engineered ascorbate peroxidase (APEX) of Escherichia coli biotine ligase BirA (bekend als BioID) zijn met succes gebruikt voor de identificatie van eiwit-eiwit interacties (PPR's) in zoogdiercellen. De eisen aan toxische waterstofperoxide (H2O2)in PL op basis van APEX, langere incubatietijd met biotine (16-24 uur) en een hogere incubatietemperatuur (37 °C) in PL op basis van bio-ID beperken hun toepassingen in planten ernstig. De onlangs beschreven TurboID-gebaseerde PL adressen vele beperkingen van BioID en APEX. TurboID maakt snelle nabijheid etikettering van eiwitten in slechts 10 min onder kamertemperatuur (RT) voorwaarden. Hoewel het nut van TurboID is aangetoond in diermodellen, hebben we onlangs aangetoond dat TurboID-gebaseerde PL beter presteert in planten in vergelijking met BioID voor het labelen van eiwitten die proximaal zijn voor een eiwit van belang. Hier is een stapsgewijs protocol voor de identificatie van eiwitinteractiepartners met behulp van het N-terminal Toll/interleukin-1 receptor (TIR) domein van de nucleotide-bindende leucine-rich repeat (NLR) eiwitfamilie als model. De methode beschrijft vectorbouw, agroinfiltratie van eiwitexpressieconstructies, biotinebehandeling, eiwitextractie en ontzouten, kwantificering en verrijking van de bioateulaateiwitten door affiniteitszuivering. Het hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere eiwitten die van belang zijn voor Nicotiana en andere plantensoorten te bestuderen.

De representatieve gegevens, die de verwachte resultaten op basis van het beschreven protocol illustreren, zijn aangepast van Zhang etal. 11. Figuur 1 vat de procedures voor het uitvoeren van TurboID-gebaseerde PL in N. benthamiana. Figuur 2 toont de eiwitexpressie en biotinylation in de geïnfiltreerd N. benthamiana bladeren. Figuur 3 toont aan dat de bioatlateeiwitten in de geïnfiltreerd ...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Hier beschreven is een nabijheid etikettering methode voor de identificatie van interactie partners van de TIR domein van de NLR immuunreceptor in Nicotiana benthamiana bladweefsel. Ook is een gedetailleerd protocol voor de identificatie van interacties tussen andere eiwitten van belang met behulp van deze techniek in Nicotiana en andere plantensoorten.

TurboID-Based Proximity Labeling voor in Planta Identificatie van Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR immuunreceptoren spelen een cruciale rol bij het bemiddelen van plantenverdediging tegen verschillende ziekteverwekkers. We beschrijven een TurboID-gebaseerde nabijheidslabelmethode voor de identificatie van interactiepartners van Toll/interleukine-1 receptordomein met NLR's zoals immuunreceptoren in Nicotiana benthamiana planten. Dit protocol biedt een belangrijke referentie voor het onderzoeken van eiwit-eiwit interacties in andere plantensoorten en het kan worden uitgebreid tot elk eiwit van belang in Nicotiana benthamiana.De turboid-gebaseerde nabijheidsetiketteringsbenadering heeft een duidelijk voordeel ten opzichte van de traditionele benaderingen, omdat het kan worden gebruikt om tijdelijke of zwakke eiwit-eiwitinteracties in vivo vast te leggen. Begin met het kweken van N.benthamiana zaden in natte grond bij een hoge dichtheid. Onderhoud ze in een klimaatkamer met een 18-uurs licht en acht uur durende donkere fotoperiode op 23 tot 25 graden Celsius.Houd de planten in de kamer voor ongeveer vier weken totdat ze groeien tot een blad stadium van vier tot acht voor de daaropvolgende agro-infiltratie. Bouw TurboID fusies en zet de plasmiden om in Agrobacterium tumefaciens competente cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Gebruik een een milliliter naaldloze spuit om het entmateriaal van de abaxiale opperhuid van de volledig volwassen N.benthamiana bladeren te infiltreren.Na 36 uur na filtratie infiltreer je 200 micromolar biotine in de bladeren en onderhoud je de plant nog eens drie tot twaalf uur voordat je het bladweefsel oogst. Om het bladmonster te verzamelen, snijd de geïnfiltreerde bladeren aan de basis van de petiole, verwijder de bladader en flash bevriezen het weefsel in vloeibare stikstof. Maal het bladweefsel met een stamper en mortel en bewaar het poeder in 15 of 50 milliliter Falcon buizen op min 80 graden Celsius.Om het totale eiwit te extraheren, breng ongeveer 0,35 gram bladpoeder over naar een twee milliliter buis. Zorg ervoor dat u het weefsel op lage temperatuur in de vloeibare stikstof tijdens dit proces te handhaven. Voeg 700 microliter RIPA lyse buffer toe aan het poeder.Vortex de buis gedurende 10 minuten en laat het monster op ijs gedurende 30 minuten, het mengen van de inhoud om de vier tot vijf minuten door het omkeren van de buizen. Centrifugeren de buizen op 20.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verzamel dan de supernatant.Verwijder de vrije biotine door het monster door een ontziltingskolom te laten lopen. Verwijder de sealer aan de onderkant van de kolom en plaats deze in een buis van 50 milliliter. Maak vervolgens de dop los en vercentrifuge de kolom op 1,000 keer g en vier graden Celsius gedurende twee minuten.Plaats de desalting kolom in een verse 50 milliliter buis en equilibrate de kolom drie keer met vijf milliliter RIPA lyse buffer. Centrifuge het op 1.000 keer g en vier graden Celsius gedurende twee minuten en gooi de flow-through elke keer. Voeg 1,5 milliliter eiwitextract toe aan de bovenkant van de hars in de geëquilibreerde kolom.En wanneer het extract in de hars komt, voeg nog eens 100 microliters ripa lyse buffer. Centrifugeren de kolom gedurende twee minuten en laat de ontzilte monsters op ijs tot verder gebruik. Om de gedesalted eiwitextracten te kwantificeren, meet de OD595 met behulp van een Bio-Rad spectrofotometer.Teken de standaardcurve op basis van de waarde van de gradiënt BSA-oplossing en bereken de concentratie van de gedesalted eiwitmonsters. Equilibrate de streptavidin C1 geconjugeerde magnetische kralen met een milliliter RIPA lyse buffer voor een minuut bij kamertemperatuur. Gebruik het magnetische rek om de kralen gedurende drie minuten te absorberen en de oplossing voorzichtig aan te trekken.Herhaal dan de was nog een keer. Breng het eiwitextract over naar de geëquilibreerde magnetische kralen en broed de buis 's nachts bij vier graden Celsius op een rotator om de eiwitten te zuiveren. Op de volgende dag, vangen de kralen met een magnetisch rek en aspirate de supernatant.Was vervolgens de kralen met 1,7 milliliter wasbuffer een door het toe te voegen aan de buis en uitbroeden op de rotor gedurende acht minuten. Verwijder de supernatant zoals eerder beschreven en herhaal de was met 1,7 milliliter wasbuffer twee en was buffer drie. Voeg 1,7 milliliter 50 millimolar Tris HCL toe om het wasmiddel te verwijderen.Plaats vervolgens de buis op het magnetische rek en verwijder de supernatant. Herhaal de was met een milliliter van 50 millimolar Tris HCL en breng de kralen over naar een nieuwe 1,5 milliliter buis. Tot slot, was de kralen zes keer met 50 millimolar ammonium bicarbonaat buffer gedurende vijf minuten per wasbeurt.Gebruik 100 microliter kralen voor immunoblot-analyse om de verrijking van de biotinyleerde eiwitten te bevestigen en de rest van het monster te bevriezen om bij min 80 graden Celsius te worden opgeslagen. Westerse vlekken werden gebruikt om eiwitexpressie en biotinylation te analyseren in de agroinfiltrrated N.benthamiana bladeren. De gebiotinyleerde eiwitten in de geïnfiltreerde bladeren werden efficiënt verrijkt met streptavidin C1 geconjugeerde magnetische kralen voor latere massaspectrometrieanalyse.Verschillende eiwitten met verschillende maten werden gevangen en westerse vlekanalyse van de verrijkte eiwitten toonde besmeurde banden. Bij het proberen van deze procedure, vergeet dan niet om de sealer te verwijderen aan de onderkant van desalting kolom en los de doppen voor elke centrifugatie. Dit protocol is gemakkelijk aan te passen aan andere eiwitten van belang in Nicotiana benthamiana en kan ook worden gebruikt om de TurboID PL uit te breiden in andere plantensoorten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Particle Agglutinatie Methode voor Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snelle identificatie van Gram-negatieve bacteriën van Blood Culture Bouillon Met behulp van MALDI-TOF massaspectrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identificatie van Plasmodesmal lokalisatie sequenties in eiwitten In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...