Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national de science et de technologie transgéniques (2019ZX08010-003 à Y.Z.), de la National Natural Science Foundation of China (31872637 à Y.Z.), et des Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (2019TC028 à Y.Z.), et du NSF-IOS-1354444444444444444444444444 NSF-IOS-1339185, et NIH-GM132582-01 à S.P.D.K.

REMARQUE : Une vue d’ensemble de la méthode est indiquée à la figure 1.
1. Préparation des matériaux végétaux
<ol><li>Cultivez les graines de N. benthamiana dans un sol humide à haute densité et maintenez-les dans une chambre climatique avec une lumière de 16 h (environ 75 'mol/m2s) et 8 h photoperiod foncé à 23-25 'C.</li>
	<li>Environ 1 semaine plus tard, transférer soigneusement chaque jeune semis à 4' x 4' pot...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

Le ligase biotin TurboID est généré par l’évolution dirigée basée sur l’affichage de levure du BioID10. Il a de nombreux avantages par rapport à d’autres enzymes PL. TurboID permet l’application de PL à d’autres systèmes modèles, y compris les mouches et les vers, dont la température de croissance optimale est d’environ 25 oC10. Bien que l’approche PL ait été largement utilisée dans les systèmes animaux, son application dans les plantes est limi...

Les IPP sont à la base de divers processus cellulaires. Les méthodes traditionnelles d’identification des IPP comprennent le dépistage et l’immunoprécipitation de levure-deux hybrides (Y2H) couplés à la spectrométrie de masse (IP-MS)1. Cependant, les deux souffrent de certains inconvénients. Par exemple, le dépistage de L2H nécessite la disponibilité de la bibliothèque Y2H des espèces végétales ou animales cibles. La construction de ces bibliothèques est exigeante en main-d’œuvre et coûteuse. En outre, l’approche Y2H est effectuée dans la levure hétérologique d’organisme eucaryote à cellule unique, qui peut ne pas représenter le statut cellulaire des cellules eucaryotes supérieures.
En revanche, l’IP-MS montre une faible efficacité dans la capture des IPP transitoires ou faibles, et elle n’est pas adaptée aux protéines à faible abondance ou à haute hydrophobicité. De nombreuses protéines importantes impliquées dans les voies de signalisation végétale telles que les kinases récepteurs (RLKs) ou la famille NLR des récepteurs immunitaires sont exprimées à de faibles niveaux et interagissent souvent avec d’autres protéines de façon transitoire. Par conséquent, il restreint considérablement la compréhension des mécanismes sous-jacents à la régulation de ces protéines.
Récemment, des méthodes d’étiquetage de proximité (PL) basées sur l’ascorbate peroxidase (APEX) et un mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (connu sous le nom de BioID) ont été développées et utilisées pour l’étude des IPP2,3,4. Le principe de PL est qu’une protéine cible d’intérêt est fusionnée avec une enzyme, qui catalyse la formation de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Ces bio-AMP gratuits sont libérés par les enzymes PL et diffusent à proximité de la protéine cible, permettant la biotinylation des protéines proximales aux amines primaires dans un rayon estimé de 10 nm5.
Cette approche présente des avantages significatifs par rapport aux approches traditionnelles du Y2H et de la SPP, comme la capacité de saisir les IPP transitoires ou faibles. En outre, PL permet l’étiquetage des protéines proximales de la protéine cible dans leurs environnements cellulaires indigènes. Différentes enzymes PL ont des inconvénients uniques lors de leur application à différents systèmes. Par exemple, bien que l’APEX offre une cinétique de marquage plus élevée par rapport à BioID et est appliquée avec succès dans les systèmes de mammifères, l’exigence de peroxyde d’hydrogène toxique (H2O2) dans cette approche le rend impropre aux études de PL dans les plantes.
En revanche, le PL basé sur BioID évite l’utilisation du H2O2toxique, mais le taux d’étiquetage est lent (nécessitant 18-24 h pour compléter la biotinylation), ce qui rend la capture des IPP transitoires moins efficace. En outre, la température d’incubation plus élevée (37 oC) requise pour l’efficacité du PL par BioID introduit un stress externe à certains organismes, tels que les plantes4. Par conséquent, le déploiement limité de PL à base de BioID dans les plantes (c.-à-d. les protoplastes de riz, Arabidopsis et N. benthamiana) a été signalé6,7,8,9. L’enzyme TurboID récemment décrite surmonte les carences de l’APEX et bioID-basé PL. TurboID a montré une forte activité qui permet l’accomplissement de PL dans les 10 minutes à RT10. Le PL à base de TurboID a été appliqué avec succès dans les cellules de mammifères, les mouches et les vers10. Récemment, nous et d’autres groupes de recherche indépendamment optimisé et étendu l’utilisation de TurboID-basé PL pour étudier les IPP dans différents systèmes végétaux, y compris N. benthamiana et Arabidopsis plantes et les racines poilues tomate11,12,13,14. Des analyses comparatives ont indiqué que TurboID obtient de meilleurs résultats pour le PL dans les usines par rapport à BioID11,14. Il a également démontré la robustesse de TURBOID-basé PL dans planta en identifiant un certain nombre de nouvelles interactions avec un récepteur immunitaire NLR11, une protéine dont les partenaires d’interaction sont généralement difficiles à obtenir en utilisant des méthodes traditionnelles.
Ce protocole illustre le PL à base de TurboID en planta en décrivant l’identification des protéines d’interaction du domaine TIR N-terminal du récepteur immunitaire NLR dans les plantes de N. benthamiana. La méthode peut être étendue à toutes les protéines d’intérêt dans N. benthamiana. Plus important encore, il fournit une référence importante pour l’étude des IPP chez d’autres espèces végétales telles que Arabidopsis,tomate, et d’autres.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Les techniques d’étiquetage de proximité (PL) utilisant l’acérétique peroxidase (APEX) ou escherichia coli biotin ligase BirA (connue sous le nom de BioID) ont été utilisées avec succès pour identifier les interactions protéines-protéines (IPP) dans les cellules des mammifères. Cependant, les exigences de peroxyde d’hydrogène toxique (H2O2) dans le PL basé sur APEX, le temps d’incubation plus long avec la biotine (16-24 h), et la température d’incubation plus élevée (37 oC) dans le PL basé sur BioID limitent sévèrement leurs applications dans les plantes. Le PL, récemment décrit par TurboID, traite de nombreuses limites de BioID et d’APEX. TurboID permet l’étiquetage de proximité rapide des protéines en seulement 10 minutes dans des conditions à température ambiante (RT). Bien que l’utilité de TurboID a été démontrée dans les modèles animaux, nous avons récemment montré que TurboID-basé PL effectue mieux dans les plantes par rapport à BioID pour l’étiquetage des protéines qui sont proximales à une protéine d’intérêt. Il est prévu ici un protocole étape par étape pour l’identification des partenaires d’interaction protéique à l’aide du domaine du récepteur N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la famille de protéines riches en leucine nucléotide-contraignante (NLR) comme modèle. La méthode décrit la construction vectorielle, l’agroinfiltration des constructions d’expression protéique, le traitement de la biotine, l’extraction et le desalting des protéines, la quantification et l’enrichissement des protéines biotinées par purification d’affinité. Le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour étudier d’autres protéines d’intérêt pour Nicotiana et d’autres espèces végétales.

Les données représentatives, qui illustrent les résultats attendus basés sur le protocole décrit, sont adaptées de Zhang etcoll. La figure 1 résume les procédures d’exécution turboID-basé PL dans N. benthamiana. La figure 2 montre l’expression et la biotinylation des protéines dans les feuilles infiltrées de N. benthamiana. La figure 3 montre que les protéines biotinyées da...

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TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Décrit ici est une méthode d’étiquetage de proximité pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine TIR du récepteur immunitaire NLR dans le tissu foliaire de Nicotiana benthamiana. Un protocole détaillé pour l’identification des interactions entre d’autres protéines d’intérêt utilisant cette technique à Nicotiana et d’autres espèces végétales est également fourni.

Étiquetage de proximité basé sur TurboID pour l’identification dans planta des réseaux d’interaction protéines-protéines

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

Les récepteurs immunitaires NLR jouent un rôle crucial dans la médiation de la défense des plantes contre divers agents pathogènes. Nous décrivons une méthode d’étiquetage de proximité basée sur TurboID pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine récepteur Toll/interleukin-1 contenant des NLR tels que les récepteurs immunitaires dans les usines de Nicotiana benthamiana. Ce protocole fournit une référence importante pour étudier les interactions protéines-protéines chez d’autres espèces végétales et il peut être étendu à toute protéine d’intérêt dans Nicotiana benthamiana.L’approche d’étiquetage de proximité basée sur TurboID présente un net avantage par rapport aux approches traditionnelles, car elle peut être utilisée pour capturer in vivo des interactions protéines-protéines transitoires ou faibles. Commencez par cultiver des graines de N.benthamiana dans un sol humide à haute densité. Conservez-les dans une chambre climatique avec une période de 18 heures de lumière et de huit heures de photo sombre à 23 à 25 degrés Celsius.Gardez les plantes dans la chambre pendant environ quatre semaines jusqu’à ce qu’elles poussent à un stade folio de quatre à huit pour l’agroinfiltration subséquente. Construire des fusions TurboID et transformer les plasmides en cellules compétentes Agrobacterium tumefaciens comme décrit dans le protocole texte. Utilisez une seringue sans aiguille d’un millilitre pour infiltrer l’inoculum de l’épiderme abaxial des feuilles de N.benthamiana entièrement matures.À 36 heures après la filtration, infiltrer 200 micromolaires de biotine dans les feuilles et maintenir la plante pendant trois à 12 heures supplémentaires avant de récolter le tissu foliaire. Pour recueillir l’échantillon de feuilles, couper les feuilles infiltrées à la base du pétiole, enlever la veine folilaire et congeler le tissu dans de l’azote liquide. Moudre le tissu foliaire à l’aide d’un pilon et d’un mortier et conserver la poudre dans des tubes Falcon de 15 ou 50 millilitres à moins 80 degrés Celsius.Pour extraire la protéine totale, transférer environ 0,35 grammes de poudre de feuilles dans un tube de deux millilitres. Assurez-vous de maintenir le tissu à basse température dans l’azote liquide pendant ce processus. Ajouter 700 microlitres de tampon de lyse RIPA à la poudre.Vortex le tube pendant 10 minutes et laisser l’échantillon sur la glace pendant 30 minutes, en mélangeant le contenu toutes les quatre à cinq minutes en inversant les tubes. Centrifuger les tubes à 20 000 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, recueillir le surnatant.Retirez la biotine libre en exécutant l’échantillon à travers une colonne de desalting. Retirez le scellant au bas de la colonne et placez-le dans un tube de 50 millilitres. Puis desserrez le bouchon et centrifugez la colonne à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes.Placez la colonne de desalting dans un tube frais de 50 millilitres et équilibrez la colonne trois fois avec cinq millilitres de tampon de lyse RIPA. Centrifugez-le à 1000 fois g et quatre degrés Celsius pendant deux minutes et jetez le débit à chaque fois. Ajouter 1,5 millilitres d’extrait de protéines au sommet de la résine dans la colonne équilibrée.Et quand l’extrait entre dans la résine, ajouter 100 autres microlitres de tampon de lyse RIPA. Centrifuger la colonne pendant deux minutes et laisser les échantillons desalted sur la glace jusqu’à nouvel usage. Pour quantifier les extraits de protéines desalted, mesurez l’OD595 à l’aide d’un spectrophotomètre Bio-Rad.Dessinez la courbe standard en fonction de la valeur de la solution BSA gradient et calculer la concentration des échantillons de protéines desalted. Equilibrer les perles magnétiques conjuguées streptavidine C1 avec un millilitre de tampon de lyse RIPA pendant une minute à température ambiante. Utilisez la grille magnétique pour absorber les perles pendant trois minutes et aspirer doucement la solution.Répétez ensuite le lavage une fois de plus. Transférer l’extrait de protéines dans les perles magnétiques équilibrées et incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un rotateur pour purifier les protéines. Le lendemain, capturer les perles avec un rack magnétique et aspirer le surnatant.Ensuite, lavez les perles avec 1,7 millilitres de tampon de lavage un en l’ajoutant au tube et l’incuber sur le rotor pendant huit minutes. Retirez le supernatant tel qu’il a été décrit précédemment et répétez le lavage avec 1,7 millilitres de tampon de lavage deux et lavez le tampon trois. Ajouter 1,7 millilitres de Tris HCL de 50 millimolaires pour enlever le détergent.Ensuite, placez le tube sur la grille magnétique et retirez le supernatant. Répétez le lavage avec un millilitre de 50 milli mollar Tris HCL et transférez les perles dans un nouveau tube de 1,5 millilitre. Enfin, lavez les perles six fois avec un tampon bicarbonate de bicarbonate de munitions de 50 millimaux pendant cinq minutes par lavage.Utilisez 100 microlitres de perles pour l’analyse des immunoblots pour confirmer l’enrichissement des protéines biotinylées et congeler flash le reste de l’échantillon à stocker à moins 80 degrés Celsius. Des taches occidentales ont été employées pour analyser l’expression et la biotinylation de protéine dans les feuilles agroinfiltrées de N.benthamiana. Les protéines biotinylées des feuilles infiltrées ont été efficacement enrichies en perles magnétiques conjuguées streptavidine C1 pour une analyse de spectrométrie de masse ultérieure.Différentes protéines de tailles variées ont été capturées et l’analyse des taches occidentales des protéines enrichies a montré des bandes barbouillées. Lorsque vous essayez cette procédure, n’oubliez pas d’enlever le scellant au bas de la colonne de dessalage et de desserrer les bouchons avant chaque centrifugation. Ce protocole est facilement adaptable à d’autres protéines d’intérêt dans Nicotiana benthamiana et peut également être utilisé pour étendre le PL TurboID dans d’autres espèces végétales.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Méthode d&#39;agglutination de particules pour l&#39;identification des poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Recherche

Immunologie et infection

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualisation virus de la dengue grâce à Alexa Fluor Étiquetage

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Une méthode pour l&#39;étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Approche comparative caractérisent le paysage des interactions hôte-pathogène protéine-protéine

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Les tests pour l&#39;identification de nouveaux antiviraux contre la fièvre catarrhale Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l&#39;aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification de séquences de localisation Plasmodesmal en protéines In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification de marqueurs de Virulence de Mycobacterium abscessus de réplication intracellulaire dans les Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...