Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 bis Y.Z.), der National Natural Science Foundation of China (31872637 to Y.Z.) und der Fundamental Research Funds for the Central Universities (2019TC028 bis Y.Z.) und der NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185 und NIH-GM132582-01 bis S.P.D.K.

ANMERKUNG: Eine Übersicht über die Methode ist in Abbildung 1dargestellt.
1. Pflanzenmaterialaufbereitung
<ol><li>N. Benthamiana-Samen in nassen Böden mit hoher Dichte anbauen und in einer Klimakammer mit einem 16 h-Licht (ca. 75 x2s) und 8 h dunkler Photoperiode bei 23–25 °C halten.</li>
	<li>Etwa 1 Woche später jeden jungen Sämling vorsichtig in 4' x 4' Töpfe geben und die Sämlinge in derselben Kammer aufbewahren.</li...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. 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C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

Die TurboID Biotinligase wird durch Hefedisplay-basierte directed Evolution des BioID10erzeugt. Es hat viele Vorteile gegenüber anderen PL-Enzymen. TurboID ermöglicht die Anwendung von PL auf andere Modellsysteme, einschließlich Fliegen und Würmern, deren optimale Wachstumstemperatur bei ca. 25 °C10liegt. Obwohl der PL-Ansatz in Tiersystemen weit verbreitet ist, ist seine Anwendung in Pflanzen begrenzt. Das hier beschriebene Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren...

PPI sind die Grundlage verschiedener zellulärer Prozesse. Zu den traditionellen Methoden zur Identifizierung von PPI gehören Hefe-Zwei-Hybrid-Screening (Y2H) und Immunpräzipitation in Verbindung mit Massenspektrometrie (IP-MS)1. Beide haben jedoch einige Nachteile. Beispielsweise erfordert das Y2H-Screening die Verfügbarkeit einer Y2H-Bibliothek der Zielpflanze oder Tierart. Der Bau dieser Bibliotheken ist arbeitsintensiv und teuer. Darüber hinaus wird der Y2H-Ansatz in der heterologen einzelligen eukaryotischen Organismushefe durchgeführt, die möglicherweise nicht den zellulären Status höherer eukaryotischer Zellen darstellt.
Im Gegensatz dazu zeigt IP-MS eine geringe Effizienz bei der Erfassung vorübergehender oder schwacher PPI, und es ist auch ungeeignet für Proteine mit geringer Häufigkeit oder hoher Hydrophobie. Viele wichtige Proteine, die an den Signalwegen der Pflanze beteiligt sind, wie z. B. Rezeptor-ähnliche Kiinasen (RLKs) oder die NLR-Familie von Immunrezeptoren, werden auf niedrigem Niveau exprimiert und interagieren oft vorübergehend mit anderen Proteinen. Daher schränkt es das Verständnis der Mechanismen, die der Regulierung dieser Proteine zugrunde liegen, stark ein.
Kürzlich wurden näher markierte (PL) Methoden auf Basis von Ascorbatperoxidase (APEX) und einer mutierten Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (bekannt als BioID) für die Untersuchung von PPI2,3,4entwickelt und genutzt. Das Prinzip von PL ist, dass ein Zielprotein von Interesse mit einem Enzym verschmolzen wird, das die Bildung von labilem Biotinyl-AMP (Bio-AMP) katalysiert. Diese kostenlosen Bio-AMP werden von PL-Enzymen freigesetzt und diffundieren in die Nähe des Zielproteins, wodurch die Biotinylierung von proximalen Proteinen an den primären Aminen in einem geschätzten Radius von 10 nm5ermöglicht wird.
Dieser Ansatz hat erhebliche Vorteile gegenüber den herkömmlichen Y2H- und IP-MS-Ansätzen, wie z. B. der Fähigkeit, transiente oder schwache PPI zu erfassen. Darüber hinaus ermöglicht PL die Kennzeichnung von proximalen Proteinen des Zielproteins in ihrer nativen zellulären Umgebung. Verschiedene PL-Enzyme haben einzigartige Nachteile, wenn sie auf verschiedene Systeme angewendet werden. Obwohl APEX beispielsweise eine höhere Tagging-Kinetik im Vergleich zu BioID bietet und erfolgreich in Säugetiersystemen angewendet wird, macht die Anforderung an giftiges Wasserstoffperoxid (H2O2) in diesem Ansatz es für PL-Studien an Pflanzen ungeeignet.
Im Gegensatz dazu vermeidet BioID-basierte S-basierte S-basierte S-basierte Verwendung der toxischenH2O2, aber die Rate der Etikettierung ist langsam (erfordert 18–24 h, um die Biotinylierung abzuschließen), wodurch die Erfassung vorübergehender PPI weniger effizient ist. Darüber hinaus führt die höhere Inkubationstemperatur (37 °C), die für eine effiziente PL durch BioID erforderlich ist, zu äußerer Belastung für einige Organismen, wie Pflanzen4. Daher wurde berichtet, dassderbegrenzte Einsatz von BioID-basierter PL in Pflanzen (d. h. Reisprotoplasten, Arabidopsis und N. benthamiana) 6,7,8,9gemeldet wurde. Das kürzlich beschriebene TurboID-Enzym bewältigt die Mängel von APEX und BioID-basierter PL. TurboID zeigte eine hohe Aktivität, die die Ausführung von PL innerhalb von 10 min bei RT10ermöglicht. TurboID-basierte sePL wurde erfolgreich in Säugetierzellen, Fliegen und Würmern10eingesetzt. Kürzlich haben wir und andere Forschungsgruppen den Einsatz von TurboID-basiertem PL für die Untersuchung von PPI in verschiedenen Pflanzensystemen, einschließlich N. benthamiana und Arabidopsis Pflanzen und Tomatenhaarwurzeln11,12,13,14, optimiert und erweitert. Vergleichende Analysen ergaben, dass TurboID bei PL in Anlagen besser abschneidet als BioID11,14. Es hat auch die Robustheit der TurboID-basierten PL in Planta gezeigt, indem eine Reihe von neuartigen Wechselwirkungen mit einem NLR-Immunrezeptor11identifiziert wurde, einem Protein, dessen Interaktionspartner in der Regel mit traditionellen Methoden schwer zu erhalten sind.
Dieses Protokoll veranschaulicht die TurboID-basierte PL in planta, indem es die Identifizierung von Interaktionsproteinen der N-terminalen TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in N. benthamiana-Pflanzen beschreibt. Die Methode kann auf alle Proteine von Interesse in N. benthamianaerweitert werden. Noch wichtiger ist, es bietet eine wichtige Referenz für die Untersuchung von PPI in anderen Pflanzenarten wie Arabidopsis,Tomaten, und andere.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

Näherungskennzeichnungstechniken (PL) mit hilfe von Ascorbatperoxidase (APEX) oder Escherichia coli biotin ligase BirA (bekannt als BioID) wurden erfolgreich zur Identifizierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) in Säugetierzellen eingesetzt. Der Bedarf an toxischem Wasserstoffperoxid (H2O2) in APEX-basierter PL, längere Inkubationszeit mit Biotin (16–24 h) und eine höhere Inkubationstemperatur (37 °C) in BioID-basierter PL schränken ihre Anwendungen in Pflanzen jedoch stark ein. Das kürzlich beschriebene TurboID-basierte PL behebt viele Einschränkungen von BioID und APEX. TurboID ermöglicht eine schnelle Näherungskennzeichnung von Proteinen in nur 10 min unter Raumtemperatur (RT). Obwohl der Nutzen von TurboID in Tiermodellen nachgewiesen wurde, haben wir kürzlich gezeigt, dass TurboID-basiertes PL in Pflanzen besser abschneidet als BioID bei der Kennzeichnung von Proteinen, die proximal für ein Protein von Interesse sind. Hier ist ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Identifizierung von Protein-Interaktionspartnern unter Verwendung der N-terminalen Toll/Interleukin-1-Rezeptor-Domäne (TIR) der Nukleotid-bindenden Leucin-rich repeat (NLR)-Proteinfamilie als Modell vorgesehen. Die Methode beschreibt die Vektorkonstruktion, die Agroinfiltration von Proteinexpressionskonstrukten, Biotinbehandlung, Proteinextraktion und -entsalzung, Quantifizierung und Anreicherung der biotinylierten Proteine durch Affinitätsreinigung. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Proteine von Interesse in Nicotiana und anderen Pflanzenarten zu untersuchen.

Die repräsentativen Daten, die die erwarteten Ergebnisse auf der Grundlage des beschriebenen Protokolls veranschaulichen, werden von Zhang et al11adaptiert. Abbildung 1 fasst die Verfahren für die Durchführung von TurboID-basierter PL in N. benthamianazusammen. Abbildung 2 zeigt die Proteinexpression und Biotinylierung in den infiltrierten N. benthamiana Blättern. Abbildung 3 zeigt, dass...

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TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Beschrieben wird hier eine Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern der TIR-Domäne des NLR-Immunrezeptors in Nicotiana benthamiana Blattgewebe. Ebenfalls zur Verfügung gestellt ist ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen anderen Proteinen von Interesse mit dieser Technik bei Nicotiana und anderen Pflanzenarten.

TurboID-basierte Näherungskennzeichnung für in Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

NLR-Immunrezeptoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung der Pflanzenabwehr gegen verschiedene Krankheitserreger. Wir beschreiben eine TurboID-basierte Näherungskennzeichnungsmethode zur Identifizierung von Interaktionspartnern von Toll/Interleukin-1-Rezeptoren, die NLRs wie Immunrezeptoren in Nicotiana Benthamiana-Pflanzen enthalten. Dieses Protokoll bietet eine wichtige Referenz für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in anderen Pflanzenarten und kann auf jedes Protein von Interesse in Nicotiana benthamiana erweitert werden.Der TurboID-basierte Näherungsetikettierungsansatz hat einen deutlichen Vorteil gegenüber den herkömmlichen Ansätzen, da er verwendet werden kann, um transiente oder schwache Protein-Protein-Wechselwirkungen in vivo zu erfassen. Beginnen Sie mit dem Anbau von N.benthamiana Samen in nassen Böden mit einer hohen Dichte. Bewahren Sie sie in einer Klimakammer mit einem 18-stündigen Hellen und einer achtstündigen dunklen Fotoperiode bei 23 bis 25 Grad Celsius auf.Halten Sie die Pflanzen in der Kammer für etwa vier Wochen, bis sie bis zu einem Blattstadium von vier bis acht für die nachfolgende Agroinfiltration wachsen. Konstruieren Sie TurboID-Fusionen und wandeln Sie die Plasmide in Agrobacterium tumefaciens kompetente Zellen um, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie eine ein Milliliter nadellose Spritze, um das Inokulum der abaxialen Epidermis der vollreifen N.benthamiana Blätter zu infiltrieren.Nach 36 Stunden nach der Filtration 200 mikromolares Biotin in die Blätter infiltrieren und die Pflanze für weitere drei bis zwölf Stunden pflegen, bevor das Blattgewebe geerntet wird. Um die Blattprobe zu sammeln, schneiden Sie die infiltrierten Blätter an der Basis der Petiole, entfernen Sie die Blattvene und blitzen Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff einfrieren. Das Blattgewebe mit einem Stößel und Mörtel mahlen und das Pulver in 15 oder 50 Milliliter Falcon-Röhren bei minus 80 Grad Celsius lagern.Um das Gesamteprotein zu extrahieren, übertragen Sie etwa 0,35 Gramm Blattpulver in eine Zwei-Milliliter-Röhre. Achten Sie darauf, das Gewebe bei niedriger Temperatur im flüssigen Stickstoff während dieses Prozesses zu halten. 700 Mikroliter RIPA-Lysepuffer in das Pulver geben.Wirbeln Sie die Röhre für 10 Minuten und lassen Sie die Probe auf Eis für 30 Minuten, mischen Sie den Inhalt alle vier bis fünf Minuten durch Invertieren der Rohre. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 20.000 mal g bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Dann sammeln Sie den Überstand.Entfernen Sie das freie Biotin, indem Sie die Probe durch eine Entsalzungssäule führen. Entfernen Sie die Versiegelung am unteren Rand der Säule und legen Sie sie in ein 50-Milliliter-Rohr. Dann lösen Sie die Kappe und zentrifugieren Sie die Säule bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius für zwei Minuten.Legen Sie die Entsalzungssäule in eine frische 50-Milliliter-Röhre und gleichnden Sie die Säule dreimal mit fünf Millilitern RIPA-Lysepuffer. Zentrifugieren Sie es bei 1 000 mal g und vier Grad Celsius für zwei Minuten und entsorgen Sie den Durchfluss jedes Mal. Fügen Sie 1,5 Milliliter Proteinextrakt an die Oberseite des Harzes in der ausgeglichenen Spalte hinzu.Und wenn der Extrakt in das Harz gelangt, fügen Sie weitere 100 Mikroliter RIPA-Lysepuffer hinzu. Zentrifugieren Sie die Säule für zwei Minuten und lassen Sie die entsalzten Proben bis zur weiteren Verwendung auf Eis. Um die entsalzten Proteinextrakte zu quantifizieren, messen Sie den OD595 mit einem Bio-Rad Spektralphotometer.Zeichnen Sie die Standardkurve basierend auf dem Wert der Gradienten-BSA-Lösung und berechnen Sie die Konzentration der entsalzten Proteinproben. Equilibrate die Streptavidin C1 konjugierten magnetischen Perlen mit einem Milliliter RIPA Lyse Puffer für eine Minute bei Raumtemperatur. Verwenden Sie das magnetische Rack, um die Perlen für drei Minuten zu absorbieren und die Lösung sanft zu aspirieren.Wiederholen Sie dann die Wäsche noch einmal. Übertragen Sie den Proteinextrakt auf die gleichgewichtig geschalteten Magnetperlen und bebrüten Sie die Röhre bei vier Grad Celsius über Nacht auf einem Rotator, um die Proteine zu reinigen. Am nächsten Tag fangen Sie die Perlen mit einem magnetischen Rack und aspirieren Sie den Überstand.Als nächstes waschen Sie die Perlen mit 1,7 Milliliter Waschpuffer eins, indem Sie es in das Rohr hinzufügen und inkubieren Sie es auf dem Rotor für acht Minuten. Entfernen Sie den Überstand wie zuvor beschrieben und wiederholen Sie die Wäsche mit 1,7 Milliliter Waschpuffer zwei und Waschpuffer drei. Fügen Sie 1,7 Milliliter 50 Millimolar Tris HCL hinzu, um das Reinigungsmittel zu entfernen.Legen Sie dann das Rohr auf das magnetische Rack und entfernen Sie den Überstand. Wiederholen Sie die Wäsche mit einem Milliliter 50 Millimolar Tris HCL und übertragen Sie die Perlen auf eine neue 1,5 Milliliter Tube. Schließlich waschen Sie die Perlen sechsmal mit 50 Millimolar Ammonium Bicarbonat Puffer für fünf Minuten pro Wäsche.Verwenden Sie 100 Mikroliter Perlen für die Immunoblot-Analyse, um die Anreicherung der biotinylierten Proteine zu bestätigen und den Rest der Probe bei minus 80 Grad Celsius einzufrieren. Westliche Flecken wurden verwendet, um die Proteinexpression und Biotinylierung in den agrofiltrierten N.benthamiana Blättern zu analysieren. Die biotinylierten Proteine in den infiltrierten Blättern wurden effizient mit Streptavidin C1 konjugierten Magnetperlen für die anschließende Massenspektrometrieanalyse angereichert.Verschiedene Proteine mit unterschiedlichen Größen wurden eingefangen und die Western-Blot-Analyse der angereicherten Proteine zeigte verschmierte Bänder. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, denken Sie bitte daran, die Versiegelung an der Unterseite der Entsalzungssäule zu entfernen und die Kappen vor jeder Zentrifugation zu lösen. Dieses Protokoll ist leicht an andere Proteine von Interesse in Nicotiana benthamiana anpassbar und kann auch verwendet werden, um die TurboID PL in anderen Pflanzenarten zu erweitern.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

Sezieren Host-Virus-Interaktion in Lytic Replikation von einem Modell Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Ein Verfahren zur Markierung Gefäßsystem in embryonalen Mäuse

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Tests für die Identifizierung neuer Antivirale gegen Blauzungenvirus

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identifikation der Virulenz Marker von Mycobacterium Abscessus für die intrazelluläre Replikation in Phagozyten

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...