Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

עבודה זו היתה נתמכת על ידי מענקים הלאומית המדע הטרנסגניים תוכנית טכנולוגיה (2019ZX08010-003 ל Y.Z.), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31872637 לY.Z.), ואת קרנות המחקר הבסיסי עבור האוניברסיטאות המרכזיות (2019ZX08010 ל Y.Z.), ו-NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, ו

הערה: מבט כולל על השיטה מוצג באיור 1.
1. הכנת חומרים צמחיים
<ol><li>הגדל N. benthamiana זרעים באדמה רטובה בצפיפות גבוהה ולשמור אותם בחדר האקלים עם אור 16 h (כ 75 μm/מטר2) ו-8 h photoperiod כהה ב 23 – 25 ° c.</li>
	<li>כשבוע לאחר מכן, בזהירות להעביר כל שתיל צעיר כדי 4 ' x 4 ' סיר?...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

מספר הביוטין של ה-turboid ליגאז נוצר על-ידי האבולוציה המבוססת על תצוגה מבוססת על-ידי שמרים של ה-bioid10. יש לו יתרונות רבים על פני אנזימים PL אחרים. TurboID מאפשר יישום של PL למערכות מודל אחרות, כולל זבובים ותולעים, שטמפרטורת הצמיחה האופטימלית שלהם היא כ -25 ° c10. למרות הגישה PL כבר...

PPIs הבסיס לתהליכים סלולריים שונים. שיטות מסורתיות לזיהוי PPIs כוללים שמרים-two-היברידית (Y2H) הקרנה immunoprecipitation בשילוב עם ספקטרומטר מסה (IP-MS)1. עם זאת, שניהם סובלים מכמה חסרונות. לדוגמה, הקרנת Y2H מחייבת זמינות של ספריית Y2H של מפעל היעד או של מינים של בעלי חיים. בניית ספריות אלה היא אינטנסיבית ויקרה. יתר על כן, הגישה Y2H מבוצעת הטרוולוגי תא יחיד איקריוטית האורגניזם שמרים, אשר עשוי לא לייצג את הסטטוס הסלולר של תאים איקריוטית גבוה יותר.
לעומת זאת, ה-IP-MS מראה יעילות נמוכה ב לכידת ארעי או חלש PPIs, וזה גם לא מתאים לאותם חלבונים עם שפע נמוך או הידרופוטטי גבוה. חלבונים חשובים רבים המעורבים במסלולים איתות הצמח כגון kinases כמו קולטן (RLKs) או משפחת NLR של קולטנים החיסונית מבוטאים ברמות נמוכות ולעתים קרובות אינטראקציה עם חלבונים אחרים באופן מתמיד. לכן, היא מגבילה מאוד את ההבנה של מנגנונים המשמשים לוויסות החלבונים הללו.
לאחרונה, הסמיכות תיוג (PL) שיטות מבוסס על הנדסה ascorbate peroxidase (פיסגה) ו מוטציה esהמאשכיה coli ביוטין ליגאז בירהR118G (המכונה bioid) פותחו ומנוצל למחקר של ppis2,3,4. העיקרון של PL הוא כי חלבון היעד של עניין הוא התמזגו עם אנזים, אשר מזרז את היווצרות של יציב משך biotinyl-amp (ביו-amp). אלה bio-AMP חינם משתחררים על ידי אנזימים PL לפזר לסביבה של חלבון היעד, המאפשר ביולציה של חלבונים האבובית על אמינים העיקרי בתוך רדיוס מוערך של 10 ננומטר5.
לגישה זו יש יתרונות משמעותיים על הגישות המסורתיות של Y2H ו-IP-MS, כגון היכולת ללכוד PPIs ארעי או חלש. יתר על כן, PL מאפשר תיוג של חלבונים האבותאיים של חלבון היעד בסביבות הסלולר הילידים שלהם. לאנזימי PL שונים יש חסרונות ייחודיים בעת החלתם על מערכות שונות. לדוגמה, למרות שהפיסגה מציעה הרבה יותר קינטיקה בהשוואה ל-BioID, והיא מיושמת בהצלחה במערכות היונקים, הדרישה של תחמוצת מימן רעילה (H2O2) בגישה זו הופכת את הדבר לאינו מתאים למחקרים מסוימים בצמחים.
לעומת זאת, BioID-מבוססי PL מונע שימוש ב-H2O רעיל 2,אבל שיעור התיוג הוא איטי (המחייב 18 – 24 H כדי להשלים biotinylation), ובכך עושה לכידת של ppis ארעי פחות יעיל. יתר על כן, טמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) נדרש עבור PL יעיל על ידי BioID מציג לחץ חיצוני על אורגניזמים מסוימים, כגון צמחים4. לכן, הפריסה המוגבלת של ביואיד מבוססי PL בצמחים (כלומר, הפרוטופזיס אורז, arabidopsis, ו N. benthamiana) דווחו6,7,8,9. האנזים ה-TurboID שתואר לאחרונה מתגבר על הליקויים של איפקס וביואיד מבוססי PL. TurboID הראה פעילות גבוהה המאפשרת הישג של PL בתוך 10 דקות ב-RT10. PL מבוססי TurboID הוחל בהצלחה בתאים מיונקים, זבובים, ותולעים10. לאחרונה, אנחנו וקבוצות מחקר אחרים באופן עצמאי אופטימיזציה המורחבת השימוש turboid מבוסס PL עבור לימוד ppis במערכות צמחים שונות, כולל נ. בנדיאמיאנה וצמחים arabidopsis שורשים עגבניות שעירים11,12,13,14. מנתח השוואתי עולה כי turboid מבצע טוב יותר עבור PL בצמחים לעומת bioid11,14. היא גם הוכיחה את החוסן של מבוססי turboid PL ב רצפה על ידי זיהוי מספר אינטראקציות הרומן עם הקולטן nlr11, חלבון שהשותפים אינטראקציה שלהם בדרך כלל קשה להשיג באמצעות שיטות מסורתיות.
פרוטוקול זה ממחיש את הקוד המבוסס על turboid ב-רצפה על ידי תיאור הזיהוי של חלבונים אינטראקציה של התחום N-terminal טיר של קולטן החיסון nlr ב -N. benthamiana צמחים. ניתן להרחיב את השיטה לכל חלבונים מעניינים ב- N. benthamiana. חשוב מכך, הוא מספק התייחסות חשובה לחקירת PPIs במינים צמחיים אחרים כגון Arabidopsis, עגבניה, ועוד.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

הסמיכות תיוג (PL) טכניקות באמצעות הנדסה ascorbate peroxidase (איפקס) או esהמאנוכיה קולי ביוטין ליגאז בירה (המכונה bioid) השתמשו בהצלחה לזיהוי של אינטראקציות חלבון חלבון (ppis) בתאי מיונקים. עם זאת, דרישות של תחמוצת מימן רעילים (H2O2) ב איפקס מבוסס PL, זמן דגירה ארוך יותר עם ביוטין (16 – 24 שעות), וטמפרטורת דגירה גבוהה יותר (37 ° c) ב bioid מבוססי PL מגביל באופן חמור את היישומים שלהם בצמחים. האובייקט המבוסס על TurboID שתואר לאחרונה מטפל במגבלות רבות של BioID ו-איפקס. TurboID מאפשר תיוג הקירבה מהירה של חלבונים רק 10 דקות תחת טמפרטורת החדר (RT) תנאים. למרות שכלי השירות של TurboID הוכח במודלים בעלי חיים, לאחרונה הראו כי מבוססי TurboID PL מבצעת טוב יותר בצמחים לעומת BioID עבור תיוג של חלבונים העומדים בפני חלבון של ריבית. מסופק כאן הוא פרוטוקול צעד אחר צעד לזיהוי של שותפים אינטראקציה חלבונים באמצעות מסוף N-terminal מספר/interleukin 1 (טיר) התחום של מבני נוקלאוטיד-מחייב לוקמיה עשיר (NLR) חלבון משפחה כמודל. השיטה מתארת בנייה וקטורית, הסתננות של ביטויים של חלבונים, טיפול ביוטין, חילוץ חלבונים והתפלה, כימות והעשרה של חלבונים ביולוגיים על ידי טיהור אהדה. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מותאם בקלות כדי ללמוד חלבונים אחרים של עניין טבק ומינים צמחים אחרים.

נתוני המייצג, הממחישים את התוצאות הצפויות בהתבסס על הפרוטוקול המתואר, מותאמים מ-Zhang ואח '11. איור 1 מסכם את ההליכים לביצוע מסמך מבוסס turboid ב- N. benthamiana. איור 2 מראה את ביטוי החלבון ואת הביוטלציה בתוך החדר. איור 3 מראה כי החלבו...

Watch this Scientific Journal Video about TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks at JoVE.com

TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

המתואר כאן היא שיטת תיוג קרבה לזיהוי שותפים אינטראקציה של התחום טיר של קולטן החיסונית NLR ב טבק benthamiana עלה רקמת. כמו כן, מסופק פרוטוקול מפורט לזיהוי של אינטראקציות בין חלבונים אחרים של הריבית באמצעות טכניקה זו ב טבק ומינים אחרים צמח.

מבוסס TurboID הסמיכות תיוג עבור בזיהוי Planta של חלבון-חלבון רשתות אינטראקציה

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

קולטני החיסון של NLR ממלאים תפקיד מכריע בתתיווך ההגנה על הצמחים מפני פתוגנים שונים. אנו מתארים שיטת תיוג קרבה מבוססת TurboID לזיהוי שותפים לאינטראקציה של תחום קולטן אגרה/אינטרלוקין-1 המכיל NLRs כגון קולטני חיסון בצמחי ניקוטיאנה בנתמיאנה. פרוטוקול זה מספק התייחסות חשובה לחקירת אינטראקציות חלבון-חלבון במין צמחי אחר ו ניתן להרחיב אותו לכל חלבון המעניין בניקוטיאנה בנתמיאנה.לגישת תיוג הקרבה המבוססת על TurboID יש יתרון מובהק על פני הגישות המסורתיות מכיוון שניתן להשתמש בה כדי ללכוד אינטראקציות ארעיות או חלשות של חלבוני חלבון ב-vivo. התחל על ידי גידול זרעי N.benthamiana באדמה רטובה בצפיפות גבוהה. שמור אותם בתא אקלים עם אור 18 שעות ותהוכת צילום כהה של שמונה שעות ב 23 עד 25 מעלות צלזיוס.שמור את הצמחים בתא במשך כארבעה שבועות עד שהם גדלים לשלב עלה של ארבעה עד שמונה עבור agroinfiltration הבאים. לבנות היתוך TurboID ולהפוך את הפלסמידים לתאים מוסמכים tumefaciens אגרובקטריום כמתואר בפרוטוקול הטקסט. השתמש מזרק אחד מיליליטר ללא מחט לחדור את inoculum של האפידרמיס abaxial של עלים בוגרים לחלוטין N.benthamiana.ב 36 שעות לאחר סינון, לחדור 200 ביוטין micromolar לתוך העלים ולשמור על הצמח במשך שלוש עד 12 שעות נוספות לפני קצירת רקמת העלה. כדי לאסוף את דגימת העלה, לחתוך את העלים הסתננו בבסיס petiole, להסיר את וריד העלה, פלאש להקפיא את הרקמה בחנקן נוזלי. טוחנים את רקמת העלה עם עלה וטיט ומאחסנים את האבקה בצינורות פלקון 15 או 50 מיליליטר במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי לחלץ את החלבון הכולל, להעביר כ 0.35 גרם של אבקת עלים לצינור שני מיליליטר. הקפד לשמור על הרקמה בטמפרטורה נמוכה בחנקן הנוזלי במהלך תהליך זה. הוסיפו לאבקה 700 מיקרוליטר של מאגר תות RIPA.Vortex הצינור במשך 10 דקות ולהשאיר את המדגם על קרח במשך 30 דקות, ערבוב התוכן כל ארבע עד חמש דקות על ידי היפוך הצינורות. צנטריפוגה הצינורות ב 20, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אז תאסוף את העל-טבעי.הסר את הביוטין בחינם על ידי הפעלת המדגם דרך עמודת התפלה. מוציאים את האיטום בתחתית העמוד ומ מניחים אותו בצינור של 50 מיליליטר. ואז לשחרר את הכובע צנטריפוגה העמוד ב 1, 000 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות.מניחים את עמוד ההתפלה בצינור טרי של 50 מיליליטר וציידו את העמוד שלוש פעמים בחמישה מיליליטר של מאגר תזת RIPA. צנטריפוגה זה ב 1, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות ולהשליך את הזרימה דרך בכל פעם. מוסיפים 1.5 מיליליטר של תמצית חלבון לראשו של שהף בעמודה שיווי המשקל.וכאשר התמצית נכנסת לארסין, להוסיף עוד 100 microliters של מאגר תזה RIPA. צנטריפוגה הטור במשך שתי דקות ולהשאיר את הדגימות המותפלות על קרח עד לשימוש נוסף. כדי לכמת את תמציות החלבון המותפל, למדוד את OD595 באמצעות ספקטרופוטומטר Bio-Rad.צייר את העקומה הסטנדרטית בהתבסס על הערך של פתרון BSA הדרגתי וחשב את הריכוז של דגימות החלבון המותפלות. לצייד את חרוזים מגנטיים streptavidin C1 מצומד עם מיליליטר אחד של חיץ תיזה RIPA במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. השתמש במתלה המגנטי כדי לספוג את חרוזים במשך שלוש דקות בעדינות שאף את הפתרון.ואז לחזור על לשטוף עוד פעם אחת. מעבירים את תמצית החלבון לחרוזים המגנטיים המאוברים ומדרגים את הצינור בארבע מעלות צלזיוס בן לילה על מסובב כדי לטהר את החלבונים. ביום שלמחרו, ללכוד את חרוזים עם מתלה מגנטי ושואפים את העל-טבעי.לאחר מכן, לשטוף את חרוזים עם 1.7 מיליליטר של חיץ לשטוף אחד על ידי הוספת אותו לצינור דגירה אותו על הרוטור במשך שמונה דקות. הסר את supernatant כפי שתואר קודם לכן ולחזור על לשטוף עם 1.7 מיליליטר של חיץ לשטוף שני לשטוף מאגר שלוש. הוסף 1.7 מיליליטר של 50 מילימולר טריס HCL כדי להסיר את חומר הניקוי.לאחר מכן מניחים את הצינור על המדף המגנטי ומסירים את העל-טבעי. חזור על לשטוף עם מיליליטר אחד של 50 מילימולר טריס HCL ולהעביר את חרוזים לצינור חדש 1.5 מיליליטר. לבסוף, לשטוף את חרוזים שש פעמים עם חיץ אמוניום ביקרבונט 50 מילימולאר במשך חמש דקות לכל לשטוף.השתמש 100 microliters של חרוזים לניתוח immunoblot כדי לאשר את העשרת חלבונים biotinylated ופלאש להקפיא את שאר המדגם כדי להיות מאוחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. כתמים מערביים שימשו לניתוח ביטוי חלבון וביוטינילציה בעלי N.benthamiana agroinfiltrated. החלבונים הביוטינילציה בעלים שחדרו הועשרו ביעילות עם חרוזים מגנטיים מצומדים של סטרפטבידין C1 לניתוח ספקטרומטריית המסה שלאחר מכן.חלבונים שונים בגדלים מגוונים נלכדו וניתוח כתמים מערבי של החלבונים המועשרים הראה להקות מרוחות. בעת ניסיון הליך זה, אנא זכור להסיר את האיטום בתחתית עמוד ההתפלה ולשחרר את הכובעים לפני כל צנטריפוגה. פרוטוקול זה ניתן להתאמה בקלות חלבונים אחרים של עניין Nicotiana benthamiana והוא יכול לשמש גם כדי להרחיב את PL TurboID במין צמחי אחר.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

לדמיין וירוס דנגה דרך אלקסה פלואוריד תיוג

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

שיטה תיוג vasculature ב עכברים עובריים

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

זיהוי של לוקליזציה Plasmodesmal רצפי חלבונים ב הפיסקו

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

זיהוי סמנים התקפה אלימה של Mycobacterium abscessus עבור שכפול תאיים ב Phagocytes

What differentiates Mycobacterium abscessus from other saprophytic mycobacteria is the ability to resist phagocytosis by human macrophages and the ability ...