Name: turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks
Uploaded: 2020-05-17T13:00:00
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इस काम को राष्ट्रीय ट्रांसजेनिक विज्ञान और प्रौद्योगिकी कार्यक्रम (2019ZX08010-003 से वाईजेड) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31872637 से वाईजेड), और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष (2019TC028 से Y.Z.), और NSF-IOS-1354434, एनएसएफ-आईओएस-1339185, और एनआईएच-जीएम 132582-01 से एस.पी.डी.के.

नोट: विधि का अवलोकन चित्र 1में दिखाया गया है ।
1. पौधे सामग्री तैयार करना
<ol><li>एक उच्च घनत्व पर गीली मिट्टी में एन बेंथमियाना बीज उगाएं और उन्हें 16 घंटे की रोशनी (लगभग 75 μmol/m2s)...

<ol>
	<li>Bergg&#229;rd, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).</li><li>Kim, D. I., Roux, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filling+the+void:+proximity-based+labeling+of+proteins+in+living+cells.">Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).</li><li>Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+interacting+proteins:+Application+of+BioID+as+a+discovery+tool.">Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool.</a> Proteomics. 17 (20), (2017).</li><li>Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+promiscuous+biotin+ligase+fusion+protein+identifies+proximal+and+interacting+proteins+in+mammalian+cells.">A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells.</a> Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).</li><li>Kim, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+nuclear+pore+complex+architecture+with+proximity-dependent+biotinylation.">Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).</li><li>Lin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+proximal+and+interacting+proteins+in+rice+protoplasts+by+proximity-dependent+biotinylation.">Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).</li><li>Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+planta+proximity+dependent+biotin+identification+(BioID).">In planta proximity dependent biotin identification (BioID).</a> Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).</li><li>Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+in+planta+BioID+system+as+a+probe+for+plasma+membrane-associated+immunity+proteins.">Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).</li><li>Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity-dependent+biotinylation+screening+identifies+NbHYPK+as+a+novel+interacting+partner+of+ATG8+in+plants.">Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants.</a> BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).</li><li>Branon, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+proximity+labeling+in+living+cells+and+organisms+with+TurboID.">Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID.</a> Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TurboID-based+proximity+labeling+reveals+that+UBR7+is+a+regulator+of+N+NLR+immune+receptor-mediated+immunity.">TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity.</a> Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).</li><li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems.">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TurboID-mediated+proximity+labeling+for+mapping+a+GSK3+kinase+signaling+network+in+Arabidopsis.">Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2019).</li><li>Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+labeling+of+protein+complexes+and+cell-type-specific+organellar+proteomes+in+Arabidopsis+enabled+by+TurboID.">Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID.</a> eLife. 8, 47864 (2019).</li><li>Yuan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Barley+stripe+mosaic+virus+vector+for+virus+induced+gene+silencing+in+monocots+and+dicots.">A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots.</a> PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).</li><li>McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+the+production+of+highly+competent+cells+of+Agrobacterium+for+transformation+via+electroporation.">A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation.</a> Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).</li><li>Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+the+neighborhood:+using+proximity-dependent+biotinylation+to+characterize+protein+complexes+and+map+organelles.">Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).</li><li>Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+Interactions+among+centrosome+components+identify+regulators+of+centriole+duplication.">Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication.</a> Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).</li><li>Shen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+pH+in+the+Arabidopsis+endomembrane+system.">Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system.</a> Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).</li><li>Bally, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+rise+and+rise+of+Nicotiana+benthamiana:+a+plant+for+all+reasons.">The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons.</a> Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).</li></ol>

टर्बोआईडी बायोटिन लिगाज बायोआईडी10के खमीर डिस्प्ले-आधारित निर्देशित विकास द्वारा उत्पन्न होता है। इसके अन्य पीएल एंजाइमों के ऊपर कई फायदे हैं। टर्बोआईडी मक्खियों और कीड़े सहित अन्य मॉडल प्...

पीपीआई विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं का आधार है। पीपीआई की पहचान करने के लिए पारंपरिक तरीकों में खमीर-दो-हाइब्रिड (Y2H) स्क्रीनिंग और इम्यूनोप्रीप्रिसिप्रिशन शामिल हैं, जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (आईपी-एमएस)1के साथ मिलकर हैं । हालांकि दोनों कुछ नुकसान से पीड़ित हैं। उदाहरण के लिए, Y2H स्क्रीनिंग के लिए लक्ष्य संयंत्र या जानवरों की प्रजातियों के Y2H पुस्तकालय की उपलब्धता की आवश्यकता होती है। इन पुस्तकालयों का निर्माण श्रम-प्रधान और महंगा है। इसके अलावा, Y2H दृष्टिकोण विषमलोगोस एकल-कोशिका यूकेरियोटिक ऑर्गेज्म खमीर में किया जाता है, जो उच्च यूकेरियोटिक कोशिकाओं की सेलुलर स्थिति का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है।
इसके विपरीत, आईपी-एमएस क्षणिक या कमजोर पीपीआई पर कब्जा करने में कम दक्षता दिखाता है, और यह कम बहुतायत या उच्च हाइड्रोफोबिसिटी वाले प्रोटीन के लिए भी अनुपयुक्त है। रिसेप्टर जैसे किनेस (आरएलके) या प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स के एनएलआर परिवार जैसे पौधे सिग्नलिंग रास्तों में शामिल कई महत्वपूर्ण प्रोटीन निम्न स्तर पर व्यक्त किए जाते हैं और अक्सर अन्य प्रोटीन के साथ क्षणिक रूप से बातचीत करते हैं। इसलिए, यह इन प्रोटीनों के नियमन में अंतर्निहित तंत्र ों की समझ को बहुत प्रतिबंधित करता है ।
हाल ही में, इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सी (एपेक्स) और एक उत्परिवर्ती एस्चेरिचिया कोलाई बायोटिन लिगासे बिराR118G (जिसे बायोआईडी के नाम से जाना जाता है) के आधार पर निकटता लेबलिंग (पीएल) विधियों को विकसित किया गया है और पीपीआई2,,3,,4के अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है। पीएल का सिद्धांत यह है कि ब्याज का एक लक्ष्य प्रोटीन एंजाइम के साथ जुड़ा हुआ है, जो लेबिल बायोटिनिल-एएमपी (जैव-एएमपी) के गठन को उत्प्रेरक करता है। ये मुफ्त जैव-एएमपी पीएल एंजाइमों द्वारा जारी किए जाते हैं और लक्ष्य प्रोटीन के आसपास के क्षेत्र में फैलाते हैं, जिससे 10 एनएम5के अनुमानित त्रिज्या के भीतर प्राथमिक अमीनों में समीपस्थ प्रोटीन के बायोटिनीलेशन की अनुमति होती है।
इस दृष्टिकोण को पारंपरिक Y2H और आईपी-एमएस दृष्टिकोणों पर महत्वपूर्ण लाभ हैं, जैसे क्षणिक या कमजोर पीपीआई पर कब्जा करने की क्षमता। इसके अलावा, पीएल अपने मूल सेलुलर वातावरण में लक्ष्य प्रोटीन के समीपस्थ प्रोटीन की लेबलिंग की अनुमति देता है । विभिन्न पीएल एंजाइमों को विभिन्न प्रणालियों पर लागू करते समय अद्वितीय नुकसान होते हैं। उदाहरण के लिए, हालांकि एपेक्स बायोआईडी की तुलना में उच्च टैगिंग काइनेटिक्स प्रदान करता है और स्तनधारी प्रणालियों में सफलतापूर्वक लागू होता है, इस दृष्टिकोण में विषाक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)की आवश्यकता इसे पौधों में पीएल अध्ययन के लिए अनुपयुक्त बनाती है।
इसके विपरीत, बायोआईडी-आधारित पीएल विषाक्त एच2ओ2के उपयोग से बचा जाता है, लेकिन लेबलिंग की दर धीमी है (बायोटिनीशन को पूरा करने के लिए 18-24 घंटे की आवश्यकता होती है), इस प्रकार क्षणिक पीपीआई का कब्जा कम कुशल बनाता है। इसके अलावा, बायोआईडी द्वारा कुशल पीएल के लिए आवश्यक उच्च इनक्यूबेशन तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पौधों4जैसे कुछ जीवों के लिए बाहरी तनाव का परिचय देता है। इसलिए, पौधों (यानी, चावल प्रोटोप्लास्ट, अरबीडोप्सिस और एन बेंथमियाना) में बायोआईडी-आधारित पीएल की सीमित तैनाती6,7,7,8,,9की रिपोर्ट की गई है। हाल ही में वर्णित टर्बोआईडी एंजाइम एपेक्स और बायोआईडी आधारित पीएल की कमियों को दूर करता है । टर्बोआईडी ने उच्च गतिविधि दिखाई जो आरटी10में 10 मिनट के भीतर पीएल की उपलब्धि को सक्षम बनाती है । टर्बोआईडी आधारित पीएल सफलतापूर्वक स्तनधारी कोशिकाओं, मक्खियों, और कीड़े10में लागू किया गया है । हाल ही में, हमने और अन्य शोध समूहों ने एन बेंथमियाना और अरबीडोप्सिस पौधों और टमाटर बालों वाली जड़ें11,,12,,13, 14,14सहित विभिन्न संयंत्र प्रणालियों में पीपीआई का अध्ययन करने के लिए टर्बोआईडी-आधारित पीएल के उपयोग को स्वतंत्र रूप से अनुकूलित और बढ़ाया। तुलनात्मक विश्लेषणों से पता चला कि टर्बोआईडी बायोआईडी11,14की तुलना में पौधों में पीएल के लिए बेहतर प्रदर्शन करता है । इसने एक एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर11के साथ कई उपन्यास बातचीत की पहचान करके प्लांटा में टर्बोआईडी-आधारित पीएल की मजबूती का भी प्रदर्शन किया है, एक प्रोटीन जिसका इंटरैक्शन पार्टनर आमतौर पर पारंपरिक तरीकों का उपयोग करके प्राप्त करना मुश्किल होता है।
यह प्रोटोकॉल एन बेंथमियाना संयंत्रों में एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर के एन-टर्मिनल टीआईआर डोमेन के इंटरैक्शन प्रोटीन की पहचान का वर्णन करके प्लांटा में टर्बोआईडी-आधारित पीएल को दिखाता है। इस विधि को एन बेंथमियानामें रुचि के किसी भी प्रोटीन तक बढ़ाया जा सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि यह अरबीडोप्सिस,टमाटर और अन्य जैसे अन्य पादप प्रजातियों में पीपीआई की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण संदर्भ प्रदान करता है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>721 Spectrophotometer</td>
			<td>Metash, made in China</td>
			<td>Q/SXFZ6</td>
			<td>For OD600 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4639-1G</td>
			<td>50 mM Stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Centrifuge 5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>65001</td>
			<td>For affinity purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E6758-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Costar 3590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For Western blot analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium chloride solution(LiCl), 8M</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L7026-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low speed refrigerated centrifuge</td>
			<td>Zonkia, made in China</td>
			<td>KDC-2046</td>
			<td>For desalting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2&#183;6H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>123.21D</td>
			<td>For bead adsorption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiskan FC Microplate Photometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N07710</td>
			<td>For OD595 measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NP-40 (IGEPAL CA-630)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11867423001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotational mixer</td>
			<td>Kylin-Bell Lab Instrument</td>
			<td>WH-986</td>
			<td>For IP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shock incubator</td>
			<td>Labotery, made in China</td>
			<td>ZQPZ-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2510-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate(SDS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L4390-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-HRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T1503-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G-560E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water-jacket Incubator</td>
			<td>Blue pard, made in China</td>
			<td>GHP-9080</td>
			<td>For Agrobacterium incubation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeba Spin Desalting Column</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>89893</td>
			<td>For removal of biotin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

turboid-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks

स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की पहचान के लिए इंजीनियर एस्कॉर्बेट पेरोक्सी (एपेक्स) या एस्चेरिचिया कोलाई बायोटिन लिगा (जिसे बायोआईडी के नाम से जाना जाता है) का उपयोग करके निकटता लेबलिंग (पीएल) तकनीकों का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। हालांकि, एपेक्स आधारित पीएल में विषाक्त हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2)की आवश्यकताएं, बायोटिन (16-24 घंटे) के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन समय, और बायोआईडी-आधारित पीएल में उच्च इनक्यूबेशन तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पौधों में उनके अनुप्रयोगों को गंभीर रूप से सीमित करता है। हाल ही में वर्णित टर्बोआईडी आधारित पीएल बायोआईडी और एपेक्स की कई सीमाओं को संबोधित करता है। टर्बोआईडी कमरे के तापमान (आरटी) स्थितियों के तहत सिर्फ 10 min में प्रोटीन की तेजी से निकटता लेबलिंग की अनुमति देता है । हालांकि टर्बोआईडी की उपयोगिता पशु मॉडलों में प्रदर्शित किया गया है, हमने हाल ही में दिखाया कि टर्बोआईडी आधारित पीएल प्रोटीन की लेबलिंग के लिए बायोआईडी की तुलना में पौधों में बेहतर प्रदर्शन करता है जो ब्याज के प्रोटीन के समीपस्थ हैं। बशर्ते यहां एक मॉडल के रूप में न्यूक्लियोटाइड-बाइंडिंग ल्यूसिन-रिच रिपीट (एनएलआर) प्रोटीन परिवार के एन-टर्मिनल टोल/इंटरल्यूकिन-1 रिसेप्टर (टीआईआर) डोमेन का उपयोग करके प्रोटीन इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल है । विधि में वेक्टर निर्माण, प्रोटीन अभिव्यक्ति की कृषि घुसपैठ, बायोटिन उपचार, प्रोटीन निष्कर्षण और डिसाल्टिंग, क्वांटिफिकेशन और आत्मीयता शुद्धिकरण द्वारा बायोटिनेटेड प्रोटीन के संवर्धन का वर्णन किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को निकोटियाना और अन्य पौधों की प्रजातियों में रुचि के अन्य प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रतिनिधि डेटा, जो वर्णित प्रोटोकॉल के आधार पर अपेक्षित परिणामों को दर्शाते हैं, झांग एट अल11से अनुकूलित हैं । चित्रा 1 एन बेंथमियानामें टर्बोआईडी आधारित पीएल प्रदर्शन के लिए प्...

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TurboID-Based Proximity Labeling for In Planta Identification of Protein-Protein Interaction Networks

यहां वर्णित निकोतियाना बेंथमियाना पत्ती ऊतक में एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर के टीआईआर डोमेन के इंटरैक्शन पार्टनर्स की पहचान के लिए एक निकटता लेबलिंग विधि है। निकोतियाना और अन्य पौधों की प्रजातियों में इस तकनीक का उपयोग करके ब्याज के अन्य प्रोटीन के बीच बातचीत की पहचान के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल भी प्रदान किया गया है।

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन नेटवर्क की प्लांटा पहचान में टर्बोआईडी-आधारित निकटता लेबलिंग

Proximity labeling (PL) techniques using engineered ascorbate peroxidase (APEX) or Escherichia coli biotin ligase BirA (known as BioID) have been ...

एनएलआर प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स विभिन्न रोगजनकों के खिलाफ संयंत्र रक्षा मध्यस्थता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हम टोल/इंटरल्यूकिन-1 रिसेप्टर डोमेन के इंटरप्लेस भागीदारों की पहचान के लिए टर्बोड आधारित निकटता लेबलिंग विधि का वर्णन करते हैं जिसमें एनएलआरएस जैसे निकोटियाना बेंथामियाना संयंत्रों में प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स होते हैं । यह प्रोटोकॉल अन्य पौधों की प्रजातियों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण संदर्भ प्रदान करता है और इसे निकोटियाना बेंथामियाना में रुचि के किसी भी प्रोटीन तक बढ़ाया जा सकता है।टर्बोआईडी आधारित निकटता लेबलिंग दृष्टिकोण का पारंपरिक दृष्टिकोणों पर एक अलग लाभ है क्योंकि इसका उपयोग वीवो में क्षणिक या कमजोर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन को कैप्चर करने के लिए किया जा सकता है। उच्च घनत्व पर गीली मिट्टी में एन बेंथामियाना बीज उगाकर शुरू करें। उन्हें 18 घंटे की रोशनी और आठ घंटे की डार्क फोटो पीरियड के साथ जलवायु कक्ष में 23 से 25 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें ।पौधों को लगभग चार सप्ताह तक कक्ष में रखें जब तक कि वे बाद में कृषि के लिए चार से आठ के पत्ते के चरण तक न बढ़ें। टर्बोआईडी संलयन का निर्माण करें और प्लाज्मिड को एग्रोबैक्टीरियम टमेफैपियंस सक्षम कोशिकाओं में बदल दें जैसा कि टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित है। पूरी तरह से परिपक्व एन बेंथामियाना पत्तियों के अक्षांत एपिडर्मिस के इनोकुलम में घुसपैठ करने के लिए एक मिलीलीटर सुईलेस सिरिंज का उपयोग करें।छानने के बाद 36 घंटे में, पत्तियों में 200 माइक्रोमोलर बायोटिन में घुसपैठ करें और पत्तियों के ऊतकों की कटाई से पहले अतिरिक्त तीन से 12 घंटे के लिए पौधे को बनाए रखें। पत्ती का नमूना एकत्र करने के लिए, पेटियोल के आधार पर घुसपैठ की पत्तियों को काटें, पत्तियों की नस को हटा दें, और तरल नाइट्रोजन में ऊतक को फ्लैश करें। पत्ती के ऊतकों को मूसल और मोर्टार के साथ पीसें और पाउडर को 15 या 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों में शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।कुल प्रोटीन निकालने के लिए, एक दो मिलीलीटर ट्यूब में लगभग 0.35 ग्राम पत्ती पाउडर स्थानांतरित करें। इस प्रक्रिया के दौरान तरल नाइट्रोजन में कम तापमान पर ऊतक को बनाए रखना सुनिश्चित करें। पाउडर में रिपा लाइसिस बफर के 700 माइक्रोलीटर जोड़ें।भंवर ट्यूब 10 मिनट के लिए और 30 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना छोड़ दें, ट्यूबों को उलटा करके हर चार से पांच मिनट में सामग्री को मिलाकर। 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 20, 000 बार जी पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र । इसके बाद सुपरनिटेंट इकट्ठा करें।डिसल्टिंग कॉलम के जरिए सैंपल चलाकर फ्री बायोटिन निकालें। कॉलम के नीचे सीलर निकालें और इसे 50 मिलीलीटर ट्यूब में रखें। फिर टोपी को ढीला करें और कॉलम को 1, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें।एक ताजा 50 मिलीलीटर ट्यूब में डीसल्टिंग कॉलम रखें और कॉलम को तीन बार रिपा लाइसिस बफर के पांच मिलीलीटर के साथ बराबर रखें। इसे 1, 000 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर दो मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें और प्रवाह को हर बार त्याग दें। समतुल्य कॉलम में राल के शीर्ष पर 1.5 मिलीलीटर प्रोटीन निकालें जोड़ें।और जब अर्क राल में प्रवेश करती है, तो रिपा लाइसिस बफर के एक और 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। दो मिनट के लिए कॉलम अपकेंद्रित्र और आगे का उपयोग करने तक बर्फ पर desalted नमूनों छोड़ दें । डिसाल्टेड प्रोटीन अर्क की मात्रा निर्धारित करने के लिए, बायो-रेड स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके OD595 को मापें।ढाल बीएसए समाधान के मूल्य के आधार पर मानक वक्र ड्रा और desalted प्रोटीन नमूनों की एकाग्रता की गणना। कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए रिपा लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर के साथ स्ट्रेप्टाविडिन C1 संयुग्मित चुंबकीय मोतियों को बराबर करें। तीन मिनट के लिए मोतियों को अवशोषित करने के लिए चुंबकीय रैक का उपयोग करें और धीरे से समाधान को aspirate।फिर एक बार और धोएं। प्रोटीन निकालने को समतुलित चुंबकीय मोतियों में स्थानांतरित करें और प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए एक रोटेटर पर रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। अगले दिन, एक चुंबकीय रैक के साथ मोतियों पर कब्जा करें और सुपरनेट को एस्पिरेट करें।इसके बाद, मोतियों को 1.7 मिलीलीटर धोने वाले बफर के साथ इसे ट्यूब में जोड़कर धोएं और इसे आठ मिनट के लिए रोटर पर इनक्यूबेट करें। पहले वर्णित सुपरनेट को हटा दें और 1.7 मिलीलीटर वॉश बफर टू के साथ धोएं और बफर थ्री धोएं। डिटर्जेंट को हटाने के लिए 50 मिलीमोलर ट्राइस एचसीएल के 1.7 मिलीलीटर जोड़ें।इसके बाद ट्यूब को मैग्नेटिक रैक पर रखें और सुपरनेट निकाल दें। 50 मिलीमोलर ट्राइस एचसीएल के एक मिलीलीटर के साथ धो दोहराएं और मोतियों को एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। अंत में, मोतियों को 50 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट बफर के साथ पांच मिनट प्रति वॉश के लिए छह बार धोएं।बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन के संवर्धन की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए मोतियों के 100 माइक्रोलीटर का उपयोग करें और शेष नमूने को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए फ्लैश फ्रीज करें। पश्चिमी ब्लॉट्स का उपयोग एग्रोइनफिलट्रेल्ड एन बेंथामियाना पत्तियों में प्रोटीन अभिव्यक्ति और बायोटिनाइलेशन का विश्लेषण करने के लिए किया जाता था। घुसपैठ की पत्तियों में बायोटिनाइलेटेड प्रोटीन को बाद में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए स्ट्रेप्टाविडिन C1 संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ कुशलतापूर्वक समृद्ध किया गया था।विभिन्न आकारों के साथ विभिन्न प्रोटीन पर कब्जा कर लिया गया और समृद्ध प्रोटीन के पश्चिमी दाग विश्लेषण गंदा बैंड दिखाया । इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, कृपया डेसालिंग कॉलम के तल पर सीलर को हटाना याद रखें और प्रत्येक अपकेंद्रित्र से पहले टोपियां ढीला करें। यह प्रोटोकॉल निकोटियाना बेंथामियाना में रुचि के अन्य प्रोटीन के लिए आसानी से अनुकूलनीय है और इसका उपयोग अन्य पौधों की प्रजातियों में टर्बोआईडी पीएल का विस्तार करने के लिए भी किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

पोलियो वायरस की पहचान के लिए कण समूहन विधि

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

विदारक एक मॉडल Herpesvirus की lytic प्रतिकृति में सहभागिता होस्ट वायरस

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Visualizing Dengue Virus through Alexa Fluor Labeling

एलेक्सा Fluor लेबल के माध्यम से डेंगू वायरस Visualizing

The early events in the interaction between virus and cell can have profound influence on the outcome of infection. Determining the factors 
that ...

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

भ्रूण चूहों में vasculature लेबल के लिए एक विधि

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

मेजबान पैथोजन प्रोटीन से प्रोटीन सहभागिता के लैंडस्केप विशेषताएँ एक तुलनात्मक दृष्टिकोण

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

Bluetongue वायरस के खिलाफ उपन्यास antivirals की पहचान के लिए assays

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

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Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

अलगाव, पहचान, और murine Thymic उपकला कोशिकाओं के शोधन

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Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

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Planta में प्रोटीन में Plasmodesmal स्थानीयकरण अनुक्रम की पहचान

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Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes

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फ़ैगोसाइट में Intracellular प्रतिकृतिकरण के लिए माइकोबैक्टीरियम abscessus के डाह मार्करों की पहचान

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